全 文 ：76
〔 9 〕 R o s e n g t r a u s ,
细 胞 生 物 学 杂 志 1 9召8年
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月刃乙. , 8头 5 1 6一5 2 0 .
〔1 0〕 C l e a v e r , J . 瓦 , 1 9 6 7 , I n “ F r o n t i er s o f
B i o l o g y
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才i。才10 , : , 25 : 6 8一了6 .
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J
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A c a d em i
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口已V . 口若0 ` . , 6 6: 艺丫一 3 4 .
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( I n s t
,
P 尽s t纵 r ) 12 4 B , 2 6 9一2 82
花烟草叶肉原生质体再生,植株
王 光远 夏镇澳
(中国科学院上海植物生理研究所 )
花烟草是一种 观 赏植 物 , 染 色体 数少
( Z n = 18 沁 植物形态和花型 一与 其 他烟草有较
大差异 , 是较好的细胞融合材料 。 文献中已报
道 了从花烟草叶肉原生质体再生植株 , 但都是
由愈伤组织分化芽 而来 〔 1 , 2声 ’ ; 尚 未 见有经胚
状体途径的资料 。 而这一途径 已在多种植物的
组织培养中观察到 , 并越来越多地引起人们的
重视 。 本文报道在花烟草叶肉原生质体培养过
程中形成大量球形胚 , 心形胚 , 再生成完整植
株的结果 。
2毗八, K T 仇 2 5 mg l/ , 蔗糖 2 % , 甘露醇 。 · 6 m ol /
L
,
p H 6
·
0 ,
愈伤组织继代培养基 : 一改良的 M S (M S 的大量元
素和微量元素 , B , 维生素 ) , 附加 2 . 4一 2 m g l/ , 蔗
糖 3 % , p H 6 . 0 。 (液体培养基中不加琼脂 ) 。
分化培养基 : 与上 述 改 良的 M S 相同 , 附加 6 -
BA
Z执 sl/ ,l 入OA
.
25 m s1/
。 1
材 料 和: 方 法
实验材料 花烟草 (从 c陇沁加 以 a切八由中国农业
科学 院 烟 草所提供 )种 子播 于 温 室 (日 2 5℃ , 夜
1 3℃ , 自然光照 ), 用 45 天以上苗龄的 伸展叶片 · 取
下叶片用肥皂水表面清洗后放入 3%漂 粉「精水溶液内
表面灭菌 15 分钟 , 无菌水洗涤二次滤纸吸干 。 撕去下
表皮 , 放人已抽滤的酶液内(酶液组成 EA 3一 86 7纤维
素酶 王% , 甘露醇 .0 6 m ol / L丈 p H .S 5) , 「28 ℃恒温箱
内保温 4 小时 ; 然后过滤 , 一 离心衬洗年 用原生质体
培养基 ( N )T 制备成 2 . l x 1 0 4个 / m l原生质体悬浮液 。
原生质 体培养基 : N T [’] 培!养 基 , 附加 2 , 4刁
结 果 和 一讨 论
一 、 原生质体培养 将制备好的原生质体
悬浮液进行浅层 培 养 ( 图 1 ) 。 2 4 小时原生质
体明显长大 , 众后俞。%原件 质 体呈循圆
形 。 7 夭出现一 次 分裂 (图一 2 ) , 拓 天观察到
2一 3 次细胞分裂 (图 3 ) , 5周 ` 后 观 察到细胞
团 (图 4 ) , 而且有 2。% 左右 的 球 形而结构紧
密的细胞 团 。 将细胞悬浮液移入新 鲜 NT 培养
液内继续培养 , (甘露醇降低为 。 . 2 m ol / L ) 。
组 织移入改良的 sM 眼可见的愈伤组织 , 把 2。 血大小的 愈伤组织移入改 良 M s 瘩养基上继
一 厂
代培养 , 愈伤组织继续生长一个月后 , 将俞伤
带 照片由陈乃先同志帮助拍摄 , 特此致谢
第 10卷第 2期 ! 胞 生 物 学 杂 志 7了
组织移入改 良的 MS液体培养基中进行悬浮培
养 ( 90转 /分 ), 在此条件下细胞迅速生长 , 球形紧密结构愈伤组织增多 , 达 40 一勃% , 明显
增 大 , 肉眼可见 ( 图 5 ) 。 每 15 天转接一次新
鲜液体培养基 , 继续培养一个月 。 在解剖镜下
观察 , 有心形胚 , 约有 _Lo % (图 6 ) , 未 见 明
显鱼 雷胚 。 然后将悬浮液过滤 ( 1 0 0 目不 锈 钢
网 ) , 将以上球形胚 、 心形胚组织移入固体分
化培养基上 。
二 、 分化 上述材料移入分化培养基上培
养二个月 , 出现了又有子叶又有根的苗 ( 图 7 ) ,
出苗率为 80 % 左右 。 将 2 厘米高 的 带有 根的
苗移入 盖M OS (贵M S 大量元素 , 微量元素和维生
素 )固体培养基上继续生长 。 当苗长到 3一 4 厘
米高时移入土壤内盆栽 。 三个月后全部移栽植
株正常开花结实 (图 8 ) 。 以上实验三次重复 。
在实验中我们观察到愈伤组织继代培养一
年半 , 紧密球形愈伤组织会逐渐变成疏松 , 球
形结构只有 12 叮。 二年后几乎全 是 疏 松愈伤
组织 , 生长较快 , 细胞已易老化 , 将这类愈伤
组织放在分化培养基上一直未见分化出苗 。 进
行细胞染色体观察 , 发现有 4 . 2%的 细胞染色
体数有变化 Z n = 3饥
从以上结果看出 , 花烟草叶肉原生质体培
养所得的愈伤组织当继代培养较长时间后 , 细
胞会丧失分化能力 。 因此 , 用于细胞融合或其
他有关研究应当注意选用继代培养时间较短的
细胞系为材料 。
在实验中 , 将具有球形胚的愈伤组织放入
M S
。 培养基上没有观察到球形胚诱导出苗 , 当
移入 M S 分化培养基上培养一个月左右观察到
球形胚诱导出子叶和根的分化 。 这一现象有待
进一步研究 。
摘 要
用自制的纤维素酶 ( E A 3一 8 6 7) 从 花 烟草
( N i c o t i a n a a l a t a )叶肉细胞市,{备 大 量有活力的
原生质体 。 在 N T 培养 基 ( 内含 2 , 奋一 D Z , KT
0
.
25 毫克 /升 )上观察到原生质体长大 , 分裂 ,
形成愈伤组织 。 愈伤组织悬浮在含有 2 , 4一D Z
m g /升的 M S 培养基上诱导出球形胚 , 移入M S
(B A Z
, I A A 0
.
Z m翻 l) 培养基上出苗 。 小苗移
植土壤中正常生长 、 开花 、 结实 。
图 版 说 明
.1 花烟草叶肉原生质体 (1 0 ): 1 6 火 的
2
. 培养 7 天出现一次分裂 (加 X 初 义 的
3
. 培养 15 一 2 0天出现 2一 3 次分裂 ( 1 0 义 40 义 幻
乙. 培养 5 周后的细胞团 ( 1 0 x 1 6 x 4 )
5
. 结构紧密的球形愈伤组织 (1 5 “ 4)
6
. 心形胚结构 ( 4 0 X 4 )
了。 由原生质体培养分化的子仆卜苗
8
. 由原生质体培养再生完整植株
参 考 文 献
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奈卿气