全 文 ：　　收稿日期:2003-01-08;修订日期:2003-09-20
　　基金项目:北京市农业应用新技术重点实验室资助
　　作者简介:王桂兰 , 女 , 1964年出生 , 副研究员 , 从事植物组织培养研究工作
长寿花组织培养与人工种子的研究
王桂兰 , 陈　超 , 田立民 , 崔瑞生
(唐山师范学院生物科学技术系 , 河北唐山 063000)
摘要:笔者初步研究了长寿花人工种子的制备 , 包括胚性愈伤组织及胚状体的诱导 、 人工种子的包埋和萌
发。胚性愈伤组织诱导的最适培养基为:MS+2 , 4-D 2 mg/ L + BA 0.2 mg/ L+蔗糖 30 g/ L+琼脂 6 g/ L;
胚状体诱导的最适培养基为:MS + BA 2 mg/ L + NAA 0.2 mg/ L + 活性炭 4 g/ L+蔗糖 30 g/ L+ 琼脂
6 g/ L;用无激素 MS 培养基配制的 4%海藻酸钠溶液包埋胚状体 , 并用 2%的 CaCl2·2H2O 溶液作聚胶化因
子 , 制成人工种子;将人工种子在无激素的 MS 固体培养基上萌发 , 萌发率达 96%。利用石蜡切片法对胚状
体的发生发育过程进行了观察。
关　键　词:长寿花;胚性愈伤组织;胚状体;人工种子;萌发
中图分类号:S68　　文献标识码:A　文章编号:1002-3186(2003)04-0299-03
Studies on Tissue Culture and Artificial Seeds of Kalanchoe bossfeldiana
WANG Gui-Lan ,CHEN Chao ,TIAN Li-Men ,CUI Rui-Sheng
(Tangshan Teacher′s College , Hebei Tangshan 063000)
Abstract:The study aimed at production of the Kalanchoe flammea′s artificial seed , including the select ion of
embryonic callus , the inducement of embryoid , embedding and sprouting of artificial seed .During inducing
embryonic callus the optimum medium was MS +2 ,4-D 2 mg/L +BA 0.2 mg/ L.During the inducting of
embryoid , the culture mediums with dif ferent regulator concentrat ions w ere used , finally the culture medium
w ith the highest of inducement f requency w as MS +BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L+ active carbon 4 g/ L.
In making artificial seed , sodium alginate in 4% concentration w as used as embedding agent , and CaCl2·
2H2O in 2% consistency as gel assembled factor.The sprouting rate of artificial seed on M S without regula-
tor is up to 96%.The appearance and grow ing of embryoid w ere observed through paraffin slices of callus.
Key words:Kalanchoe f lammea;embryonic callus;embryoid;artificial seed;sprouting
　　长寿花(Kalanchoe bossfeldiana Stapf),又称矮生伽蓝菜 、圣诞伽蓝菜 、寿星花 ,为景天科多年生短日
照植物 ,株高 10 ～ 30 cm ,茎直立多分枝 ,叶片肉质交互对生 ,长圆形 ,深绿色有光泽 ,叶缘有波状锯齿 ,圆
锥状聚伞花序。有红 、粉 、黄 、白等多种花色 ,花朵细密拥簇成团 ,整体观赏效果甚佳 ,花期 1-4月 ,是优
良的室内观赏花卉。但其一般不结种子靠扦插及组培繁殖[ 1-2] 。笔者研究了长寿花胚性愈伤组织及胚
状体的诱导 ,并对其发生与发育过程进行了组织细胞学观察 ,对人工种子制备 、人工种子萌发成苗进行了
试验 ,以期为进一步开展长寿花人工种子的应用提供参考 ,尚未见相关的报道。
1　材料和方法
1.1　试验材料　温室中生长的长寿花的叶片 。
第 18卷　第 4期
2003 年 10月
北　京　农　学　院　学　报
JOURNAL OF BEIJING AGRICU LTU RAL COLLEGE
Vol.18 , No.4
Oct., 2003
DOI :10.13473/j.cnki.issn.1002-3186.2003.04.016
1.2　方法及过程　取长寿花植株幼叶 ,流水冲洗 0.5 h以上 ,用 70%酒精消毒 30 s ,再用 0.1%升汞消毒
5 min ,无菌水冲洗 4 ～ 5次 。将叶切成 1 cm2的小块 ,接种于胚性愈伤组织诱导培养基:MS + 2 , 4-D
2 mg/L +BA 0.2 mg/L 上 ,再将淡黄色胚性愈伤组织转接到①MS +BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L +
