全 文 ：[ 文章编号] 　1007-3949(2006)14-02-0107-04 ·实验研究·
半边莲生物碱抑制内皮素诱导的大鼠主动脉
平滑肌细胞增殖
王婧婧1 , 范秀珍2 , 刘尚明1 , 魏欣冰1 , 任冬梅3 , 陈 融1 , 李 莉1 , 胡维诚1
(山东大学 1.医学院;2.护理学院;3.药学院 ,山东省济南市 250012)
[ 关键词] 　病理学与病理生理学;　半边莲生物碱对血管平滑肌细胞增殖的影响;　免疫细胞化学;　半边莲生物
碱;　内皮素;　增殖细胞核抗原;　增殖
[ 摘　要] 　目的　研究半边莲生物碱对内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用。方法　用内皮素 1 剌激大鼠
主动脉平滑肌细胞增殖 ,以细胞计数试剂盒计数细胞个数 、氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入检测 DNA的合成量 、免疫细
胞化学技术观察增殖细胞核抗原的表达活性作为细胞增殖的指标 , 并应用台盼兰拒染 、乳酸脱氢酶检测观察半边
莲生物碱的细胞毒性反应。结果　内皮素 1(10-7mol/ L)可明显促进细胞增殖(与对照组相比 , P<0.01);半边莲生
物碱和 BQ-123 均可抑制内皮素 1所诱导的细胞增殖(与内皮素 1组相比 , P<0.05);半边莲生物碱的抑制作用与浓
度存在明显的依赖关系 ,但对活细胞数目和乳酸脱氢酶释放量均没有影响(P>0.05)。结论　半边莲生物碱(50 ～
200 mg/ L)可浓度依赖性地抑制内皮素 1 所诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖 , 且此抑制作用并非是通过细胞毒性
作用实现的。
[ 中图分类号] 　R363 [ 文献标识码] 　A
Lobelia Chinensis Lour Alkaloids Inhibiting Rat Aortic Vascular SmoothMuscle Cell Pro-
liferation Induced by Endothelin
WANG Jing-Jing1 , FAN Xiu-Zhen2 , LIU Shang-Ming1 , WEI Xin-Bing1 , REN Dong-Mei3 , CHEN Rong1 , LI Li1 , and HU Wei-
Cheng1
(1.School of Medicine;2.School of Nursing;3.School of Pharmaceutical Sciences , Shandong University , Jinan 250012 , China)
[ KEY WORDS] 　Lobelia Chinensis Lour;　Aortic Vascular Smooth Muscle Cell;　Endothelin;　Proliferating Cell Nuclear
Antigen;　Proliferation;　Rat
[ ABSTRACT] 　　Aim　To determine the effect of scutel laria barbata alkaloid (LCLAs)on proliferation of cultured vascular
smooth muscle cell(VSMC)induced by endothelin(ET).　　Methods　Rat aortic VSMC was cultured and divided into four
groups:ET group , ET+LCLAs group , ET+BQ-123 (the selective ETA receptor antagonist)group and control group , then the
cell proliferation activity was subsequently quantified by cell counting kit-8 to count cell number , 3H-TdR incorporation to measure
DNA synthesis and quantitative immunohistochemical technique to investigate the expression of proliferating cell nuclear antigen
(PCNA)in VSMC.　Cytotoxicity was measured by Lactate Dehydrogenase(LDH)colorimetry and Trypan blue exclusion tests.　
　Results　Compared with the control group , ET-1(10-7mol/ L)significantly enhanced the proliferation activity of VSMC(P<0.
