全 文 ：第 34 卷 第 5 期
2015 年 5 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 34 No. 5
605 ～ 609
收稿日期:2014 － 12 － 18;修回日期:2015 － 01 － 12
基金项目:信阳职业技术学院院级科研项目(14QN07)
* 通讯作者:樊轻亚，硕士，讲师，研究方向:药物提取分离及分析，Tel:0376 － 6281969，E － mail:fqy2006hn@ 163. com
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 －4957. 2015. 05. 018
微波辐射 －溶剂回流法提取 /HPLC法测定倒提壶
中天芥菜碱与毛果天芥菜碱的含量
樊轻亚* ，李光霞
(信阳职业技术学院 药学院，河南 信阳 464000)
摘 要:采用单因素试验，对微波辐射 －溶剂回流提取法的实验条件进行优化，得到最佳提取条件:药材颗
粒度 100 目，微波功率 60%档(总功率为 700 W) ，微波辐射时间 90 s，固液比 1 ∶ 25，提取温度 90 ℃，提取时
间 45 min。以天芥菜碱和毛果天芥菜碱为提取目标物，通过 HPLC 法测定其含量，其分析条件为:以乙腈 －
0. 1%乙酸溶液(pH 5. 6，体积比 5 ∶ 95)为流动相，在 220 nm 处检测。毛果天芥菜碱和天芥菜碱的浓度在
50 ～ 900 mg /L范围内均呈良好线性关系，检出限分别为 1. 50 mg /L和 1. 52 mg /L，加标回收率分别为 95. 0%～
98. 5%和 96. 5%～101%，ＲSD分别为 1. 8%和 2. 4%，方法简单、灵敏度高。
关键词:微波辅射 －溶剂回流法提取;倒提壶;天芥菜碱;毛果天芥菜碱;高效液相色谱法
中图分类号:O657. 7;Ｒ282. 4 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2015)05 － 0605 － 05
Determination of Heliotrine and Lasiocarpine in Cynoglossum amabile Stapf
et Drumm by HPLC with Microwave Irradiated Solvent Ｒeflux Extraction
FAN Qing-ya* ，LI Guang-xia
(Department of Pharmacy，Xinyang Vocational and Technical College，Xinyang 464000，China)
Abstract:A method of extraction for heliotrine and lasiocarpine was developed using microwave irra-
diated solvent reflux extraction(MISＲE)． The single factor test was used to optimize the experimental
conditions． The optimum extraction conditions were as follows:100 mesh size of material，micro-
wave power:60%，microwave irradiated time:90 seconds;solvent － materail ratio:1 ∶ 25;ex-
traction temperature:90 ℃;extraction time:45 min． Heliotrine and lasiocarpine were determined
by HPLC using acetonitrile － 0. 1% acetic acid(pH 5. 6，5 ∶ 95)as mobile phase at a detection
wavelength of 220 nm． The linear ranges of lasiocarpine and heliotrine were in the range of 50 － 900
