全 文 ：山 东 大 学 学 报 !医 学 版
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第 !卷第 !期
#$$%年 !月
/56789 %57!
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文章编号#=>?=&?<<8@:;;$基金项目% 教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目*+,)++-./0山东省自然科学基金资助项目*1+)2,+3&$作者简介% 范秀珍!!(-4& ’女’副教授’博士研究生’研究方向#动脉粥样硬化的发病机制&
$通讯作者% 胡维诚!!()4& ’男’教授’博士生导师&$摘要% 目的#研究半边莲生物碱对内皮素诱导损伤的人血管内皮细胞的保护作用& 方法#常规提
取半边莲生物碱’培养人血管内皮细胞’56789法测定细胞培养上清中组织纤溶酶原激活物:%B;93和纤溶
酶原激活物抑制物B!*;97B!3的含量& 结果#内皮素组 ;97B!含量显著高于正常对照组!!<=!’%B;9含量
在数值上低于正常对照组’但无统计学意义&半边莲生物碱各组 ;97B!含量均低于内皮素组!!<=!’与
内皮素 >受体拮抗剂 >?.’’作用相似& 半边莲生物碱低剂量组 %B;9含量高于内皮素组!!<=!’高(中
剂量组 %B;9含量虽然有增高趋势’但无统计学意义& 结论#内皮素能够使人血管内皮细胞释放 ;97B! 增
加’半边莲生物碱通过抑制该效应而起到保护血管内皮细胞的作用&
$关键词% 半边莲生物碱)内皮素)内皮细胞)组织型纤溶酶原激活物)纤溶酶原激活物抑制物B!$中图分类号% @(.+=- !$文献标识码% 9 7ABCDEA$E FB 6FGECHI 2JHAEAKHK 6FDL ICMICFHNK FA BHGLHAFCOKHK KOK%EP FB
JDPIA QIK$DCIL EANF%JECHIC$ECCK %LEI%EN RH%J EANF%JECHA
S9T UHDBVJEA!0 W9TX YHAZB[HAZ+0 @5T \FAZBPEH,0 U79# 1HAZ)0 2]5T @FAZ+0 67 6H+0 ]^ WEHB$JEAZ+ :!= 8$JFFC FB TDLKHAZ) +=\E_IL%PEA% FB ;I%JF_JOKHFCFZO0 8$JFFC FB ‘ENH$HAE),=\E_IL%PEA% FB TI%DLIC
;JILPI$ED%H$IC 2JEPHK%LO0 8$JFFC FB ;JILPI$ED%H$IC 8$HEA$EK))= ‘FCE$DCIL ‘ENH$IC 6IGFLI%FLO0 8$JFFC FB ‘ENH$HAE0 8JIANFAZ ^AHQELKH%O0 YHAIA +4!+0 8JIANFAZ0 2JHAI3$!#$%!&$% ’()*+,-.*/ aF FGKELQE %JE HA[DLO EBBE$% FB EANF%JECHA FA JDPIA QIK$DCIL EANF%JECHIC
$ECCK :]b52K3 IAN K%DNO %JE HAJHGH%FLO LFCE FB 6FGECHI 2JHAEAKHK 6FDL ICMICFHNK :6269K3 FA %JHK EBBE$%=
0*,1234/ 9CMICFHNK RELE Ec%LI$%EN BLFP 6FGECHI 2JHAEAKHK 6FDL= aJE$FA$EA%LI%HFAK FB %HKKDEB%O_E _CIKPHAFB ZEA I$%HQI%FL :%B;93 IAN _CIKPHAFZEA I$%HQI%FL HAJHGH%FLB! :;97B!3 HA KD_ELAI%IA%K RELE IKKIOEN DKHAZ %JE EAB VOPE CHAMEN HPPDAFKFLGEA% IKKIO %E$JAHdDE= %*456,4/ aJE $FA$EA%LI%HFAK FB ;97B! RELE JHZJEL HA EANF%JECHA
ZLFD_K %JIA HA $FA%LFC ZLFD_ :!<=!3= 6269K CEKKEAEN %JE LECEIKE FB ;97B! KHZAHBH$IA%CO BLFP ]b52K HA[DLEN
GO EANF%JECHA :!<=!3= aJEHL EBBE$%K RELE KHPHCIL %F %JFKE FB EANF%JECHA > LE$E_%FL IA%IZFAHK%0>?.’’= &27!
