全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
收稿日期：2016－05－30
基金项目：教育部博士点基金项目（20130146110022）；华中农业大学自主创新项目（2013PY088）；黄冈师范学院研究项目（2015TD02）
作者简介：丁海琴（1991－），女，湖南永州人，在读硕士研究生，研究方向为观赏园艺，（电子信箱）1458638290＠qq．com；通信作者，王彩云，
教授，博士，主要从事花卉学研究，（电话）18971187799（电子信箱）wangcy＠mail．hzau．edu．cn。
第 55 卷第 8 期
2016年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
0期
0月
Vol． 5 No.20
Oct.
花烟草（Nicotiana forgetiana）又称福吉特士烟
草，起源于澳大利亚和北美洲 ［1］，与烟草（Nicotiana
tabacum L．）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）等同
为茄科烟草属植物。其株型较小，株高 1 m左右，花朵
美丽，花色为稳定的洋红色，从初夏至降霜均可开
放，具有较高的观赏价值，可在园林中普遍应用 ［2］。
花烟草再生与遗传转化体系的建立
丁海琴，曾祥玲，王艳丽，郑日如，王彩云
（华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘要：以花烟草（Nicotiana forgetiana）无菌苗植株的叶片为材料，研究不同 NAA 和 6－BA 组合培养的再生
体系， 得到最佳培养基配方为 NAA 浓度为 0．1 mg ／ L 和 6－BA 浓度为 1．5 mg ／ L， 此时再生率达 97％、平
均芽数达 8．65。 以卡那霉素（Km）、头孢霉素（Cef）为筛选试剂，探讨了影响农杆菌介导的花烟草遗传转化
因素，表明卡那霉素敏感性浓度为 20 mg ／ L、头孢霉素抑菌浓度为 300 mg ／ L，在菌液 OD600 nm为 0．2～0．4 时
最适侵染时间为 5 min； 最适筛选培养基 （MS＋0．1 mg ／ L NAA＋1．5 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L
Km）、壮芽培养基 Z2（MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋0．01 mg ／ L NAA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）、生根培养基 S2
（MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）。 以最佳组合进行遗传转化培养，获得的生根苗经炼
苗移栽后存活 35 个株系，用 CTAB 法提取植物组织 DNA，经 PCR 检测证实外源基因已转入植物组 DNA
中，阳性率为 71％。
关键词：花烟草（Nicotiana forgetiana）；再生体系；根癌农杆菌；遗传转化体系
中图分类号：S681．9；Q813．1；Q813．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）20－5384-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.055
Establishment of Regeneration and Genetic Transformation System of
Nicotiana forgetiana
DING Hai－qin，ZENG Xiang－ling，WANG Yan－li，ZHENG Ri－ru，WANG Cai－yun
（College of Horticulture ＆ Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University/Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants，
Ministry of Education，Wuhan 430070，China）
Abstract： Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants， the effects of different concentrations of naphthalene－acetic
acid（NAA） and 6－benzylamino purine（6－BA） to the regeneration system were explored． Results showed that optimum medium
for the highest differentiation rate amounting to 97％ and number of per buds up to 8．65 was MS medium with supplement of
