全 文 ：1※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 06
普洱茶茶色素提取工艺条件的响应面分析及其
抗氧化性活性研究
杨新河 1,2，李 勤 1,3，黄建安 1,3，陆 英 1,3，沈 智 1,3，刘仲华 1,3 ,*
(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.孝感学院生命科学技术学院，湖北 孝感
432000；3.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128)
摘 要：目的：优化普洱茶茶色素的提取工艺及研究其抗氧化性活性。方法：以与蒸馏水的色差作为普洱茶茶色
素提取的评价指标，在单因素试验基础上，利用 Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，对普洱茶茶色素提
取工艺参数进行优化；以清除 1,1-二苯基 -2-苦基肼自由基(DPPH自由基)的能力评价普洱茶茶色素的抗氧化性活性。
结果：普洱茶茶色素提取的最佳工艺条件为液料比 45:1(mL/g)、提取温度 100℃、提取时间 150min、色差 52.97，
高出单因素试验和Box-Behnken组合中的最高色差 4.73%；普洱茶茶色素清除DPPH自由基的 IC50值 30.83μg/mL。
结论：采用响应曲面法对普洱茶茶色素提取条件进行优化可行；普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用，可作为天
然抗氧化剂进一步开发和利用。
关键词：普洱茶；茶色素；提取；响应面分析；抗氧化性活性
Optimization of Process Conditions for Pu-erh Tea Pigment Extraction by Response Surface Analysis and
Its Antioxidant Activity
YANG Xin-he1,2，LI Qin1,3，HUANG Jian-an1,3，LU Ying1,3，SHEN Zhi1，LIU Zhong-hua1,3,*
(1. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingedients, Changsha 410128,
China；2. College of Life Science and Technology, Xiaogan University, Xiaogan 432000, China；3. Key Laboratory of Tea
Science, Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract ：Objective: To optimize the extraction process for Pu-erh tea pigment and explore its antioxidant activity. Methods:
Following single factor investigations, optimization of process conditions for the extraction of Pu-erh tea pigment based on the
color difference value E between distilled water and Pu-erh tea pigment was carried out using central design composite design
combined with response surface methodology (RSM). 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay
was used to evaluate the antioxidant activity of the pigment. Results: The optimal extraction conditions for Pu-erh tea pigment
were liquid-to-material ratio of 45:1 (mL/g), extraction temperature of 100 ℃ and extraction time of 150 min. Under the optimal
extraction conditions, a color difference E value of 52.97 was obtained, which revealed 4.73% increase as compared to the highest
color difference in single-factor investigations and Box-Behnken composite experiments. The IC50 value for the scavenging
capability of Pu-erh tea pigment on DPPH free radicals was 30.83μg/mL. Conclusion: It is feasible to optimize the extraction
of Pu-erh tea pigment by response surface methodology. The Pu-erh tea pigment with excellent antioxidant activity has the
potential to be further developed and utilized as a natural antioxidant.
Key words：Pu-erh tea；tea pigment；extraction；response surface methodology；antioxidant activity
中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)06-0001-06
收稿日期：2010-04-21
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重大项目(2007BAD58B00-03)；云南省政府茶叶专项(2007YNCXB-01-01)