mg /L，with detection limits of 1. 50 mg /L and 1. 52 mg /L，respectively． The recoveries were in the
ranges of 95. 0% － 98. 5% and 96. 5% － 101%，with ＲSDs of 1. 8% and 2. 4%，respectively．
The method was simple and highly sensitive．
Key words:microwave irradiated solvent reflux extraction(MISＲE) ;Cynoglossum amabile Stapf et
Drumm;heliotrine;lasiocarpine;high performance liquid chromatography(HPLC)
倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm) ，是紫草科琉璃草属植物，分布于不丹及中国的西藏、
云南、贵州、四川、甘肃等地。倒提壶全草入药，其味苦，性凉，有清热利湿、散瘀止血、止咳、镇
痛之功效。倒提壶可内服或者外用，单味入药或是作为复方使用，常用来治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳
嗽、风湿性关节炎、尿道炎等症［1 － 3］。
生物碱是本属植物的主要成分，有着广泛的药理和毒理活性，如抗肿瘤、抗菌、抑制微生物以及
肝毒性等。天芥菜碱和毛果天芥菜碱是其中含量较多的成分。刘清华等［4］研究发现，毛果天芥菜碱对
实验肿瘤系统 walker － 256 系统有显著活性，且抑制新月型念珠球菌的活性较强，对热带念珠球菌有最
大抑制活性。Pandey 等［5］发现天芥菜碱能显著降低尼古丁所致的神经节激动效应(痉挛反应) ，其
LP30 强于已知神经阻滞剂安血定 13 倍之多。
606 分析测试学报 第 34 卷
近年来微波提取技术(Microwave-assisted extraction，MAE)逐步应用于中药有效成分的提取［6 － 17］。
微波辐射 －溶剂回流提取法(Microwave irradiated solvent reflux extraction，MISＲE)是利用微波辐射处理
药材，使药材细胞破壁或结构改变后，再利用常规溶剂回流提取装置进行提取的方法。本文以药材倒
提壶作为研究对象，将 MISＲE技术应用于倒提壶中天芥菜碱和毛果天芥菜碱的提取，用高效液相色谱
法测定其含量，建立了微波辅助 －溶剂回流提取 /HPLC 测定倒提壶生物碱含量的分析方法，并与聚焦
微波辅助提取方法(Focused microwave-assisted extraction，FMAE)及常规溶剂回流提取法(Solvent reflux
extraction，SＲE)进行了比较，为其进一步在工业上的应用提供理论依据。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂与材料
P8023CTL － K4 微波炉(格兰仕公司) ;LC － 10 Atvp，SPD － 10 Avp 高效液相色谱仪(日本岛津公
司) ;ＲE －52 AA型旋转蒸发器(上海雅荣生化设备仪器有限公司) ;SHZ － D(A)循环水式多用真空泵
(天津华鑫仪器厂) ;B －260 型恒温水浴(上海雅荣生化设备仪器有限公司) ;pHS － 25 数显酸度计(上
海虹益仪器仪表有限公司)。摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司) ;DL － 360A超声清洗
器(上海之信仪器有限公司)。
天芥菜碱、毛果天芥菜碱对照品(纯度为 98. 5%，成都普瑞法科技开发有限公司) ;盐酸、氢氧化
钠、无水乙醇、乙酸、甲醇、氯仿、三乙胺(分析纯，郑州德众化学试剂厂) ;甲醇、乙腈(色谱纯，
美国 Merck 公司)。倒提壶(产地安徽，亳州市药材有限公司，批号 20130601，20130603，20130801)
