全 文 ：[文章编号 ] 1000-4718(2008)06-1074-04
[收稿日期 ] 2006-12-31 [修回日期 ] 2007-11-25
＊[基金项目 ]教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.39730210);山东省自然科学基金资助项目(No.Q2004C03)
■通讯作者 E-mail:huweicheng@sdu.edu.cn
半边莲生物碱缓解肾性高血压大鼠的血管重塑＊
张晓玲 , 薛 冰 , 李 莉 , 陈 融 , 张永欢 , 李瑞峰 , 胡维诚■
(山东大学医学院病理生理教研室 , 山东 济南 250012)
[摘 要 ] 目的:探讨半边莲生物碱对肾性高血压大鼠主动脉血管重塑的影响。方法:制备两肾一夹
(2K1C)肾性高血压大鼠模型 , 灌服半边莲生物碱或卡托普利 8周 , 用放射免疫技术测定血浆肾素活性(plasmaren-
ninactivity, PRA)。用 Weigert法染色并测量腹主动脉中膜厚度及中膜截面积等血管重塑形态学参数。分别用
Masson三色法和免疫组化方法测腹主动脉总胶原蛋白含量和Ⅰ型胶原蛋白含量。结果:高血压大鼠与假手术组
相比 PRA明显升高(P<0.05), 使用半边莲生物碱后 PRA显著降低(P<0.05);卡托普利对 PRA无明显影响。高
血压大鼠中膜厚度 、中膜厚度 /血管内径 、中膜面积和腹主动脉胶原含量与假手术组相比明显升高(P<0.05);半
边莲和卡托普利均可使高血压组大鼠上述指标显著降低(P<0.05)。结论:肾性高血压大鼠存在血管重塑现象 ,
半边莲生物碱能抑制胶原的表达 、降低肾素活性 , 对缓解血管重塑有一定作用。
[关键词 ] 半边莲属;胶原;高血压 , 肾性;血管重建
[中图分类号 ] R363 [文献标识码 ] A
Chinensislouralkaloidsaleviatesvascularremodelinginrenalhyperten-
siverats
ZHANGXiao-ling, XUEBing, LILi, CHENRong, ZHANGYong-huan, LIRui-
feng, HUWei-cheng
(DepartmentofPathophysiology, SchoolofMedicine, ShandongUniversity, Jinan250012, China.E-mail:huweicheng@
sdu.edu.cn)
[ ABSTRACT] AIM:Toinvestigatetheefectoflobeliachinensislouralkaloids(LCLAs)onvascularremodeling
inrenalhypertension.METHODS:TheGlodblattrenovascularhypertensionmodelwasinducedinratsbytwo-kidneyone
clipmethod.Thereninactivity(PRA)inplasmawasdeterminedbyradioimmunoassay8 weeksafterthetreatmentswith
LCLAsorcatoprill.Theparametersofvascularremodeling, includingmediathickness(MT), luminalinternaldiameter
(LD), ratioofMT/LDandratioofmediacross-sectionalareatolumenarea(MSCA/LA)weremeasuredthroughthe
Weigertstainingphotosoftheabdominalaorta.ExpressionsofcollagenandcolagenIweremeasuredrespectivelybythe
methodsofMassonstainingandimmunohistochemistry.RESULTS:ThePRAwassignificantlyincreasedinhypertensive
ratscomparedwiththeshamrats(P<0.05).PRAwassignificantlyreducedinLCLAsgroupcomparedtocontrolgroup.
NoinhibitoryefectonPRAwasobservedincaptoprilgroup.TheMT, theratioofMT/LD, MSCAandtheexpressionof
colagenonabdominalaortaweresignificantlyincreasedinhypertensiveratscomparedwiththeshamrats(P<0.05).
LCLAsandcaptoprilreducedtheseparametersraisedinhypertensiverats(P<0.05).CONCLUSION:Thevascularre-
modelingoccursinrenalhypertensiverats.LCLAinhibitsthesynthesisofthecolagenandreducesPRA, whichmayalevi-
atethevascularremodelinginhypertensiverats.