01), 50 mg/ L LCLAs inhibited the increase of cell number(6.01±0.05 , P <0.05) and 3H-TdR incorporation(1 464±45
counts/ min , P<0.05)compared with ET group , but has no evident effect on the proliferation activity of PCNA.　100 , 200 mg/
L LCLAs and 10-6mol/L BQ-123 markedly decrease the cell number(5.73±0.09 , 4.81±0.08 , 4.77±0.06 , respectively), 3
H-TdR incorporation(1 263±41 , 1 129±49 , 1 140±56 counts/ min , respectively)and the expression of PCNA(350±29 , 341
±53 , 336±39 , respectively)compared with ET group(P<0.01).　　Conclusions　LCLAs(50～ 200 mg/ L)inhibited ET-1-
induced proliferation of VSMC in a dose-dependent manner and the effect was not due to nonspecific cytotoxicity.
[收稿日期] 　2005-04-11　　　　[ 修回日期] 　2005-12-01
[基金项目] 　教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
(No.39730210)和山东省自然科学基金资助项目(No.Q2004C03)
[作者简介] 　王婧婧 ,博士研究生 ,研究方向为心血管病理生理学 ,
E-mail为 imsherry@163.com。范秀珍 ,博士研究生 ,副教授 ,硕士研究
生导师。通讯作者胡维诚 ,教授 ,博士研究生导师 , 主要研究方向为
心血管病理生理学 ,联系电话为 0531-8382044, E-mail 为 huweicheng@
sdu.edu.cn。
　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell ,
VSMC)的异常增殖是高血压 、冠状动脉硬化和经皮
腔内冠状动脉成形术后再狭窄等疾病的共同病理基
础 。VSMC的增殖受多种神经内分泌因子的调节 ,
其中内皮素 1(endothelin-1)作为一种强烈的促有丝
分裂原 ,能促进 VSMC 分裂和增殖。本实验室发现
含有半边莲的清热解毒液可以使高脂血症大鼠内皮
细胞合成和释放内皮素 1减少[ 1] ,并进而发现半边
莲生物碱(scutel laria barbata lkaloid , LCLA)可显著降
低高脂血症大鼠血清内皮素 1含量和抑制主动脉中
膜平滑肌细胞增殖[ 2] 。本研究建立内皮素 1剌激的
107CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2006年第 14卷第 2期
大鼠主动脉平滑肌细胞增殖模型 ,观察半边莲生物
碱对VSMC增殖的影响。
1　材料和方法
1.1　材料与试剂
SD大鼠购自山东大学医学院实验动物中心;
内皮素 1 、BQ-123 、台盼兰和二甲基亚枫(DMSO)等
购自 Sigma 公司;DMEM 、胰蛋白酶和新生小牛血清
(NCS)等购自 Gibco 公司;氚标胸腺嘧啶脱氧核苷
(trituum-labelled thymidine , 3H-TdR)购自中国原子能
研究所;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8)购自日
本株式会社同仁化学研究所;α-actin 、增殖细胞核抗