0．1 mg ／ L Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants，the effects of different concentrations of naphthalene－acetic acid
（NAA） and 6－benzylamino purine （6－BA） on the leaf regeneration were analyzed． On the basis of the regeneration medium，
the factors affecting the genetic transformation efficiency，such as Kanamycin（Km），Cefotaxime（Cef） and infection duration，were
studied． Results suggested that the optimal concentration of Km for callus selecting was 20 mg ／ L，300 mg ／ L Cef could control
the agrobacterium pollution and suitable infection duration was 5 min． The optimal medium for selecting （MS＋0．1 mg ／ L NAA＋
1．5 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km），induction （MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋0．01 mg ／ L NAA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）
and rooting（MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km） were also selected． Finally，35 transferred plants were obtained，
and PCR analysis indicated that the exogenous gene had been integrated into the genome of transformed Nicotiana forgetiana．
Key words：Nicotiana forgetiana； regeneration system； Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation system
第 20 期
国外的报道主要包括其自交不亲和机理的研究 ［3］、
与烟草属中多种野生种共同作为比较基因组学 ［4］、
传粉生物学 ［5］、形态进化学 ［6］的重要研究对象等，如
Bissell 等［7］研究了烟草属 N． forgetiana 与 N．alata 两
个物种的花朵形态学遗传规律。 但因花烟草的自交
不亲和性，通常需要人工授粉获得后代［8］，较耗费时
力，而组培再生能够为其获得大量材料提供简单可
靠的途径。
自 Horseh 等 ［9］首次以烟草为材料获得转基因
植株以来，越来越多不同植物材料的遗传转化得以
研究和应用 ［10，11］，为不同需求的基因功能分析提供
了有效途径［12，13］。普通烟草、本氏烟草等的再生与遗
传转化体系不断更新完善［14－17］，成为观赏植物，尤其
是木本观赏植物转基因功能验证的模式材料 ［18，19］。
但是普通烟草的株型较大，占地多，不便于整体的
开花调控；其花色易受光照、温度、湿度等环境因素
的影响，容易干扰花色相关基因的结果 ［20］。 相比而
言，花烟草株型较小，花色为稳定的花烟草，便于管
理和花色相关基因研究，但是至今鲜见其再生及遗
传转化体系的报道。 因此，以花色稳定且株型较小
的观赏花烟草为材料， 建立其再生及遗传转化体
系，可为观赏植物花色基因的研究提供一种新的转
基因模式材料。
1 材料与方法
1．1 材料
花烟草无菌苗，来源于华中农业大学园艺植物
生物学教育部重点实验室所建立的无菌苗株系，以
40～50 d 的花烟草叶片作为转化的受体材料。
MYB 目的基因来源于桂花 （Osmanthus fra-
grance），供试质粒为 pCAMBIA2300s，含 CaMV35S
启动子及卡那霉素抗性基因；转化受体菌株为根癌
农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）EHA105，由华
中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室保
存提供。 检测正向引物为 35S－F：ACGCACAATCC-
CACTATCCTTC。
头孢霉素（Cef）、卡那霉素（Km）、利福平（Rif）采
用过滤灭菌，生长素 NAA、细胞分裂素 6－BA 均用
121 ℃下高温高压蒸汽灭菌。 农杆菌培养基主要有
LB＋Km 固体培养基、LB＋Km＋Rif 液体培养基和 MS