[ KEYWORDS] Lobelia;Collagen;Hypertension, renal;Vascularremodeling
血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecels,
VSMCs)的增殖和合成增加引起的血管重塑 ,以及内
皮依赖性舒血管功能障碍是形成高血压病的重要机
制 [ 1] 。对高血压治疗不应该仅局限于降低血压 ,还
应该强调逆转心肌肥厚和血管重塑 ,保护靶器官免
受损害 [ 2] 。近年来发现抗蛇毒中药半边莲生物碱有
·1074· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2008, 24(6):1074-1077
抑制高脂血症大鼠 VSMCs增殖的作用[ 3] , 本实验通
过建立肾血管性高血压大鼠模型 ,观察半边莲生物
碱对肾性高血压血管重塑的影响。
材 料 和 方 法
1 药品与试剂
半边莲生物碱(lobeliachinensislouralkaloids,
LCLAs)由山东大学药学院天然药物化学教研室制
备 。将 LCLAs溶于二甲基亚砜 (DMSO)中 ,用蒸馏
水稀释 ,并配成浓度为 500 mg/L, DMSO的最终浓度
小于 0.01%。卡托普利(captopril)购于山东新华制
药有限公司 ,批号为 0111008;兔抗大鼠 ColⅠ Ⅰ抗 ,
购于武汉博士德公司;生物素标记山羊抗兔 Ⅱ抗 ,购
于北京中山公司 。
2 动物与分组
雄性 Wistar大鼠 50只 ,体重 200-240g,由山东
省实验动物中心提供 。 40只用两肾一夹(2K1C)法
制备肾性高血压模型 [ 4] 。术后 4周 ,尾动脉血压≥
140mmHg者选入本研究 ,随机分为高血压 、半边莲
和卡托普利治疗组 ,每组各 9只。另取 9只大鼠为
假手术组。术后 4周 ,高血压组 、假手术组生理盐水
每日灌胃5 mL/kg;半边莲组每日半边莲生物碱(500
mg/L, 5 mL/kg)灌胃;用药剂量根据本室前期工作
经验确定。卡托普利组每日灌胃 30mg/kg。连续灌
胃 8周 。
3 测定指标与方法
3.1 血压测定 应用尾袖法连接 RBP-1B型大鼠
血压计(中日友好临床医学研究所)。测量给药前后
清醒大鼠尾动脉收缩压的变化 。测压时保持大鼠尾
部温度适宜(间断加温 ,以大鼠保持安静和尾动脉有
搏动信号为度)。
3.2 血浆肾素检测 术后 8周 ,断尾取血 2 mL,迅
速注入放在冰水浴中冷却的含酶抑制剂的抗凝管
中 ,摇匀 , 4 ℃ 1 000r/min离心 5 min,取上清液 ,送
齐鲁医院放免检测血浆肾素的含量。
3.3 血管重塑形态学参数的测量 将摘取的腹主
动脉进行石蜡包埋时 ,动脉纵轴与模具的刀面保持
垂直 ,以使动脉的横切面处于标准位 ,每条动脉切 5
个横切面 ,石蜡切片厚 4 μm行 Weigert氏 (间苯二
酚复红)染弹力纤维 ,使用 Imagepro-plus5.1.0软
件进行分析 。在统一放大 10×4倍的显微镜下 ,测
量腹主动脉血管中膜厚度(MT, mediathickness);血
管内径(LD, luminalinternaldiameter),按顺时针方向
测 12个值取其均值[ 5] ;血管中膜厚度 /血管内径
(MT/LD);中膜面积 /内腔面积(MSCA/LA;MCSA:
mediacross-sectionalarea;LA:lumenarea)。
3.4 胶原定性及半定量分析 石蜡切片行 Masson
氏三色法染动脉胶原(胶原纤维呈绿色 、平滑肌细胞
呈红色 、细胞核为蓝色)。每张切片采图 5张 ,用 Im-
agePro-Plus5.1.0系统软件进行图像分析 ,计算
胶原面积与统计场总面积比值 。
3.5 Ⅰ型胶原(ColⅠ)免疫组织化学染色方法(SP
法) 石蜡切片常规脱蜡水化 ,用 3% H2O2封闭内
源性过氧化物酶 。正常山羊血清封闭液室温封闭 20
min后 ,加兔抗大鼠 ColⅠ Ⅰ抗 , 4℃冰箱过夜;再加
生物素标记的山羊抗兔 Ⅱ抗 , 37 ℃孵育 30 min;
DAB显色液镜下观察显色;苏木素复染 2 min,自来
水冲洗 ,常规脱水 、透明 、封片 。同时用 PBS取代