作者简介：杨新河(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：yangx inhe@163 .com
*通信作者：刘仲华(1965—)，男，教授，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail：Larkin-liu@163.com
普洱茶是以云南省一定区域内的云南大叶种晒青毛
茶为原料，经过后发酵加工成的散茶和紧压茶[1]。研究
表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗突变、防癌
及防治心血管疾病等功能[2-13]。普洱茶药理作用的主要
2011, Vol. 32, No. 06 食品科学 ※工艺技术2
成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等[1]。普洱茶茶色素是
指从普洱茶中提取的一类水溶性酚性色素，属于天然色
素，包括茶黄素类(TFs)、茶红素类(TR s)和茶褐素类
(TBs)，其中茶褐素类是其主体成分。而茶褐素类比茶
红素类更复杂，为高聚物，极性很大，分离纯化的难
度极大，根本不清楚其组成、性质及分离制备等，急
需开展茶褐素类的相关研究。现有一些研究初步表明：
普洱茶茶色素具有防癌抗癌、防紫外线照射、抗动脉
粥样硬化等药效，产品的开发可广泛用于医药和食品工
业[14]。但普洱茶茶色素的药理作用机理并不清楚、新的
功效有待挖掘，应用领域需要拓展。因此，如何有效
充分提取普洱茶茶色素是深入研究其化学成分、构效关
系及产生更大经济效益等诸多方面的前提。
目前，茶叶中色素类物质 TFs、TR s 和 TB s 的含
量采用系统分析法测定[15]，但此方法不能够对浸提色素
的效果进行快速评价。而色差 E测量原理采用最广泛使
用于测量物体色调的CIE L*a*b*颜色空间(即色度空间)
系统。所有的颜色可用 L *、a *、b * 三个轴的坐标来
定义。L * 为垂直轴，代表明度，其值从底部 0 (黑)到
顶部 100 (白)。a* 代表红绿轴上颜色的饱和度，其中
－ a*为绿、+a*为红。b*代表蓝黄轴上颜色的饱和度，
其中－ b * 为蓝、+ b * 为黄。a *、b * 都是水平轴。2
个颜色之间的 E=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。测定溶液
与蒸馏水标准液的 E值，则 E值的大小反映了溶液色素
质量浓度的大小，从而可以简单快速评价不同浸提条件
对提取色素效果的影响。本实验采用 E值作为普洱茶茶
色素提取的评价指标，研究热水提取茶色素过程中液料
比、提取温度和提取时间对茶色素提取的影响。在此
基础上，利用响应面分析法对其提取工艺参数进行优
化，得出普洱茶茶色素水提法的最佳工艺条件；同时利
用清除1,1-二苯基 -2-苦基肼自由基(DPPH自由基)法研究
普洱茶茶色素的抗氧化作用，旨在为深入研究普洱茶茶
色素提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
龙润普洱茶(2007年) 云南龙润茶业集团。
1,1-二苯基 -2-苦基肼自由基(DPPH自由基) 日本东
京化成工业株式会社；其他试剂皆为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
精密电子天平 瑞士 Startorius公司；恒温水浴锅
北京国华医疗器械厂；SMY-2000ST测色色差计 北京
盛名扬科技开发有限责任公司；Rotavapor R-200型旋转
蒸发器 瑞士Buchi公司；循环水式多用真空泵 河南
巩义英峪予华仪器；Modulyod-230型冷冻干燥机 美国热
电公司；UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 普洱茶茶色素 TFs、TRs和 TBs的含量测定
采用系统分析法[15 ]测定。
1.3.2 普洱茶茶色素的 E测定方法
普洱茶经粉碎，筛分，烘干，无水乙醚脱脂，备
用。精密称取一定量的普洱茶脱脂样品于 150mL浸提瓶
中，加入一定体积的热水在 1 0 0℃条件下浸提，每隔
2 0m in 振摇 1 0s，浸提 2 h，过滤，滤液浓缩，冻干，
取冻干粉配制成系列梯度质量浓度的溶液，再经色差计
测定与蒸馏水的 E值，计算出与色素质量浓度呈线性正
相关的 E值范围。样品浸提所得滤液定容至 250mL，测
定与蒸馏水的 E 值大小评价色素提取的高低。
1.3.3 普洱茶茶色素的提取
精密称取普洱茶脱脂样品 1.250g于 150mL浸提瓶
中，加入一定体积的热水在相应温度下浸提，每隔
2 0 m i n 振摇 1 0 s，浸提完毕后，过滤，滤液定容至
250mL，再经色差计测定与蒸馏水的 E值。试验分别考
察了温度、液料比和提取时间对 E 值的影响，并在单
因素试验的基础上，选取温度、液料比和提取时间 3个
因素的合适水平进行Box-Behnken中心组合设计，采用
响应面分析法对提取工艺进行优化。
1.3.4 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力
按照优化的提取工艺浸提普洱茶茶色素，过滤，
滤液旋转真空浓缩至一定体积，冷冻干燥，取冻干粉
用蒸馏水配制成不同质量浓度的样品液。参照文献[16]，
分别取 2mL样品液于试管中，加入 2mL 2× 10-4mol/L
D P PH 自由基溶液(无水乙醇配制)，混合均匀，反应
30min后在波长 518nm处测定其吸光度 A1，以 2mL水代
替样品测定吸光度为 A0；以 2mL样品与 2mL无水乙醇混
合液为 A2，以消除样品本身的影响，以 2mL水与 2mL
无水乙醇的混合液调零点。按下式计算清除率：

A1－A2
DPPH自由基清除率 /% = (1－————)× 100

A0
2 结果与分析
2.1 普洱茶中 TFs、TRs和 TBs的含量
普洱茶中茶色素 TFs、TRs和 TBs含量(占干物质的
质量分数)分别为 0.298%、2.19%、12.02%。普洱茶中
茶色素以 TBs含量最高，远远高于 TRs和 TFs，而 TFs
的含量很低。TFs、TRs和 TBs都是茶多酚的不同程度
的氧化产物，三者含量的高低与普洱茶独特的后发酵过
程密切相关，即在整个“后发酵”过程中多酚类物质
经过酶促氧化和弱非酶促氧化聚合后，先产生茶黄素
..