液体培养基。
1．2 再生培养基的筛选
将 40～50 d 的无菌苗叶盘， 接种于不同植物生
长调节剂组合（A－F）的培养基（表 1），在（25±2） ℃、
16 h ／ d 光照条件下培养， 每个处理 30 个外植体，
30 d后统计再生率和平均芽数。
不定芽再生率＝再生不定芽的外植体总数/接种
外植体总数×100（％）；平均芽数＝外植体再生不定芽
总数/再生不定芽外植体总数。
1．3 遗传转化体系的建立
1．3．1 抗生素敏感性试验及头孢霉素抑菌浓度的
确定 卡那霉素浓度筛选：配制卡那霉素 0、10、20、
30、40 和 50 mg ／ L 的再生培养基，将 30～50 d 的无菌
苗叶盘接种于不同的培养基上，在（25±2） ℃、16 h ／ d
光照条件下培养，30 d 后统计不定芽再生率和平均
芽数。
头孢霉素抑菌浓度的确定。配置头孢霉素 100、
200、300、400 mg ／ L 及 20 mg ／ L 卡那霉素的筛选培
养基。 叶盘侵染 5 min 后接种于不同的培养基上，
30 d后统计菌落和叶盘再生情况。
1．3．2 农杆菌的培养与菌液准备 在含卡那霉素
的固体培养基上平板划线，避光培养 3 d。 挑取单克
隆置于含 Km 和 Rif 的 LB 液体培养基中（5 mL），28
℃、200 r ／ min 振荡培养至培养基颜色由酒红色变为
橙红色。 再进行继代培养，取 1 mL菌液于 50 mL培
养基中，同样条件下培养至培养基颜色由酒红色变
为浅橙红色， 用分光光度计测定 OD600 nm，OD600 nm为
0．2～0．4 左右可用。将菌液置于 50 mL无菌的离心管
4 ℃条件下 4 000 r ／ min 离心 10 min，弃上清液，加入
50 mL MS 液体培养基，振荡使菌液重悬，28 ℃条件
下 200 r ／ min 培养 1 h即可。
1．3．3 叶盘的侵染 将无菌苗叶盘在重悬后的菌
液中进行侵染 ， 侵染时间设置梯度为 2、5、8 和
11 min，侵染完成后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌
液，暗培养 3 d。
1．3．4 侵染后的培养 暗培养完成后， 用含有 Cef
（300 mg ／ L）的无菌水清洗叶片 8 min，再用无菌水清
洗 2～3 遍，无菌滤纸吸干后，放入筛选培养基中培
养。每隔 15 d继代 1 次，直到长出小芽，再放入壮芽
培养基（Z1、Z2）中培养。 Z1（MS＋1．0 mg ／ L 6－BA＋
0．1 mg ／ L NAA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km） 和 Z2
（MS＋0．1 mg ／ L 6 －BA＋0．01 mg ／ L NAA＋300 mg ／ L
Cef＋20 mg ／ L Km）。小芽长出 3～4 片叶时，切下放入
表 1 不同植物生长调节剂组合
处理
A
B
C
D
E
F
NAA
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
0.2
6-BA
1.0
1.5
2.0
1.0
1.5
2.0
浓度//mg/L
丁海琴等：花烟草再生与遗传转化体系的建立 5385
湖 北 农 业 科 学 2016 年
生根培养基（S1、S2）中培养。 S1（1 ／ 2 MS＋0．1 mg ／ L
6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）和 S2（MS＋0．1
mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）。 培养室
设置为（25±2） ℃、16 h ／ d光照。
1．3．5 生根苗的炼苗及移栽 将已生根且根长约
2～3 cm、株高 3～4 cm的叶片鲜绿组织培养壮苗带瓶
移到光照培养箱中， 选择光照适中的区域打开瓶
盖，进行 2～3 d光适应。然后将根洗净移栽于装有基
质的小钵中，基质全部用清水浸湿，第一次浇水浇
透，之后每隔 2~3 d 浇水 1 次，使基质见干见湿，至
新根新叶发出，即移栽成活。
1．4 转基因花烟草的 PCR检测
取筛选获得的转基因植株叶片， 采用 CTAB 法
提取植物组织总 DNA， 用 CaMV35S 启动子上游引
物和 MYB目的基因下游引物进行 PCR 扩增。 扩增
体系为 5 μL Es Taq Mix、35S－F 和 MYB－R 各 0．5
μL、1 μL DNA 模板、3 μL 去离子水。 PCR 扩增条
件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 S，60 ℃退火
30 S，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。 设置供试
质粒为阳性对照，野生型花烟草为阴性对照，计算
阳性率。
2 结果与分析
2．1 不同植物生长调节剂组合对叶盘再生的影响
30 d 后统计叶片再生情况发现， 叶盘在 NAA
和 6－BA不同浓度配比的培养基中再生率差别较大
（表 2、 图 1）。 其中，B 组合即当 NAA 浓度为 0．1