活性炭4 g/L ;②MS +BA 1 mg/ L+NAA 0.1 mg/L +活性炭 4 g/ L;③MS +活性炭4 g/L;④MS +BA
2 mg/L+NAA 0.2 mg/ L;⑤MS +BA 1 mg/L +NAA 0.1 mg/L 等20种胚状体诱导培养基上。体胚的
包裹采用滴注法 ,即用 MS的液体培养基配制 4%的海藻酸钠 ,并配制 2%氯化钙(CaCl2·2H2O)水溶液 ,
将两者灭菌。在解剖镜下挑取成熟的胚状体置于海藻酸钠溶液中 ,再用无菌滴管逐个吸起滴入氯化钙水
溶液中进行固化 ,制成人工种子[ 3] 。将制备好的人工种子接种于无菌的 MS 的固体培养基上 ,使其在无
菌环境下萌发。以上各种培养基中均加入 3%蔗糖和 0.6%琼脂粉 , pH 为 5.8。接种后置于培养室中培
养 ,培养温度(25±2)℃,光照强度 2000 lx ,光照时间 14 h/d 。用 Motic数码显微镜对淡黄色愈伤组织进
行观察照相。挑选带有各阶段胚状体的愈伤组织 ,用卡诺固定液固定 ,常规石蜡制片法连续切片 ,切片厚
度 8μm ,番红染色观察 ,用 Nikon LABPHOTO Ⅱ型研究显微镜进行观察照相 。
2　结果与讨论
2.1　胚性愈伤组织的诱导　经试用不同配方培养基 ,结果显示培养基 MS + 2 , 4-D 2 mg/L +BA
0.2 mg/ L+蔗糖 30 g/L+琼脂 6 g/L pH 为 5.8诱导胚性愈伤组织效果最好。外植体接种 15 d左右 ,
膨胀变厚 ,边缘出现白色绒状物质 ,随后愈伤组织开始在切口处出现 ,随时间的延长叶片的厚度可达到原
来的 2 ～ 3倍。愈伤组织长出后 ,将其剥下转接到继代培养基上培养 。挑取质地松 、呈颗粒状的淡黄色胚
性愈伤组织继代培养在相同配方的培养基上即可获得大量的胚性愈伤组织(图版-7)。经愈伤组织压片
观察 ,胚性愈伤组织细胞呈圆形且形状规则 ,有许多细胞排列紧密的小细胞团(图版-1 ～ 3)。2 ,4-D浓度
过高或过低都不利于胚性愈伤的诱导 ,在胚性愈伤的诱导中 ,添加一定浓度的 BA是必要的。
2.2　胚状体的诱导及发生发育过程的观察　胚状体诱导过程中先后试验了 20种培养基 。将胚性愈伤
组织接种到胚状体诱导培养基上 ,首先愈伤组织由淡黄色变为褐色 , 14 d 便有胚状体长出(图版-8)。
38 d进行统计 ,发现诱导速度最快 ,频率最高的是①号培养基 ,其每克胚性愈伤组织有 185个胚状体 。
②、③号培养基也诱导出较多胚状体 ,但数量较①号少 , ④、⑤号和试验的其他培养基有极少或没有胚状
体的发生 。分析试验结果认为活性炭对胚状体诱导有重要的作用 ,激素的存在对胚状体的发生和发育都
有促进作用。
胚性愈伤的组织细胞学观察表明(图版-4 ～ 6),胚状体起源于愈伤组织中的单个胚性细胞。胚性细胞的
细胞质浓厚 ,染色深 ,细胞核大而圆。胚性细胞进行多次分裂 ,形成小细胞团 ,历经多细胞胚 、球形胚 、心形
胚 、子叶胚 ,最后发育成熟 ,发育过程与合子胚相似 ,胚状体具有胚芽和胚根两极 ,胚轴很短。胚状体与愈伤
组织无特殊结构相连易分离 ,胚状体均为单个离生 ,无复合胚状体现象 ,这对人工种子的包埋是很有利的 。
2.3　人工种子的制备与萌发　制备人工种子时 ,应选择胚状体成熟或刚开始萌发但未显著伸长的时期
进行包埋(图版-9)。包埋时吸管口径的大小直接决定人工种子的大小和人工种皮的厚薄 ,太厚胚状体不
易萌发 ,太薄人工种子难于成为圆形 ,该试验显示能将胚状体完全包住刚好形成圆形人工种子为宜 。离
子交换固化的时间影响种皮的韧性 ,间接影响人工种子的萌发速度。结果显示 ,反应 20 min后 ,用无菌
水终止反应形成的人工种皮较为合适。人工种子在萌发培养基上 ,光照培养约 10 d以后 ,胚芽变为深绿
色 ,胚根和胚芽开始突破人工种皮 ,发育成苗 。人工种子萌发成苗的培养基利用两种处理:a.MS +蔗糖
30 g/L +琼脂 6 g/L ,pH 为 5.8;b.MS +蔗糖 30 g/L+琼脂 6 g/ L +活性炭 4 g/L ,pH为 5.8。通过对
萌发过程进行观察 ,发现两种培养基有显著差异。人工种子在无激素的 MS 固体培养基上萌发 ,萌发速
度快 ,萌发率高 ,达 96%以上 ,而且萌发后小苗生长正常(图版-10 ～ 12)。在含活性炭的培养基上 ,人工种
子萌发迟缓且生长缓慢。不太成熟的胚状体在人工种子内逐渐变黄不能萌发。这说明活性炭对胚状体
的诱导有重要作用 ,但对胚状体的进一步发育可能有抑制作用。从萌发结果看 ,制备人工种子应选择成
熟的胚状体 ,未成熟的胚状体在人工种子内 ,可能由于呼吸代谢激素水平变化等方面的原因 ,不能进一步
300　 北　京　农　学　院　学　报 第 18 卷
的发育 ,因此不能萌发。
参考文献:
[ 1 ] 　韦三立.花卉组织培养.北京:中国林业出版社 , 2001
[ 2 ] 　桂耀林.植物人工种子的研制 ,植物体细胞胚胎发生和人工种子.北京:科学出版社 , 1990
长寿花组织培养与人工种子的研究
图版说明　图版 1.胚性愈伤组织细胞分裂 , 1200X;图版 2-3.胚性愈伤组织细胞分裂形成的小细胞团 , 600X;图版 4.胚状体球形胚阶段 ,
100x;图版 5.胚状体心形胚阶段, 40x;图版 6.胚状体成熟胚阶段 , 40x;图版 7.诱导出的胚性愈伤组织;图版 8.胚状体诱导;图版 9.制备
出的人工种子;图版 10-11.人工种子萌发;图版 12.人工种子萌发后形成的丛生苗
　2003 年第 4 期 王桂兰 等:长寿花组织培养与人工种子的研究 301