3※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 06
类、茶红素类，再进一步氧化聚合生成茶褐素类物质，
而茶褐素则大幅度增加，是形成普洱茶色泽的主要原因。
2.2 普洱茶茶色素的 E值与质量浓度的关系
配制质量浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL
的色素溶液，用色差计测定与蒸馏水的E值依次为 21.98、
36.07、50.32、67.30和 82.14。以色素质量浓度(mg/mL)
为横坐标 X、以 E值为纵坐标 Y进行线性回归，方程为
Y=30.31X+6.097，相关系数 R2=0.9989，色素在 0.5～
2.5mg/mL范围内与E值在21.98～82.14之间呈良好的线性
关系，如图 1 所示。因此，用色差计测定色素溶液的
E值在21.98～82.14范围内的数据能够正确评价色素含量
的高低。
2.3.2 液料比对普洱茶茶色素提取 E值的影响
固定茶色素提取的温度 80℃、时间 1h，以液料比
对茶色素提取E值做单因素试验。设计液料比 15:1、25:1、
35:1、45:1、55:1(mL/g)，结果见图 3。
2.3 单因素试验
2.3.1 提取温度对普洱茶茶色素提取 E值的影响
固定茶色素提取的液料比 35:1、时间 1h，以提取
温度对茶色素提取 E值做单因素试验。设计提取温度
6 0、7 0、8 0、9 0、1 0 0℃，结果见图 2。
由图 2可知，随着温度在 60～100℃之间的升高，
普洱茶茶色素提取 E值增加显著，其原因可能与温度越
高，茶色素扩散到溶剂中的速度越快及普洱茶中本身含
有的简单多酚氧化转化为聚合多酚形式的茶色素越多有
关。从实际生产情况考虑，提取温度不宜超过 100℃。
由图 3可知，液料比的增大对提高普洱茶茶色素提
取 E值的效果较为明显，在 15:1～45:1之间，E值呈直
线上升趋势，而在 45:1～55:1之间茶色素提取 E值变化
平缓且略有下降。这可能是由于普洱茶需要吸收较多水
分，才能充分溶胀，有利于色素的溶出；当液料比达
到 45 :1 时，色素充分溶出，但继续增加溶剂比例后，
其他成分过多溶出反而不利于色素的提取。考虑到降低
后续工序浓缩的能耗及提高效率，液料比应控制在 45:1
以内。
2.3.3 提取时间对普洱茶色素提取 E值的影响
固定茶色素提取的液料比 35:1、温度 80℃，以提
取时间对茶色素提取 E值做单因素试验。设计提取时间
30、6 0、9 0、1 2 0、1 5 0m i n，结果见图 4。
由图 4可知，提取时间的延长对提高普洱茶色素提
取 E值的效果有一定的影响，在 30～120min之间，E
值呈上升趋势，而在 120～150min之间 E值趋于平缓。
因此，提取时间宜控制在 90～150min内。
2.4 采用响应面法优化普洱茶茶色素的提取工艺
根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基
图 1 E 值与茶色素质量浓度的相关图
Fig.1 Relationship between color difference E value and Pu-erh tea
pigment concentration
质量浓度 /(mg/mL)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
E
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
图 2 提取温度对普洱茶茶色素提取 E 值的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on color difference E value of
Pu-erh tea pigment
提取温度 /℃
60
50
40
30
20
10
0
E
60 70 80 90 100
图 3 不同液料比对普洱茶茶色素提取 E 值的影响
Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on color difference E value of
Pu-erh tea pigment
液料比(mL/g)
40
39
38
37
36
35
34
33
32
31
30
E
15:1 25:1 35:1 45:1 55:1
图 4 提取时间对普洱茶茶色素提取 E 值的影响
Fig.4 Effect of extraction time on color difference E value of Pu-erh
tea pigment
提取时间 /min
44
42
40
38
36
34
32
E
30 60 90 120 150
2011, Vol. 32, No. 06 食品科学 ※工艺技术4
运用Minitab 14数据统计分析软件，使用未编码单
位对试验数据进行多元回归拟合，回归模型系数及显著
性检验结果见表 3，得到液料比、温度、时间的二次
多项回归模型。
Y= 158.056－0.122X1－3.031X2＋0.054X3＋0.004X12＋
0.019X22+0.002X1X2－0.001X1X3－0.001X2X3 (1)
水平
因素
X1液料比(mL/g) X2提取温度 /℃ X3提取时间 /min