原(proliferating cell nuclear antigen ,PCNA)单克隆抗体
和免疫组织化学 SP 试剂盒购于福州迈新生物技术
公司 ,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase , LDH)测试
盒购自南京建成生物工程研究所;其他试剂均为进
口或国产分析纯 。
1.2　半边莲生物碱的制备
由山东大学药学院天然药物化学教研室提供 。
半边莲产自广东省 ,将半边莲药材粉碎 ,粗粉置索氏
提取器中 , 加入约 5 倍量 95%乙醇(含适量浓盐
酸),水浴加热提取 2 h ,过滤 ,滤液减压浓缩得流浸
膏;流浸膏加适量热水混悬 ,冷却后用乙醚多次萃
取 ,得到水溶液用浓氨水调 pH 值至 8 ～ 9后乙醚多
次萃取 ,乙醚液加入无水硫酸钠放置过夜 ,过滤 ,回
收溶剂得黄色油状物 ,再加入 1 mol/L 盐酸将此油
状物溶解 , 过滤 , 浓缩 , 于冰箱中静置过夜 , 析出
LCLA结晶。将 LCLA溶于 DMSO中 ,并以条件培养
基(含 0.2 %NCS 的DMEM培养基)配成所需浓度 ,
DMSO的最终浓度均小于 0.01%。
1.3　大鼠主动脉平滑肌细胞培养及鉴定
组织块贴壁法进行VSMC 培养 。倒置显微镜和
α-actin免疫组织化学染色阳性证实为 VSMC ,纯度>
95%。待细胞生长汇合出现“峰与谷”结构后 ,用含
0.25%胰蛋白酶消化液消化 、传代培养。选 3 ～ 8代
细胞用于实验。
1.4　细胞计数[ 3]
按细胞密度 0.4×108/L 将 VSMC 接种于 96孔
培养板 ,每孔 0.1 mL ,细胞生长至次汇合状态时 ,更
换无血清 DMEM 饥饿培养 24 h , 使细胞同步化于
G0/G1 期 。根据不同的实验分组加药:①对照组加
0.2%NCS 的条件培养基;②内皮素组加内皮素 1
终浓度为 10-7mol/L 的条件培养基;③内皮素 +
LCLA组加内皮素 1(10-7mol/L)和不同剂量的 LCLAs
(终浓度为50 、100 、200mg/L);④内皮素+BQ-123组
加内皮素(10-7mol/L)和 BQ-123 (10-6mol/L)的条件
培养基;孵育 24 h 后参照细胞计数试剂盒(cell
counting kit-8)说明书在酶标仪 450 nm 波长处读取
各孔吸光度值(absorbance , A),其数值大小与细胞
的数目成正比。
1.5　氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入
将VSMC消化分离制成细胞悬液 ,调整密度为 5
×107/L 种入 24 孔培养板 ,按以上实验分组及给药
方案对细胞处理后 ,继续孵育 18 h ,向各孔培养基中
加入3H-TdR至终浓度为 0.1 Ci/ 100 L ,孵育 8 h ,加
入冷PBS 液终止反应。回收细胞 ,液体闪烁计数仪
行放射活性计数测定。
1.6　免疫细胞化学染色
血管平滑肌细胞消化传代至 6 孔培养板上(板
内预先置入 1 cm2消毒盖玻片),实验分组及给药方
案同上 ,取出盖玻片 ,按照免疫组织化学试剂盒步骤
检测增殖细胞核抗原的表达 。采用SimplePCI(Com-
pix , Inc.)图像分析系统对各组免疫细胞化学结果
进行图像分析 , 所有玻片均在同一放大倍数(×
200)、同一光强度下分析。每组细胞各取 5张玻片 ,
每张玻片随机抽取 3个视野 ,计算出阳性反应细胞
的平均吸光度值(average absorbance , A),以上数据
均由图像分析系统自动计算 ,定量细胞中 PCNA表
达水平的高低。
1.7　不同浓度半边莲生物碱的细胞毒性实验
细胞接种于 96 孔培养板内 , 在不同浓度(0 、
50 、100和 200 mg/L)的 LCLAS 溶液中孵育 24 h ,观
察细胞的毒性反应(变性 、坏死 、脱落),台盼蓝染色
排斥实验计算细胞存活率 ,并按乳酸脱氢酶测试盒
说明用紫外分光光度计测定乳酸脱氢酶释放量 。
1.8　统计学处理
