全 文 ：海藻糖酶基因RNA干扰载体对花烟草的转化
王 彬 1，周 靖 2，赵文博 2，余 佳 1，陈 茁 2，郭 蓓 2
（1北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206）
摘 要：为了能够使花烟草更好地应用于园林美化，需要进一步提高其抵抗非生物胁迫的能力。海藻糖在
植物抗逆性方面具有重要作用。利用RNA干扰技术抑制植物海藻糖酶基因的表达，可以阻断海藻糖降
解过程，从而使植物体内海藻糖含量增加，有望以此提高植物抵抗非生物胁迫的能力。本实验利用叶盘
侵染法将带有拟南芥海藻糖酶基因干扰载体(iTre-1285)的农杆菌导入花烟草中，经过抗生素筛选初步获
得阳性植株后，对阳性植株提取DNA，完成了目的基因的PCR鉴定，初步证明目的基因已转入花烟草植
株中。通过本试验，在建立起花烟草基因转化方法的同时，成功地将海藻糖酶干扰基因转入花烟草中。
转基因花烟草植株的获得为后期能够进一步筛选出具有抵抗非生物胁迫的转基因植株奠定了基础。
关键词：花烟草；海藻糖酶；RNA干扰；基因转化
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2014-0105
Transformation of Nicotiana alata with RNAi Vector of Trehalase Gene
Wang Bin1, Zhou Jing2, Zhao Wenbo2, Yu Jia1, Chen Zhuo2, Guo Bei2
(1Plant Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;
2College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)
Abstract: In order to make better use of flower tobacco in landscaping, its ability to resist abiotic stress need to
be further enhanced. Trehalose plays an important role in plant resistance. Using RNA interference to inhibit
the expression of trehalase gene can block the process of trehalose degradation, so as to increase the trehalose
content in plant, which can be expected to improve plant resistance to abiotic stress. In this experiment,
agrobacterium carried the RNA interference vector of Arabidopsis trehalase gene (iTre- 1285) had been
transformed into flower tobacco (Nicotiana alata) by leaf disc infection method; positive plants were acquired
after screening with kanamycin and carbenicillin. DNA was extracted from the positive plants and the target
gene appeared in PCR detection. This meant that the target gene had been transformed into flower tobacco
plants. So through this study, the genetic transformation methods of flower tobacco had established, while
RNAi trehalase gene transformed into flower tobacco successfully. This result laid a foundation for cultivating
transgenic flower tobacco against abiotic stress for further.
Key words: Nicotiana alata; trehalase; RNAi; gene transformation