Ⅰ抗为阴性对照。棕黄色反应产物代表抗原的定
位 ,着色部位在细胞外基质。免疫组织化学图像分
析经标准灰度校正后 ,区分胶原与非胶原部分 ,随机
取 5个视野(10 ×40倍)计算胶原面积与统计场总
面积比值。
4 统计学处理
实验数据以均数 ±标准差( x±s)表示 。 2组资
料比较采用非配对 t检验 ,多组资料比较采用 One-
wayANOVA统计方法进行分析 ,组间比较采用 q检
验 。应用 SPSS统计软件进行统计学处理。
结 果
1 尾动脉血压的变化
给药前 ,高血压组 、半边莲组及卡托普利组血压
均明显高于假手术组 。高血压组用生理盐水 4周
(P<0.05)、8周(P<0.01)后血压继续升高;半边莲
组血压明显低于高血压组 (4周 P<0.05, 8周
P<0.01);卡托普利组 4周 、8周血压明显低于用药
前 、半边莲组及高血压组(P<0.01),见表 1 。
表 1 各组大鼠尾动脉血压的变化
Tab1 Thechangesofbloodpressureineachgroup(mmHg.
x±s.n=9)
Group Beforetreatment
Aftertreatment
1week 4weeks 8weeks
Sham 116±5d 115±6d 115±5d 112±3d
Hypertension 151±13 160±13 168±20a 175±6b
Hypertension+LCLAs 154±4 146±3 152±9c 151±11d
Hypertension+captopril 156±14 142±3a 122±10d 122±3d
aP<0.05, bP<0.01 vssham;cP<0.05, dP<0.01 vshyperten-
sion.
2 半边莲生物碱对肾性高血压大鼠血浆肾素的影响
术后 8周 , 2K1C高血压大鼠血浆肾素活性
·1075·
(PRA)显著高于假手术组(P<0.05);半边莲治疗组
PRA升高显著缓解 ,但仍高于假手术组 (P<0.05),
见表 2。
表 2 各组血浆中肾素活性的变化
Tab2 ThechangesofPRAineachgroup(μg· L-1· h-1.
x±s.n=9)
Group Sham Hypertension Hypertension+LCLAs
Hypertension+
captopril
PRA 3.31±3.14 13.70±2.28# 9.00±3.18#＊ 10.24±2.73#
#P<0.05 vssham;＊P<0.05vshypertension.PRA:plasmarenin
activity.
3 血管重塑形态学参数的变化
高血压组管壁厚度与管径之比(WT/LD)和管壁
面积与管腔面积比值(MSCA/CA)高于假手术组(P
<0.05),其血管直径小于假手术组(P<0.05);半边
莲生物碱和卡托普利治疗后 ,管壁厚度与管径之比
(WT/LD)和管壁面积与管腔面积比值(MSCA/CA)
均低于高血压组 (P<0.05),管壁厚度与管径之比
(WT/LD)高于假手术组(P<0.05),见表 3。
表 3 各组血管重塑形态学参数的变化
Tab3 Thechangesofmorphologicalparametersofaortaremode-
ling( x±s.n=9)
Group MT(μm) LD(μm) MT/LD MSCA/LA
Sham 63.5 ±11.4 1 236±25 0.051±0.007 0.23±0.04
Hypertension 96.2 ±18.2# 1 045±16# 0.092±0.009# 0.68±0.04#
Hypertension+LCLAs 81.4 ±15.0＊# 1 213 ±17＊ 0.067±0.008＊# 0.26±0.05＊
Hypertension+captopril 75.5 ±13.1＊# 1 214 ±19＊ 0.063±0.005＊# 0.24±0.02＊
#P<0.05 vssham;＊P<0.05vshypertension.MT:mediathickness;LD:luminalinternaldi-
ameter;MSCA:mediacross-sectionalarea;LA:lumenarea.