+654-27/ 6269K $IA _LF%E$% ]b52K IZIHAK% %JE HA[DLO FB EANF%JECHA=
半边莲生物碱对内皮素诱导损伤的人血管
内皮细胞纤溶系统的影响
范秀珍 !’王婧婧 +’任冬梅 ,’肖 颖 )’陈 融 +’李 莉 +’胡维诚 +
:山东大学 !=护理学院)+=医学院病理生理学教研室) ,=药学院天然药化教研室) )=医学院分子医学实验
室’山东 济南 +4!+3
!!# $%&’( !#$%&’ ()&*$*+&+ !,- ’%.’%&/+0 1*/2)$%&*0 1*/2)$%&’% 3$%%+0 4&++,$!256$ 6%’+!
7&*8$* ’32&9’2-0 :%’+7&*8$* ’32&9’2- &*)&;&2-!<
内皮素#$*/2)$%&*$14%是从猪主动脉内皮细 胞中提取出来的一种具有多种生物学效应的含有 =< 个氨基酸残基的多肽 !<>参与动脉粥样硬化病 灶形成的全过程!=&蛇毒基因和 1?基因具有共同 的祖基因 !@’蛇毒A+’-’B2C&* DE;F和猪血管内皮起 源的 14!< 结构极为相似’且具有相似的生物学效 应!G& 桔梗科植物半边莲AH;$%&’ ()&*$*+&+ H,-I的
主要功效是清热解毒’利尿消肿’治疗蛇虫咬伤!J’
可能具有拮抗 14!<的作用& 现半边莲对 1?!<(L1 引起的内皮完整血管环和
去内皮血管环收缩均有剂量依赖的缓解作用 !E&
杜艳芝等发现’ 半边莲生物碱能使高脂血症大鼠
内皮细胞的 1? 合成及释放减少’ 并可促进 $LMD
的合成’缓解高脂血症对血管内皮的持续损伤 !N’O&
本研究采用细胞培养技术’观察 14!< 对血管内皮
细胞 1(P@QG#经转化的人脐静脉内皮细胞)在抗
凝血功能方面的损伤作用’ 研究半边莲生物碱对
14!< 损伤的人血管内皮细胞的影响’以进一步明
确半边莲拮抗 14’保护血管内皮细胞的作用机制
及其有效成分’ 为临床应用半边莲生物碱防治心
脑血管疾病提供实验依据&
< 材料与方法
药饮片厂 )’1(P@QG #上海细胞生物研究所 )’
ST1T 培养基和胰蛋白酶 #美国 U&;3 公司)’胎
牛血清 V杭州四季青公司 I’1?!< 及其拮抗剂
WXNOO(WX<=@A美国 D&87’ 公司I’2!:Y(:YZ!< 试剂
盒#上海太阳生物技术公司)&
袋放入提取器中’加入 KJ[乙醇’使其漫过纱布袋
@ 37&密闭提取器后’加热 = )’使药物有效成份进
入乙醇成为药物醇提液& 在真空浓缩机组中加热
药物醇提液 = )’使乙醇蒸发(药液浓缩’气态的乙
醇经低温管道变为液态回收再用’重复提取 @ 次&
置于旋转蒸发器中加热 =Q 7&*’使其浓缩成膏’用
@[\(Z 酸化溶解后’ 放入分液漏斗用乙醚萃取’
上层经蒸馏回收乙醚后得到有机酸* 下层加入氨
水或碳酸钠碱化’再用氯仿萃取’蒸馏回收氯仿后
得到生物碱&柱层层析法分离生物碱组分并纯化’
各组分薄层层析后用碘化铋钾显色’ 显示橙黄色
色谱的生物碱组分合并用于实验& 所得生物碱经
真空干燥器干燥’ 称取所需量配制成浓缩液’G
密闭保存备用&
待长满瓶底 KQ[时’用 QR=J[胰蛋白酶 @N 消化
J 7&*’吹打成单细胞悬液’以 G#接种于 =G 孔板中’每孔 QRJ 7%’培养 =G )’分组给
药+!正常对照组*1?!< 组+1?!< QRJ #7%]H*$
WXNOO ,1?W 受体拮抗剂 ) 组 +1?!< QRJ#7%]H’
WXNOO < #7%]H*%WX<=@,1?Y 受体拮抗剂)组+