mg ／ L、6－BA浓度为 1．5 mg ／ L时， 诱导效果最好，再
生率达 97％，平均芽数达 8．65。 叶盘 1 周左右开始
诱导形成愈伤组织，2 周后开始分化形成芽点，4 周
后芽点萌发形成整齐一致的丛生芽，适合作为遗传
转化材料。
2．2 卡那霉素敏感性浓度及头孢霉素（Cef）抑菌浓
度的确定
在预试验阶段，用 50、100 mg ／ L 的卡那霉素浓
度进行筛选比较，花烟草叶盘在培养至 20 d 时已全
部褐化。 在此基础上设计含有 0、10、20、30、40 和
50 mg ／ L 卡那霉素再生培养基进行筛选比较。 结果
表明，花烟草叶盘对卡那霉素反应比较敏感（表 3、
图 2）。 当卡那霉素浓度为 20 mg ／ L 时，愈伤组织褐
变率为 90．9％，出芽率为 2．0％，极少部分叶盘及愈
伤组织能够维持绿色， 并分化出部分绿芽。 当卡
那霉素浓度大于 20 mg ／ L时，叶盘基本全部褐化，无
法分化出绿芽。 一般确定筛选浓度要略低于临界致
死浓度，因此，本试验确定卡那霉素敏感性浓度为
20 mg ／ L。
当头孢霉素浓度为 300 mg ／ L时，基本能够抑制
农杆菌的生长，且再生率最高为 71.0％，当其浓度继
续升高时，叶盘再生率下降，说明头孢霉素浓度过
高时会抑制叶盘的生长（表 4）。 因此选择 300 mg ／ L
作为头孢霉素抑菌的适宜浓度。
2．3 农杆菌菌液侵染时间的确定
侵染时间是影响农杆菌侵染效果的重要因素，
表 3 卡那霉素对不定芽再生的影响
卡那霉素浓度//mg/L
0
10
20
30
40
50
接种数
34
55
44
49
37
40
愈伤褐变率//%
5.8
54.5
90.9
95.9
100.0
100.0
出芽率//%
88.2
20.0
2.0
0.0
0.0
0.0
A、B、C、D、E、F 分别对应表 1 中的相应处理
图 1 NAA 和 6－BA 对花烟草不定芽分化的影响
A B C
D E F
A．0 mg ／ L；B．10 mg ／ L；C．20 mg ／ L；D．30 mg ／ L；E．40 mg ／ L；F．50 mg ／ L
图 2 卡那霉素对不定芽再生的影响
A B C
D E F
表 2 NAA 和 6-BA 对花烟草不定芽分化的影响
处理
A
B
C
D
E
F
NAA
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
0.2
6-BA
1.0
1.5
2.0
1.0
1.5
2.0
接种数
30
30
30
30
30
30
植物生长调节剂//mg/L 不定芽再生率
%
23
97
67
13
60
30
平均
芽数
5.14
8.65
7.25
3.50
5.67
2.11
5386
第 20 期
表 4 头孢霉素抑菌效果及对不定芽再生的影响
头孢霉素浓度//mg/L
100
200
300
400
接种数
30
34
35
32
细菌生长情况
菌落布满叶片边缘
少量菌落散布叶片边缘
基本无菌落
基本无菌落
再生率//%
0.0
50.0
71.0
21.0
前人的研究中侵染时间从 30 s 到 30 min 均有采
用［21］，其差异可能源于品种基因型不同。 在菌液浓
度基本一致（OD600 nm为 0．2～0．4）的情况下，参照普通
烟草的最佳侵染时间，设计梯度为 2、5、8、11 min 进
行试验。 结果表明，侵染时间以 5 min 为宜，当侵染
时间过短时，农杆菌无法有效附着，则会降低转化
植株的阳性率，当侵染时间过长时，叶盘容易被农
杆菌污染，并可能在长时间内产生反菌现象，影响
叶盘愈伤组织的形成和绿芽的分化（图 3）。
2．4 壮芽、生根培养基的优化
2．4．1 壮芽培养基的优化 一般而言，筛选培养基
分化出的小芽在壮芽培养基中培养一段时间后，再
转入生根培养基中，更容易生根存活。 在预试验阶
段已经筛选出两种待选壮芽培养基 ， 分别为 Z1
（MS ＋1．0 mg ／ L 6 －BA ＋0．1 mg ／ L NAA ＋300 mg ／ L
Cef＋20 mg ／ L Km）和 Z2（MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋0．01
mg ／ L NAA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km）。培养 15 d
后，两种培养基中小芽的生长状况见表 5。 Z1 培养
基中小芽能够继续生长，部分带叶盘或愈伤组织的
小芽能够持续分化，形成更多的小芽，但是生根率
较低。 Z2 培养基中大部分小芽开始生根，但是根系
并不发达。 Z2 培养基生根率更高，效果更好，因此选
择 Z2 用于后续试验。
2．4．2 生根培养基的优化 采用两种生根培养基
S1（1 ／ 2 MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L
Km） 和 S2 （MS＋0．1 mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20
mg ／ L Km）。 结果表明，虽然两者的生根率都偏低，
而且生根缓慢， 但是 S2 的生根率明显高于 S1，且