0 引言
花烟草(Nicotiana alata)属一年生草本植物，原产
阿根廷和巴西，现在中国部分地区有引种栽培，是优美
的花坛、花境材料，既可丛植或大面积栽植，亦可盆栽
于阳台或居室摆放，是优良的园林绿化植物[1]。为了
能够更好地将花烟草应用于园林美化，需要进一步提
高花烟草抵抗非生物胁迫的能力。
国外科学家对花烟草的关注度较高，比较多地开
基金项目：企业横向资助项目“生物保鲜剂曲酸的研制及其在农产品上的应用”(2014115014)。
第一作者简介：王彬，女，1987年出生，北京人，硕士研究生，研究方向：植物分子遗传育种。通信地址：102206北京农学院生物科学与工程学院，Tel：
010-80799075-1，E-mail：948911933@qq.com。
通讯作者：郭蓓，女，1962年出生，北京人，教授，博士，研究方向：植物分子遗传与基因工程育种。通信地址：102206北京农学院生物科学与工程学
院，Tel：010-80795433，E-mail：guobeibac@tom.com。
收稿日期：2014-01-10，修回日期：2014-04-08。
中国农学通报 2014,30(15):282-285
Chinese Agricultural Science Bulletin
展过有关其花发育的分子生物学研究。Edwin[2]对花
烟草体外生长的花粉管中葡聚糖的合成和重构进行过
研究；Wheeler[3]描述了花烟草花粉中编码SLF相关蛋
白的10种基因之区别；Lee等[4]曾研究过结合在花烟草
雌蕊中阿拉伯半乳聚糖蛋白 C端上的花粉蛋白；
Brownfield等[5]关注过花烟草花粉管生长过程中葡聚
糖合成酶的分子调控问题；而Kaczorowski[6]则对花烟
草花器官形态性状的构成和遗传性进行了探讨。相比
之下，中国对花烟草的研究很少，只在花烟草自交不亲
和的机理[7]、自交不亲和性连锁的基因定位[8]以及黄酮
类化合物种类及含量[9]等方面做过极少量的研究，至
今未见有深入研究的报道。
花烟草作为园林植物，需要其具有较强的抵抗不
同非生物胁迫的能力。海藻糖(Trehalose)在植物抗逆
性方面具有重要作用，它广泛存在于微生物、动物和植
物体内，能有效地保护细胞膜和蛋白质的结构[10]，从而
使生物体具有较强的抗胁迫能力 [11]。随着研究的深
入，海藻糖生物合成与降谢过程的若干关键酶基因已
从大肠杆菌[12]、酵母[13]、担子菌灰树花[14]、耐放射异常球
菌[15]等材料中相继被克隆出来。将这些基因转入烟草[16]、
甘蔗[17]、马铃薯[18]、苜蓿[19]等植物中，会使转基因植物的
抗非生物胁迫能力得到了不同程度的提高。
根据笔者先前的研究结果，通过过量表达海藻糖-
6-磷酸合成酶[20]和干扰海藻糖酶(Trehalase，Tre)表达，
可以有效地提高转基因烟草的抗逆能力，而且后者的
效果要明显好于前者。
在本试验中，希望将带有海藻糖酶干扰载体的农
杆菌转入花烟草，在建立花烟草基因转化体系的同时，
获得转基因阳性植株，为后续的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 野生型花烟草 (Nicotiana alata)组
培苗。
1.1.2 载体和菌株 拟南芥海藻糖酶干扰载体 (iTre-
1285)由本实验室构建。含有上述载体和植物干扰表
达载体(pGSA-1285)的农杆菌菌株 LBA4404，由本实
验室留存。
1.1.3 试剂 本试验中所使用的抗生素氯霉素(Chl)、利
福平(Rif)、卡那霉素(Kan)、羧苄青霉素(Cb)均为 Inalco
公司产品，购自北京拜尔迪生物技术有限公司。PCR
反应引物及Taq酶来自上海生工生物工程公司。
1.2 试验方法
1.2.1 侵染液制备 将本实验室留存的带有目的基因的
农杆菌菌株在含有 Chl(25 mg/L)和 Rif(50 mg/L)的
YEB固体培养基上进行划线培养，挑取单菌落，放入
带有相同抗生素的 YEB 液体培养基中，28℃，
180 r/min初始培养后，以 1:50的比例活化培养至
OD600=0.3~0.4时即可用于侵染。
1.2.2 农杆菌侵染 借助叶盘法，用上述带有目的基因
的农杆菌侵染花烟草叶片 [21]，侵染时间为 3 min。之
后，将叶片放入带有滤纸的培养基(MS+6-BA 1 mg/L+
NAA 0.2 mg/L)上，25℃黑暗培养4天。
1.2.3 选择培养 4天之后将共培养的叶片转入选择培
养基(MS+Kan 50 mg/L+Cb 250 mg/L+6-BA 1 mg/L+
NAA 0.2 mg/L)中，25℃光照条件下培养，诱导愈伤形