－ 1 25:1 80 90
0 35:1 90 120
1 45:1 100 150
表 1 普洱茶茶色素的提取响应面试验因素与水平表
Table 1 Factors and levels in response surface design for optimizing
the extraction of Pu-erh tea pigment
试验号 液料比 提取温度 提取时间 E
1 － 1 0 1 44.27
2 0 － 1 1 43.97
3 － 1 1 0 47.01
4 0 0 0 43.28
5 1 － 1 0 44.04
6 － 1 － 1 0 41.33
7 0 － 1 － 1 40.65
8 1 0 1 47.42
9 1 0 － 1 45.00
10 － 1 0 － 1 40.29
11 1 1 0 50.58
12 0 0 0 43.36
13 0 1 － 1 47.87
14 0 0 0 43.87
15 0 1 1 50.45
表 2 普洱茶茶色素的提取响应面分析方案及其计算分析结果
Table 2 Scheme and results of response surface design for optimizing
the extraction of Pu-erh tea pigment
项目 系数 系数标准误 t值 P值
常量 158.056 20.6307 7.661 0.001
X1 － 0.122 0.2488 － 0.491 0.644
X2 － 3.031 0.3951 － 7.673 0.001
X3 0.054 0.0863 0.626 0.559
X12 0.004 0.0021 1.769 0.137
X22 0.019 0.0021 8.831 0
X32 0 0.0002 1.746 0.141
X1X2 0.002 0.002 1.061 0.337
X1X3 － 0.001 0.0007 － 1.924 0.112
X2X3 － 0.001 0.0007 － 0.913 0.403
表 3 回归模型系数及显著性检验结果
Table 3 Regression coefficients and significance test for the constructed
quadratic polynomial model equation
础上，选取液料比、温度、时间 3 个因素的合适水平，
对提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见
表 1 、2 。
由表 3可以看出，根据 P值判断(P＜ 0.05时水平显
著)，各因素中一次项 X2和二次项 X22是最为显著的，其
次是交互项 X 1X 3，由此可见，各具体试验因素对响应
值的影响不是简单的线性关系。
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值
回归 9 141.993 15.78 95.97 0.000
线性 3 127.885 3.5042 21.32 0.003
平方 3 13.179 4.3929 26.72 0.002
交互作用 3 0.93 0.3101 1.89 0.25
残差误差 5 0.822 0.16
失拟 3 0.617 0.2057 2.01 0.349
纯误差 2 0.205 0.1024
合计 14 142.815
S=0.405454；R2=0.9942；R2Adj=0.9839
表 4 回归方程方差分析表
Table 4 Analysis of variance for the regression equation
表 4回归方程方差分析表明，方程二次项影响是最
为显著的，一次项影响也是极为显著的，交互项影响
相对不显著，说明响应值的变化相对复杂。R2=0.9942
较大，说明二次多项式回归效果比较好，失拟项为 0.349
不显著，说明回归方程拟合程度良好。
残差
99
90
50
10
1
百
分
比
－0.50 －0.25 0.00 0.25 0.50
a.正态概率图
拟合值
0.4
0.2
0.0
－ 0.2
－ 0.4
残
差
40.0 42.5 45.0 47.5 50.0
b.与拟合值
残差
3
2
1
0
频
率
－ 0.4 － 0.2 0.0 0.2 0.4
c.直方图
5※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 06
对响应数据(E值)进行残差分析，残差值分析结果见图
5，表明模型(1)能在很大程度上解释观测数据(E值)中的变异。
模型(1)的响应曲面及其等高线见图 6，3组图直观
地反映了各因素对响应值的影响。由图 6可以看出温度
对色素提取 E值的影响最为明显，以液料比与时间的交
互作用较大，但未达到显著水平。从图 6 也可以看出，
当一个因素的水平固定为 1时，能够预测另两个因素取
不同水平组合的 E 值大小。因此，色素提取可以依据
模型(1)的响应曲面及其等高线图，在实际生产中从能
耗、效率及经济效益等多方面综合考虑来合理选择 3因
素的水平组合。
图 6 各两因素交互作用的响应曲面和等值线图
Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-