4 腹主动脉胶原蛋白表达的变化
4.1 Mason染色结果 高血压组中膜平滑肌束间见
大量绿色的胶原纤维增生 ,其内膜以及外膜中几乎
都是绿色的胶原纤维 。假手术组平滑肌细胞间极少
见绿色的胶原纤维。经半边莲和卡托普利治疗后平
滑肌束间胶原纤维明显减少 ,见图 1。
4.2 免疫组化结果 高血压组中 Ⅰ型胶原的表达
显著增加 ,并且呈现斑片状;在肌束间及肌细胞间均
可见其表达 ,其外膜表达明显。 Ⅰ型胶原在假手术
组平滑肌细胞间极少表达 ,经半边莲和卡托普利治
疗后 ,血管平滑肌束间胶原纤维明显减少 ,见图 2。
高血压各组胶原面积与统计场总面积比值高于假手
术组(P<0.05),半边莲治疗组和卡托普利治疗组胶
原面积与统计场总面积比值低于高血压组 (P<
0.05), 见表 4。
表 4 各组腹主动脉胶原蛋白表达的变化
Tab4 Thechangesofcollagenexpressioninabdominalaortaof
eachgroup( x±s.n=9)
Group Sham Hypertension
Hypertension+
LCLAs
Hypertension+
captopril
Immunohistochemistry 0.17±0.04 0.49±0.08# 0.30±0.21#＊ 0.26 ±0.17#＊
Masson′sstaining 0.16±0.09 0.51±0.13# 0.26±0.13#＊ 0.27 ±0.06#＊
#P<0.05 vssham;＊P<0.05 vshypertension.
·1076·
讨 论
血管重塑结构变化包括血管平滑肌细胞
(VSMCs)增殖 、迁移及细胞外基质合成增加。依据
管腔直径变小 、变大或不变分别称之为内向性重塑 、
外向性重塑或代偿性重塑 [ 6] 。本实验发现 , 2K1C肾
性高血压大鼠腹主动脉血管壁表现明显的增厚 ,基
质增多 ,管腔直径变小 ,血管壁发生内向性重塑 。免
疫组化和 Masson染色均提示高血压组大鼠主动脉
壁作为主要胶原成分的Ⅰ型胶原含量明显高于假手
术组 ,表明该模型存在细胞外基质 (ECM)合成
增多。
PRA检测结果显示 2K1C大鼠血浆肾素活性显
著增强 ,半边莲与卡托普利治疗组 PRA均显著低于
高血压组。提示肾动脉狭窄后 ,由于肾血流量减少 ,
RAS系统激活;卡托普利与半边莲生物碱均能抑制
PRA,进而抑制 RAS系统 ,减轻血管平滑肌增生及血
管纤维化[ 7] 。
研究表明 ,血管紧张素 Ⅱ可促进内皮素(ET)的
生成[ 8] , ET-1也可增加血管紧张素 Ⅱ的生成 [ 9] 。
另外 ,两肾一夹肾性高血压大鼠血浆中 ET-1mRNA
表达增加[ 10] 。提示 ET与血管紧张素 Ⅱ可能相互协
同 ,共同参与了肾性高血压的发病。 ET与自然界存
在的某些生物毒素(例如蛇毒 、蝎毒和蜂毒)有一定
亲缘关系[ 11] 。半边莲为清热解毒中药 ,实验证明半
边莲生物碱有抑制 ET合成释放作用 [ 3, 12] 。本研究
提示 , 半边莲生物碱可能通过抑制 ET, 进而抑制
PRA。
在血管重塑的研究中 ,人们较多地关注小动脉
及微动脉等阻力动脉 ,大动脉则被认为是一种低阻
力系统 ,在血压的调节中不被重视。本实验结果显
示 ,两肾一夹肾性高血压大鼠的主动脉有明显的改
建 ,该种大动脉的重塑除了平滑肌细胞的改变外 ,胶
原纤维和弹性纤维在血管壁的分布也存在明显的异
常 ,提示大动脉壁的重塑 ,尤其是胶原纤维的增加对
大动脉功能及血压升高的影响不可忽视。另外 ,本
研究显示 ,拮抗 ET-1合成与释放的中药半边莲生
物碱除了有一定程度的降低血压作用外 ,也具有明
显的抑制大动脉重塑和降低肾素活性作用 。
[参 考 文 献 ]
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