1?!< QRJ #7%]H’ WX<=@ < #7%]H*&半边莲生物
碱高剂量组+1?!< QRJ #7%]H’ 半边莲生物碱 JQ
78]H* ’半边莲生物碱中剂量组+1?!< QRJ #7%]
H’半边莲生物碱 =J 78]H*(半边莲生物碱低剂量
组+1?!< QRJ #7%]H’半边莲生物碱 <=RJ 78]H&
后 ’ 1HZDY 法测定 1(P@QG 细胞培养上清液中
2!:Y 和 :YZ!< 含量’方法按试剂盒说明&
!! 表示’ 采用 D:DD<两比较’#^QRQJ 为差异有显著性&
= 结 果
=R< 半边莲生物碱对1(P@QG细胞培养上清中2!:Y
含量的影响 见表<& 由表<可见’1?!<组与正常对
照组相比’1(P@QG细胞分泌 2!:Y有减少趋势’但
无统计学意义* 半边莲生物碱低剂量组与1?!<组
相比’2!:Y含量增高,#^QRQ<)&高(中剂量组2!:Y含
量亦有增高趋势’但无统计学差异&
=R= 半边莲生物碱对1(P@QG细胞培养上清中
:YZ!<含量的影响 见表<& 由表<可见’1?!<组与
正常对照组相比’1(P@QG细胞释放:YZ!<增加 A#^
QRQ范秀珍>等 R 半边莲生物碱对内皮素诱导损伤的人血管内皮细胞纤溶系统的影响 !
!#!$降低!!%&’&$#()$*+组培养上清中!,-!$含
量低于./!$组!!%&’&0#半边莲生物碱各组培养 上清中!,#!$含量均低于1/!$组!!%&’&$$+ 讨 论 血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及其他许 多疾病的始动环节# 血管内皮损伤后发生的功能 异常贯穿了动脉粥样硬化发生%发展的各个阶段# 同时也是动脉粥样斑块破裂% 血栓形成的促发因 素之一&2’$
3!!, 和 !,-!$是由内皮细胞分泌的血管活性 物质#主要作用是调节凝血和纤溶系统平衡$ 3!!,
主要启动纤溶过程#而 !,-!$可与 3!!, 快速可逆 性结合#抑制 3!!, 的活性#血浆中 3!!, 和 !,-!$
的含量和比例决定血栓的形成与溶解&$&’$ 因此#
3!!, 4 !,-!$平衡失调可导致某些血栓性疾病或 机体处于高凝%低纤溶状态#促进动脉粥样硬化等 多种疾病的发生和发展$
1/ 于 $255 年由 67879:;7<7 发现# 是迄今为 止已知的最强的血管收缩肽之一&$’#此外#./还能
激活有丝分裂原活化的蛋白激酶 & $$’#促进平滑肌 细胞增殖$ ./生理状态下仅为 =>?@水平#以旁分 泌和细胞内分泌方式调节循环系统功能$ 病理状 态下机体 1/ 表达调控稳态紊乱#导致 1/ 异常表 达和释放$ 1/与多种心脑血管疾病如高血压%冠 心病%脑卒中%心律失常%心肌缺血!再灌注损伤的 发生%发展相关$ 本研究采用 1/!$ 建立人血管内皮细胞损伤 模型 # 结果显示 #1/!$ 可使 1AB+&C 细胞分泌 !,-!$增加#导致凝血和纤溶系统失衡$ 内皮素 D 受体拮抗剂 D)E55 能显著对抗这一过程 #使 .FB+&C细胞释放 !,-!$减少!!%&’&$$ D)$*+亦 能使 .FB+&C 细胞释放 !,-!$ 减少# 但作用不如
D)E55 明显!!%&’&0#其原因可能与血管内皮细
胞的 ./受体以 ./D受体为主有关&$*’$
G78H78等发现#./基因家族起源于一个祖基
因# 该祖基因首先进行了一次外显子复制# 产生
./样序列#又经历了两次基因复制#分别产生 ./!