检测结果均以 x ± s 表示 , 统计学分析用
SPSS12.0软件进行单因素方差分析(one-way ANO-
VA),多样本均数之间两两比较采用 q 检验。 P <
0.05为差异有显著性。
2　结 果
2.1　血管平滑肌细胞鉴定
倒置相差显微镜下观察 ,细胞呈长梭形放射状
生长 , 细胞疏密相间 ,呈典型峰谷状排列。α-actin
SMC单克隆抗体免疫细胞化学检测 ,可见 90%细胞
胞浆中有大量与细胞长轴平行的细丝状棕褐色免疫
反应产物(图 1)。说明培养 VSMC纯度达到90%。
108 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 14 , No 2
图1.血管平滑肌细胞鉴定　　A为显微镜下所见 ,典型峰谷样
排列(×40), B为α-actin免疫细胞化学鉴定(×100)
2.2　各组药物对细胞增殖的影响
与对照组比较 ,内皮素 1(10-7 mol/L)可明显增
加VSMC增殖(P <0.01);10-6 mol/L BQ-123抑制内
皮素 1所诱导的 VSMC增殖(P <0.01);50 、 100和
200mg/L LCLA预孵育使内皮素 1诱导的细胞增殖
均下降(P <0.05 , P <0.01),并且 LCLA的抑制作
用呈剂量依赖性(表 1)。
2.3　各组药物对细胞 DNA合成量的影响
10-7mol/L内皮素 1使VSMC 3H-TdR掺入量明显
高于对照组(P <0.01), 10-6mol/L BQ-123 抑制内皮
素 1所诱导的 VSMC增殖(P<0.01);50 、100和 200
mg/L LCLA预孵育使内皮素 1诱导的 VSMC 3H-TdR
掺入量均下降(P <0.05 , P <0.01),并且 LCLA的
抑制作用呈剂量依赖性(表 1)。
表 1.实验各组药物对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响(x±s , n =5)
分　组 LCLAs浓度(mg/ L)
细胞数目
(A450 nm/ well)
氚标胸腺嘧啶掺入
(counts/min/well)
PCNA表达水平
(A)
对照组 3.69±0.11 1097±53 316±25
内皮素组 6.49±0.12a 1557±48a 419±34a
内皮素+LCLAs组 50 6.01±0.05b 1464±45b 396±68
100 5.73±0.09c 1263±41c 350±29c
200 4.81±0.08c 1129±49c 341±53c
内皮素+BQ-123组 4.77±0.06c 1140±56c 336±39c
　a 为 P<0.01, 与对照组比较;b为 P<0.05 , c 为 P<0.01 ,与内皮素 1组比较。
2.4　各组药物对增殖细胞核抗原表达活性的影响
增殖细胞核抗原的免疫阳性染色位于细胞核 ,
呈棕褐色 ,核着色深浅不一。图像分析结果为:内皮
素组VSMC中的 PCNA表达较对照组明显上调(P<
0.01),而内皮素+LCLA (100和 200 mg/L)组 、内皮
素+BQ-123(10-6mol/L)组均可下调 VSMC 中 PCNA
的表达活性(P <0.01),50 mg/L 的 LCLA对此没有
影响(表 1和图 2)。
2.5　不同浓度半边莲生物碱的细胞毒性反应
倒置显微镜下各浓度 LCLA组细胞生长良好 ,形
态正常 ,无细胞脱失区 ,无细胞碎片 。台盼蓝染色排
斥实验显示 ,各浓度组细胞存活率均大于 95%,上清
液LDH 差异无显著性(P>0.05)。结果表明 LCLA
抑制VSMC增殖不是非特异性细胞毒作用所致(表
2)。
3　讨 论
内皮素1不仅具有强大的缩血管作用 , 还是一
图 2.各组药物对增殖细胞核抗原表达活性的影响(×200)
　　A为对照组;B为内皮素组;C 为内皮素+100 mg/ L LCLA 组;D
为内皮素+BQ-123组。
109CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2006年第 14卷第 2期