S2 培养基中的小芽生长相对较快， 小芽褐化率低
（表 6），选定 S2 作为生根培养基。
2．5 转基因花烟草的分子检测
用 CTAB法提取经生根培养基筛选获得的部分
抗性单株的 DNA， 并用 PCR 扩增法进行阳性检测
（图 4）。 结果表明，在转化植株 DNA 中扩增出单一
的目的条带，大小与预测大小一致；而未转化植株
则没有，证实外源基因已转入花烟草 DNA中。 在经
生根培养获得的 35 个抗性株系中， 阳性株系为 25
个，阳性率为 71.0％。
3 小结与讨论
本研究初步建立了花烟草再生与遗传转化体
系。 与普通烟草相比，其再生率、各种植物生长调节
剂使用浓度和比例、卡那霉素敏感性浓度、筛选浓
度、侵染时间及生根率等都有差别 ［14－17］。 NAA 和 6－
BA 的浓度比例是叶片再生和芽萌发率的关键，对
于不同植物种类或品种，两者的浓度比例呈现不同
的效果。 当 NAA为 0．1 mg ／ L，6－BA为 1．5 mg ／ L时，
花烟草的诱导效果最好，再生率达 97％，平均芽数
达 8．65。 当 6－BA 不变而 NAA 浓度升高时，再生率
和平均绿芽数呈下降趋势。 相比常用的普通烟草再
生体系 0．3 mg ／ L NAA与 2．25 mg ／ L 6－BA， 其浓度
较低，6－BA 与 NAA 的比例较高 ［16］。 而与本氏烟草
再生体系 NAA 0．1 mg ／ L、6－BA 1．5 mg ／ L 的比例基
本一致，这可能与植物不同的基因型相关［15］。
在植物遗传转化过程中，所构建的载体、筛选浓
度等因素对植物的转化效率有很重要的影响 ［21，22］。
其中，载体的影响尤为重要，因不同载体其所携带
的筛选抗生素的种类不同，而试验选用的筛选抗生
素的种类在很大程度上决定了转化效率的高低。 在
表 5 两种壮芽培养基中小芽的生长状况
培养基
Z1
Z2
小芽总数
62
59
生根率//%
9.6
84.7
污染率//%
6.6
8.4
褐化率//%
16.0
5.0
表 6 不同生根培养基中的生根情况
培养基
S1
S2
小芽总数
26
26
生根率//%
30.7
73.1
污染率//%
3.8
0.0
褐化率//%
11.5
3.8
M：DNA分子量标记；1－15：被检测抗性植株；O：质粒阳性对照；
WT：野生型阴性对照
图 4 转基因植株 PCR 检测
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 O WT
500 bp
250 bp
图 3 不同侵染时间对转化效率的影响
2 5 8 11
侵染时间//min
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
出芽率
污染率
数
值
//%
丁海琴等：花烟草再生与遗传转化体系的建立 5387
湖 北 农 业 科 学 2016 年
有关烟草属转化的报道中，大部分遗传转化试验采
用以卡那霉素为筛选抗生素的载体，筛选效果良
好［14，16，17］。 本研究采用以卡那霉素为筛选抗生素的
载体，获得卡那霉素最适筛选浓度为 20 mg ／ L，与普
通烟草相比，其对卡那霉素的敏感性较高，筛选浓
度较低。 此外，采用头孢霉素为抑菌试剂，获得适宜
抑菌浓度为 300 mg ／ L。与普通烟草使用的 400 mg ／ L
相比，浓度偏低［16］。
在筛选壮芽、生根培养基的试验中，低浓度的
NAA 和 6－BA 促进小芽在壮芽培养基上产生部分
根系，全 MS 营养比 1 ／ 2MS 营养供给更有利于植株
产生发达的根系。 一般而言，转基因植株会因难以
生根而较难存活，会在一定程度上阻碍试验的整体
进展，也会降低遗传转化体系的稳定性 ［21］。 在烟草
属的遗传转化中较理想繁荣其生根率和移栽存活
率达到了 90％以上［17］，而本试验的 2 种生根培养基
中植株的生根率都相对较低，对生根培养基以及提
高移栽成活率需要进一步研究。
本研究初步建立了花烟草再生与遗传转化体
系。 在再生体系中， 适宜组合为 0．1 mg ／ L NAA 与
1．5 mg/L 6－BA。 在遗传转化体系中，卡那霉素敏感性
浓度为 20 mg/L，抑菌抗生素头孢霉素为 300 mg/L，在
菌液侵染浓度 OD600 nm为 0．2～0．4 时， 适侵染时间为
5 min。 最适筛选培养基为 MS＋0．1 mg ／ L NAA＋1．5
mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km，最适壮芽
培养基为 MS＋0．01 mg ／ L NAA＋0．1 mg ／ L 6－BA＋300
mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km，最适生根培养基为 MS＋0．1
mg ／ L 6－BA＋300 mg ／ L Cef＋20 mg ／ L Km。 获得的生
根苗经炼苗移栽后存活 35个株系，用 CTAB 法提取
植物组织 DNA，经 PCR检测初步证实外源基因已转
入植物组 DNA 中，本研究为后续的 MYB 基因功能
验证奠定了基础。
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