+ 和 ./!$%./!*$ 蛇毒!;7I7J?3?K:8L MN/O基因起
源于 1/祖基因的外显子复制之后#第一次基因复
制之前$所以#MN/O 基因和 1/ 基因具有共同的 祖基因&+’$ P78 的研究结果也显示#MN/O MQR 和
1/!$可引起相似的心血管毒性反应#如动脉血压 升高%心动过缓%心输血量降低%外周血管收缩%冠 状动脉痉挛和心室颤动等$ 但 1/!$与 MN/O MQR 相比#产生的升压效果%血管收缩反应和心脏毒性 效应更强% 更持久&C’$ S?: 等研究 MN/O MQR 和
1/!$的缩血管作用#发现 MN/O MQR 和 1/!$ 在浓
度为 $&T2>?@4G时使血管环产生最大收缩压# 且这 种缩血管反应在内皮完整的血管环比去内皮的血 管环更强烈$ 他们还发现# 用 MN/O MQR 和 1/!$均可促使血管内皮细胞内韦伯 !潘拉迪小体 UVW:RW@!!7@7HW R?HX# V!DY 中的缩血管物质向细 胞外释放&$+’$抗蛇毒中药半边莲为桔梗科植物半边莲的干 燥根全草#性味辛%平#归小肠%肺经$ 主要化学成
分含生物碱%黄酮苷%皂苷和氨基酸$生物碱主要 包括山梗菜碱%山梗菜酮碱%山梗菜醇碱和去甲山 梗菜酮碱&0’$ 本研究用半边莲生物碱进行实验#发
现半边莲生物碱与 ./D 受体拮抗剂具有相似的
作用 # 能逆转 ./!$引起的 .AB+&C 细胞释放 !,-!$增加$说明半边莲生物碱具有维持凝血和纤 溶系统平衡的作用$
因此# 半边莲生物碱可能是半边莲中拮抗
./%保护血管内皮细胞的有效成分#本研究结果可
为进一步提取半边莲生物碱有效单体#开发新药#
用于临床心脑血管疾病防治提供实验依据$&参考文献’ &$’ 67879:;7<7 ZL [\I:]7I7 PL [:>\I7 ML W3 7@^ , 8?_W@
=?3W83 _7;?‘?8;3I:‘3?I =I?H\‘WH RX _7;‘\@7I W8H?3]W@:7@
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分组 3!!, Ur489(>@!$Y !,-!$Ur489(>@!$Y
正常对照组 05^0&&^EE 0$^0E&^*2
1/!$ 组 0Q^+0$^&& 05^E+$^0Edd
D)E55 组 Q$’QC$’Q2 00’*0&’C*!!
D)$*+ 组 0$’QEE’50 0Q’52$’C&!
半边莲生物碱高剂量组 Q$’+C*’2E 0$’QQ$’QE!!
半边莲生物碱中剂量组 Q*’EQ*’E2 CQ’0&&’&C!!
半边莲生物碱低剂量组 5$’5+Q’5$!! C5’+2&’20!!
dd!%&’&$ _; 正常对照组e!!%&’&0L!!!%&’&$ _; 1/!$ 组
表 $ 半边莲生物碱对 1AB+&C 细胞培养上清中 3!!, 和
!,-!$ 含量的影响U!#Y
山 东 大 学 学 报 !医 学 版 !卷 !期#
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!^ 高学敏主编 中药学 !# 北京$ 人民卫生出版社%
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!\ 田青%赵东%张继峰%等 对内皮素生物学效应拮抗作
用的研究!6中国科学V9 辑W%;PP^%<^V!X 杜艳芝%闫晓梅%胡维诚%等 清热解毒液对高脂血症
大鼠内皮素影响的研究 !6 中国病理生理杂志 %
;PPP>;^V;!_ 李瑞峰%温海涛%李莉%等 半边莲不同组分对内皮细
胞内皮素及内皮源一氧化氮合酶代谢的影响!6中国
动脉硬化杂志%<]]<>;]V;WO;P!<<8
!P 朱益%梁中琴%顾振纶槲皮素对培养人脐静脉内皮细
胞在缺氧条件下 .@; 和 $% 水平的影响!6&苏州大学
学报%<]]M>!;] 0F [[8 Y*$%,7#7B2 7*,7, B? 73* +&*DB27B%? %E #73*&%73&%$C%7B2 DB,*#,*!68 ‘?7 6 /1B? Q#C H*,> ;PPX>
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病毒性心肌炎中的价值f6g8 临床儿科杂志%;PPP%;X’M(O
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体的临床价值 f6g8 中华儿科杂志 > ;PPP#KX’P)O^\_!
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