经信阳职业技术学院中药鉴定学教研室吴长忠老师鉴定为倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)
全草。药材机械粉碎后过筛，按不同目数分别存储，备用。
天芥菜碱和毛果天芥菜碱混合标准溶液:精密称取天芥菜碱和毛果天芥菜碱的标准品 10. 50 mg 和
10. 60 mg，用甲醇定容至 10 mL容量瓶中，配制成天芥菜碱和毛果天芥菜碱浓度分别为 1. 050 mg /mL
和 1. 060 mg /mL的混合标准品储备液，按需要逐级稀释。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 提取方法 微波辐射 －溶剂回流提取法(MISＲE) :称取 100 目倒提壶药材 2. 0 g 于培养皿中，
加入 10. 0 mL蒸馏水，混匀，铺平，充分浸润，再放入微波炉中以微波功率 60%档(总功率为 700 W)
辐射 90 s后，加入 50 mL乙醇，将其转移到烧瓶中，于 90 ℃水浴中回流提取 45 min。
常规溶剂回流提取法(SＲE) :称取 100 目倒提壶药材 2. 0 g，加入 50 mL乙醇，于 100 ℃水浴中回
流提取 50 min。
聚焦微波辅助提取法(FMAE) :精密称取 100 目倒提壶药材 2. 0 g，加入 60 mL 乙醇，放入微波炉，
在烧瓶下方放置 2 000 mL水防止提取过程中易引起局部受热不均而产生暴沸，以中火微波功率辐射回
流 50 min。
1. 2. 2 提取液的净化 将提取液减压抽滤，滤液旋干，用 30 mL 盐酸(pH 2. 0)超声溶解，倾出，置
于分液漏斗，氯仿萃取后的水相用 1%NaOH溶液调至 pH 10，再用氯仿萃取 3 次，收集氯仿层，旋干，
用甲醇溶解、定容。
1. 2. 3 HPLC分析 将上述处理液过 0. 45 μm滤膜，按以下色谱条件测定:色谱柱 Phenomenex Luna
C18(5 μm，250 mm ×4. 6 mm) ，乙腈 － 0. 1%乙酸溶液(pH 5. 6，体积比 5 ∶ 95)为流动相，流速 1. 0
mL /min，检测波长为 220 nm，进样量 20 μL，柱温:室温。
2 结果与讨论
2. 1 MISＲE提取条件的优化
MISＲE提取法是采用微波对药材进行辐射处理后，再用溶剂回流对其进行提取。本文采用单因素
试验，考察了微波辐射处理过程中，微波功率和辐射时间对药材的影响，并考察了溶剂回流提取过程
中，药材颗粒度、固液比、回流提取温度、提取时间等因素对天芥菜碱和毛果天芥菜碱提取率的影响。
2. 1. 1 微波功率与辐射时间对提取率的影响 采用 10 mL水将 2. 0 g药材浸泡 30 min后在微波炉中进
第 5 期 樊轻亚等:微波辐射 －溶剂回流法提取 /HPLC法测定倒提壶中天芥菜碱与毛果天芥菜碱的含量 607
行微波辐射，考察微波功率(20%～100%档，总功率为 700 W)和辐射时间(30 ～ 120 s)对天芥菜碱和毛
果天芥菜碱提取率的影响，结果见图 1。
图 1 微波辐射功率和时间对毛果天芥菜碱(A)和天芥菜碱(B)提取率的影响
Fig. 1 Effects of microwave power and microwave irradiation time on the yield of lasiocarpine(A)and heliotrine(B)
由图 1 可见，在微波辐射时间太短，微波功率太低的情况下，产生的热量少，细胞中局部过热的
现象不明显，因而破壁效果差，以致天芥菜碱和毛果天芥菜碱的提取率较低;相反，微波辐射时间太
长，功率太高，倒提壶样品因受热过度而焦化，样品颗粒粘结，在溶剂回流提取时生物碱更难被提取
出，同样造成提取率下降。而微波辐射时间为 90 s，微波功率为 60%档时，可获得较高的提取率。
2. 1. 2 药材颗粒度及固液比对提取率的影响 考察了 20 ～ 120 目等不同颗粒度大小的药材对天芥菜碱
和毛果天芥菜碱提取率的影响。同时研究了固液比(药材与提取溶剂的质量体积比)为 1 ∶ 10 ～ 1 ∶ 30
时对生物碱提取率的影响。结果显示，两生物碱的提取率均随着药材目数的增大而逐渐升高，当样品