interaction between extraction temperature, extraction time and liquid-
to-material ratio on color difference E value of Pu-erh tea pigment
单纯从色素提取的 E值大小考虑，用Mintab 14软
件进行分析，则可以求得最适的提取条件为 X 1=45:1、
X2=100℃、X3=150min，预测色素提取的 E值为 52.29，
在此条件下进行验证实验，重复 3 次，取平均值，提
取液中 E值为 52.97，相对标准偏差为 1.37%，与预测
值相差 1.3%，高出单因素试验和Box-Behnken组合中的
最高 E值 4.73%。因此，基于响应曲面法所得的优化工
艺参数准确可靠。
2.5 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力
DPPH自由基在国内外广泛用于清除自由基物质性
质的研究与天然抗氧化剂的筛选。若受试物能将其清
除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基
或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链的作用[17]。
普洱茶茶色素对 DPPH自由基的清除结果见图 9，可知
液料比(mL/g)
52.5
50.0
47.5
45.0
E
24:1 30:1 36:1 42:1 80
90
100
提
取
温
度
/℃
＜ 44
44～46
46～48
48～50
50～52
＞ 52
液料比(mL/g)
固定水平：提取时间 1 50 m in。
A.E值与提取温度、液料比
100
95
90
85
80
提
取
温
度
/℃
25:1 30:1 35:1 40:1 45:1
E
提取温度 /℃
52.5
50.0
47.5
45.0
E
80
90
100
100
120
140
提
取
时
间
/m
in
＜ 44
44～46
46～48
48～50
50～52
＞ 52
提取温度 /℃
固定水平：液料比 4 5 : 1。
B.E值与提取温度、提取时间
150
140
130
120
110
100
90
提
取
时
间
/m
in
80 85 90 95 100
E
液料比(mL/g)
52.5
50.0
47.5
45.0
E
24:1 30:1 36:1 42:1
100
120
140
提
取
时
间
/m
in
＜ 46
46～47
47～48
48～49
49～50
50～51
51～52
＞ 52
150
140
130
120
110
100
90
提
取
时
间
/m
in
E
液料比(mL/g)
固定水平：提取温度 1 0 0℃。
C.E值与液料比、提取时间
25:1 30:1 35:1 40:1 45:1
图 5 提取 E 值残差分析图
Fig.5 Residual plot for color difference E value of Pu-erh tea pigment
观测值顺序
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
d.与顺序
0.4
0.2
0.0
－ 0.2
－ 0.4
残
差
2011, Vol. 32, No. 06 食品科学 ※工艺技术6
3 结 论
3.1 以与蒸馏水的 E值作为色素提取的评价指标，基
于试验设计软件Minitab 14，通过二次回归设计得到了
普洱茶茶色素提取 E与料液比、提取温度、提取时间
的回归模型，利用响应优化器得到色素提取 E值的优化
工艺参数为液料比 45:1(mL/g)、提取温度 100℃、提
取时间 150min，色素提取 E值 52.97，相对标准偏差
为 1.37%，与预测值相差 1.3%，高出单因素试验和 Box-
Behnken组合中的最高 E值 4.73%。因此，利用响应面
分析方法对普洱茶茶色素提取工艺进行优化，可获得最
优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，从而
为进一步的实验研究提供参考。
3.2 按照普洱茶茶色素提取的优化工艺提取得到的干燥
产品清除DPPH自由基的体外抗氧化性实验，可知普洱
茶茶色素具有良好的抗氧化作用，清除DPPH自由基的
IC50为 30.83μg/mL，普洱茶茶色素可以作为一种天然的
抗氧化剂。
参 考 文 献 ：
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样品质量浓度在 10～60μg/mL范围内对DPPH自由基的
清除率呈线性正相关，普洱茶茶色素清除DPPH自由基
的 IC50值为 30.83μg/mL。普洱茶茶色素清除DPPH自由
基的能力可能与其结构中的一些活性酚羟基和苯骈卓酚
酮结构有关。
图 7 普洱茶茶色素对 DPPH自由基的清除作用
Fig.7 Scavenging rates of Pu-erh tea pigment at various concentrations
on DPPH free radicals
质量浓度 /(μg/mL)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
自
由
基
清
除
率
/%
0 20 40 60 80