表 2.不同浓度半边莲生物碱对细胞生存率和上清液乳酸脱
氢酶活性的影响(x±s , n=6)
分　组 LCLA 浓度(mg/ L)
细胞生存率
(%)
乳酸脱氢酶活性
(U/ L)
对照组 97.5±3.1 523±22
LCLAs组 50 98.8±2.8 530±20
100 97.4±5.2 518±36
200 97.1±3.9 522±39
种平滑肌细胞促有丝分裂原 , 能促进细胞增殖与
DNA合成[ 4] 。本文通过细胞计数试剂盒计数细胞个
数 、3H-TdR掺入检测细胞 DNA的合成量 、免疫细胞
化学染色观察 PCNA的表达活性方法证实了上述理
论。
内皮素只有与靶细胞膜上的内皮素受体(ETR)
结合后 ,启动一系列细胞内信号传递过程 ,方可实现
其生物学效应。内皮素受体(ETR)分为 ETAR、ETBR
和ETCR 3类 , 其中 ETAR主要分布于 VSMC , 对内
皮素 1有选择性亲和性 , 介导内皮素 1 对血管的收
缩和血管壁增殖的作用 , 在动脉粥样硬化等血管增
生性疾病的发生 、发展过程中起着重要的中介作
用[ 5] 。有报道 ,动脉粥样硬化和高血压患者血浆内
皮素 1的水平增高[ 6] ,在粥样硬化斑块中 ETAR表达
增高 ,本文结果发现 ,内皮素 1的上述促增殖作用能
完全被 ETAR 特异性阻断剂 BQ123 所阻断 ,说明内
皮素 1 的促 VSMC 增殖作用主要是由 ETAR 所介导
的。
内皮素与自然界存在的某些生物毒素有一定亲
缘关系[ 7] ,包括蛇毒 、蝎毒和蜂毒。SRTX 是从蛇毒
中提取的一种毒素 , 可分为 SRTX-a(S6a)、SRTX-b
(S6b)、SRTX-c(S6c)和 Btx (S6c)4个亚型 。对内皮素
的4种亚型进行氨基酸序列分析发现 ,所有这些异
构肽均包括21个氨基酸 ,其一级结构具有明显的同
源性 ,至少有 60%～ 80%氨基酸同源 ,而且有相同的
C-末端 。研究证实 ,内皮素的 C-末端特别是 Trp21 、
两个二硫键 、氨基和羧基端以及 Asp8和 Glu10的羧
酸组对它的生物学活性起了重要的作用 , 构成了
SRTX和内皮素表面的“共同和基本”的生物活性位
点[ 8] 。SRTX和内皮素构成一组同源性异构肽家族 ,
竞争性结合相同的 G 蛋白偶联受体 ,通过 IP3 、Ca2+
钙调蛋白激酶途径 ,引发各类生物学效应[ 9] ,因此从
抗蛇毒中药中探寻防治动脉粥样硬化和高血压等疾
病的方法是可行的。
近年来发现抗蛇毒中药在拮抗内皮素作用 、抑
制VSMC增殖和保护血管内皮细胞(vascular endothe-
lial cell ,VEC)功能及损伤修复方面 ,有着独到的作
用[ 10] 。LCLA为我国传统抗蛇毒中草药半边莲的有
效成分 ,本研究也证明它可呈浓度依赖性抑制内皮
素1所诱导的VSMC 增殖活性 ,使细胞数目和3H-TdR
掺入减少 ,PCNA蛋白表达减弱。说明 LCLA 具有抑
制VSMC增殖的作用 。
半边莲生物碱抑制内皮素 1所诱导的VSMC增
殖并非源自它的细胞毒性作用 ,因为用上述方法测
得用药后VSMC 的增殖活性 、3H-TdR掺入量和 PCNA
蛋白合成均比内皮素 1处理组显著降低 ,但台盼兰
染色和培养基上清中乳酸脱氢酶活力并无改变 ,后
者是反映细胞膜功能状况的一种重要指标 。因此可
以断定VSMC活性下降并非细胞坏死所致。
多年来用活血化瘀法和芳香温通法治疗动脉粥
样硬化性心脑血管病取得良好效果 。但尚未有用清
热解毒类中药防治心脑血管病的报道 ,本项研究首
次用离体细胞培养技术发现 LCLAs能够抑制 VSMC
增殖 ,提示该类中药有可能用于临床防治动脉粥样
硬化性心脑血管疾病 。
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(此文编辑　朱雯霞)
110 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 14 , No 2