颗粒度为 100 目时，提取率最高，颗粒度为 120 目时提取率反而降低。因为颗粒度太大时微波难以完
全穿透样品，破壁不完全。颗粒度减小，使提取溶剂与单位质量的药材接触面积增大，有利于溶剂对
药材中有效成分的浸出。当颗粒度太小时虽然微波能完全穿透样品，但由于相邻细胞间的相互作用增
强，细胞所受阻力增大，因而其内部细胞被破坏的程度相对较小，而且实验发现颗粒度太小，微波照
射时易出现焦化，回流时易出现板结，从而不利于天芥菜碱和毛果天芥菜碱的提取。因此选择样品颗
粒度为 100 目较为适宜。
固液比的实验结果显示，天芥菜碱和毛果天芥菜碱的提取率均随固液比的减小(即溶剂体积的增
大)而逐渐增高，当溶剂体积增至一定程度后提取率趋于平缓。综合考虑，选择固液比为 1 ∶ 25。
2. 1. 3 提取温度与提取时间对提取率的影响 考察了不同提取温度(50 ～ 90 ℃)与提取时间(5 ～ 60
min)对毛果天芥菜碱和天芥菜碱提取率的影响，结果见图 2。
图 2 提取温度和提取时间对毛果天芥菜碱(A)和天芥菜碱(B)提取率的影响
Fig. 2 Effects of extraction temperature and extraction time on the yield of lasiocarpine(A)and heliotrine(B)
608 分析测试学报 第 34 卷
图 2 显示，在 50 ～ 90 ℃之间，毛果天芥菜碱和天芥菜碱的提取率随着提取时间的延长而逐渐升
高，当提取时间较短，提取温度较低时，细胞内的有效组分不能被完全溶出;当增加提取时间和提高
提取温度时，分子运动加快，有利于细胞内的组分向外扩散，而且在较高的温度下，提取时间可以显
著缩短，在 90 ℃下提取 45 min，两者的提取率基本不再升高，达到平衡。
上述结果表明，MISＲE提取天芥菜碱和毛果天芥菜碱的最佳条件为:药材颗粒度 100 目，微波功
率 60%档，微波辐射时间 90 s，固液比 1 ∶ 25，提取温度 90 ℃，提取时间 45 min。
图 3 天芥菜碱和毛果天芥菜碱混合标准品(A)
以及倒提壶提取液样品(B)的色谱图
Fig. 3 Chromatograms of heliotrine and lasiocarpine standard
solution(A)and the extracted from Cynoglossum
amabile Stapf et Drumm(B)
2. 2 HPLC分析
以不同比例的水和乙腈作为色谱流动相，分
别对倒提壶生物碱提取液进行色谱分析。实验研
究发现，用乙腈和水作为流动相难以实现天芥菜
碱、毛果天芥菜碱与提取液中其他物质的基线分
离。以乙酸和三乙胺调节酸度，考察了 pH 3. 5 ～
6. 0 条件下倒提壶生物碱提取液的色谱分离效果。
结果表明，以乙腈 － 0. 1%乙酸溶液(pH 5. 6，体
积比 5 ∶ 95)为流动相，可实现倒提壶生物碱的分
离，如图 3 所示，毛果天芥菜碱和天芥菜碱的保
留时间分别为 18. 85 min和 28. 80 min，分离度大
于 1. 5，满足分析测定要求。
2. 2. 1 线性范围、标准曲线与检出限 分别配
制不同浓度的天芥菜碱和毛果天芥菜碱混合标准
品溶液，按 HPLC分析条件测定，以峰面积(A)和浓度(c)绘制标准工作曲线。结果表明:毛果天芥菜
碱和天芥菜碱浓度在 50 ～ 900 mg /L 范围内均呈良好的线性关系，线性系数(r)分别为 0. 999 4 和
0. 999 1，检出限分别为 1. 50 mg /L和 1. 52 mg /L。
2. 2. 2 精密度、重复性及稳定性实验 取天芥菜碱和毛果天芥菜碱的混合标准品溶液，重复测定 5
次，其相对标准偏差(ＲSD)分别为 0. 42%和 0. 28%，表明精密度良好。
称取 2. 0 g倒提壶药材 6 份，按照“1. 2. 1”实验方法进行提取，计算得天芥菜碱和毛果天芥菜碱
提取率(mg /g)的 ＲSD分别为 1. 8%和 1. 4%，表明方法的重复性良好。
取供试品溶液，室温下静置，分别于 0，2，4，8，16，24 h 测定，测得天芥菜碱和毛果天芥菜碱