成。待愈伤分化产生不定芽后，将不定芽转入生根培
养基(1/2MS+Kan 50 mg/L+ Cb 250 mg/L)中，直至形成
完整的植株。
1.2.4 PCR鉴定 利用 CTAB法提取转基因植株的
DNA用于 PCR鉴定。PCR扩增反应体系为：1×PCR
buffer，2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L
的引物，0.2 U Taq酶，40~60 ng的模板DNA，反应体积
为20 μL。扩增反应在Bio-rad公司的MJ Mini PCR仪
上进行，反应条件为：95℃预变性 5 min；94℃ 30 s，
58℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。
2 结果与分析
2.1 转化及筛选过程
为了能够明确看到海藻糖酶干扰后的效果，笔者
将带有拟南芥海藻糖酶的干扰载体(iTre-1285)和植物
干扰表达的空载体(pGSA-1285)同时转入花烟草。
借助叶盘转化法，用带有不同目的基因的农杆菌
侵染花烟草的叶片，共培养（图1A）4天后转入选择培
养基，诱导产生愈伤组织（图 1B），将愈伤组织上分化
出来的不定芽（图 1C）转入生根培养基中。经过抗生
素的系列选择培养，最终获得了带有不同目的基因的
转基因花烟草植株（图1D）。
2.2 PCR鉴定
选择抗生素筛选为阳性的植株，提取植株叶片的
DNA，经过 0.8%的琼脂糖凝胶电泳，证明提取的基因
组DNA结构完整后，用相应的引物对花烟草转基因植
株进行PCR鉴定。
图 2 显示的为 PCR 鉴定的结果。左图为对
pGSA1285空载体的扩增结果，其中1，2泳道为转基因
样品，扩增后出现了约460 bp的目标条带；泳道3为未
转基因的野生型花烟草，没有出现相应的条带。右图
为对 iTre-1285进行PCR扩增的结果，其中泳道1为野
生型花烟草，没有出现扩增条带；2~5泳道为转基因样
品，除3号泳道外，其余泳道扩增后都出现了约480 bp
王 彬等：海藻糖酶基因RNA干扰载体对花烟草的转化 ··283
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的目标条带。
从以上PCR检测结果可以明显看出，在 2种转基
因花烟草中均出现了目标产物，初步确定 2种基因都
已正确转入花烟草植株中。
3 结论与讨论
根据文献报道，为更好地保护侵染叶片少受农杆
菌菌液的伤害，可以利用植物侵染液对农杆菌菌体进
行重悬培养，这样既可以使带有目的基因的农杆菌正
常生长，也有利于对侵染叶片的保护，使农杆菌更容易
进入受体，提高转化率。试验中，笔者使用了植物侵染
液与农杆菌菌液两种方法对外植体进行浸染，并加以
比较。结果发现2种方法侵染后的叶片长势和愈伤的
形成及分化无明显区别。因此，为简化试验步骤，减少
污染机率，本试验选用菌液直接侵染叶片的方法实现
转化。
花烟草与普通烟草虽为同属植物，但在植株形态
和生长习性上还是有明显的区别。在对卡那霉素的耐
受力方面花烟草弱于普通烟草，因此卡那霉素的筛选
浓度不宜高于 50 mg/L。另外，由于花烟草的节间较
短，所以要注意生长素的使用种类和浓度。
海藻糖是一种安全的天然糖类，具有独特的抗冷
冻和抗脱水的生物功能，可以对多种逆境具有抵抗作
用。本研究的总体思路是通过RNA干扰技术，抑制花
烟草中海藻糖酶的活性以此来减少海藻糖的降解，从
而增加内源海藻糖的含量，提高转基因植株的抗胁迫
能力。
在本试验中进行了目的基因对花烟草的遗传转
化，并通过抗生素筛选和PCR鉴定，初步获得了转基
因阳性植株。在现有试验的基础上，笔者的后续工作
会完成对转基因植株的进一步分子检测，以明确目的
基因的转录与表达情况，并通过表型鉴定和不同的抗
逆性试验，检测转基因花烟草是否在生物学特性和抗
逆性方面发生改变，希望最终能够通过转基因技术培
育出具有抗非生物胁迫和有益表型突变的转基因花
烟草新品种，使之能够更广泛地应用于园林美化
工程。
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A.共培养；B.诱导愈伤；C.分化不定芽；D.转基因植株
图1 花烟草的转化及筛选过程
左图为pGSA1285空载体检测，M：DNA marker DL2000，1~2：转基因植株，3：野生型；
右图为 iTre-1285检测，M：DNA marker DL2000，1：野生型，2~5：转基因植株
图2 转基因植株PCR鉴定结果
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