的 ＲSD分别为 2. 6%和 2. 5%，表明提取液在 24 h 内稳定。
2. 2. 3 加标回收实验与样品分析 称取 2. 0 g 100 目的药材粉末，按照实验方法进行提取和分析，并
进行加标回收试验。结果显示，倒提壶药材中天芥菜碱的含量较毛果天芥菜碱高，两种生物碱的加标
回收率分别为 95. 0%～98. 5%和 96. 5%～101%，其 ＲSD分别为 1. 8%和 2. 4%(见表 1) ，满足分析测定
的要求。
表 1 MISＲE提取倒提壶生物碱的分析结果
Table 1 Ｒesults of the extraction from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm on microwave irradiated solvent reflux extraction
Alkaloid
Yield
(mg /g)
Average
(mg /g)
Ｒecovery test
Added(mg) Found(mg) Ｒecovery(%)
ＲSD(%)
Heliotrine 8. 89，8. 95，8. 92 8. 92 2. 60 2. 63，2. 53，2. 51 101，97. 3，96. 5 2. 4
Lasiocarpine 2. 98，3. 03，3. 05 3. 02 1. 32 1. 30，1. 28，1. 25 98. 5，97. 0，95. 0 1. 8
2. 3 提取方法的比较
精密称取 3 个批次的倒提壶药材各 2. 0 g，分别采用 MISＲE，FMAE［18］，SＲE［18］各自最优条件提取
药材中的天芥菜碱和毛果天芥菜碱，并对 3 种方法的提取结果进行了对比(见表 2)。由表 2 可见，3 种
提取方法中，MISＲE提取率最高，SＲE提取率最低。与 SＲE提取相比，采用MISＲE法提取，天芥菜碱
和毛果天芥菜碱的提取率升高近 3 倍;与 FMAE 法相比，MISＲE 法提取生物碱的效率提高了 1. 5 倍。
这是因为MISＲE，FMAE和 SＲE的加热方式不同。SＲE在提取过程中首先是加热溶剂并溶胀样品细胞，
第 5 期 樊轻亚等:微波辐射 －溶剂回流法提取 /HPLC法测定倒提壶中天芥菜碱与毛果天芥菜碱的含量 609
以热传导方式将热能从溶剂传递到细胞内部进行加热，存在温度梯度;FMAE 是直接穿透容器，物料
整体被加热，无温度梯度，加热速度快、无滞后效应，样品与溶剂在很短的时间内便可升到很高的温
度，从而有效提高提取效率;MISＲE法用微波直接辐射用水浸泡后的药材，微波能量使细胞内的水分
气化膨胀，当到达一定压力后而使细胞破壁，细胞内的成分更容易被后续过程的溶剂提取，因此 MI-
SＲE的提取效率最高。
表 2 不同方法的提取分析结果(n = 3)
Table 2 The results of different extracted methods(n = 3)
Batch Extraction method
Heliotrine Lasiocarpine
Yield(mg /g) ＲSD(%) Yield(mg /g) ＲSD(%)
20130601 MISＲE，SＲE，FMAE 9. 13，3. 32，6. 68 1. 4，1. 5，2. 4 3. 18，1. 02，2. 23 1. 2，2. 6，2. 2
20130603 MISＲE，SＲE，FMAE 9. 05，3. 28，6. 56 2. 3，1. 8，1. 7 3. 10，0. 97，2. 17 2. 8，2. 1，1. 8
20130801 MISＲE，SＲE，FMAE 9. 02，3. 21，6. 49 1. 6，2. 1，1. 9 3. 12，3. 02，2. 13 1. 9，2. 5，1. 7
3 结 论
本文采用 MISＲE提取方法提取倒提壶生物碱，利用 HPLC 法测定，考察了微波功率、微波辐射时
间、药材颗粒度、固液比、提取温度和提取时间等因素对倒提壶生物碱提取率的影响。该法仪器设备
简单，易于操作，药材处理量大，提取率高，适合进行工业化生产。
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