全 文 ：长寿花高繁殖组培体系及瓶外生根技术
刘红美 , 夏开德 , 方小波 , 杨苏文　(贵阳医学院医学生物技术教研室 ,贵州贵阳 550004)
摘要　[目的 ]建立长寿花高繁殖的组培体系和瓶外生根技术 ,促进长寿花工厂化生产。 [方法 ]选用长寿花叶片和茎段作为外植体 ,在
加有 6-BA1.00mg/L和NAA0.20mg/L培养基上培养诱导出芽丛 ,再将芽丛转接到继代增殖培养基 ,调节不同外源激素配比获得长寿
花高繁殖组培体系的最佳培养基组合。 [结果]在MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L+GA3 0.10mg/L的培养基组合中 ,诱导丛芽
增殖率达到 95.35%,增殖倍数达到 20倍以上 ,试管苗生长势好。利用海绵作为载体进行瓶外生根 ,生根率达到 95.00%以上 ,移栽苗
成活率达到 100%。 [结论]利用海绵作为载体进行试管苗瓶外生根是完全可行的。
关键词　长寿花;茎段;高倍繁殖;瓶外生根;海绵
中图分类号　S682.3　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)12-06112-04
HighPropagationandTissueCultureSystemandOutside-tubeRootingTechnologyofKalanchoeblossfeldiana
LIUHong-meietal　(DepartmentofMedicalBiotechnology, GuiyangMedicalCollege, Guiyang, Guizhou550004)
Abstract　 [ Objective] Theresearchaimedtodevelopahighpropagationsystemandoutside-tuberootingtechnologyofKalanchoeblossfeldi-
anaandpromoteitsfactoryproduction.[ Method] ThesteminternodesandtheyoungleavesobtainedfromtheplantsofKalanchoeblossfeldi-
anawereusedasexplantsandculturedonMSmediumsupplementedwith1.00mg/L6-BAand0.20mg/LNAAtoinduceclumybuds, the
propagationofbudclustersinductionwereconductedonthemediasupplementedwith6-BAandNAAculturemedium.Thenthebudswere
transferredtosubculturemediumwithdiferentexogenoushormonetogetahighmicropropagationsystem.[ Result] Theoptimumbudsinduc-
tionmediumwasMS+6-BA0.50mg/L+NAA0.10mg/L+GA3 0.10mg/Landtheinductionratecanreach95.00%.Thepromeratefre-quencywas20andtheplantletswerestrong.Whenspongewasusedasacarrierfortheoutside-tuberootagetechnology, therootingratewasup
to95.00% andthetransplantsurvivalpercentwas100%.[ Conclusions] Spongeasavectorfortheoutside-tuberootagetechnologywascom-
pletelyfeasible.
Keywords　 Kalanchoeblosfeldiana;Stemsegment;Highpropagationsystem;Outside-tuberootingtechnology;Sponge
　　长寿花(Kalanchoeblosfeldiana)是一种市场需求量非常
大的观赏花卉 ,扦插繁殖远远不能满足市场需要 [ 1-7] 。基于
此 ,许多学者对其进行了组织培养研究 ,其试验基本流程是
先进行愈伤组织的诱导 、再进行植株分化。但通过愈伤组织
途径繁殖的再生植株 ,变异频率较高 ,不利于品种特性的保
持 。因此 ,研究不经过愈伤组织途径的再生方式 ,即直接诱
导芽的再生途径 ,对于长寿花的快速繁殖具有重要生产
价值。
试管苗瓶外生根技术把生根与驯化有机结合起来 ,能有
效缩短育苗周期 ,节约生产成本 ,提高了移栽成活率 ,是一项
值得应用与推广的技术 [ 8-9] 。目前 ,该技术已在果树 [ 8 , 10] 、林
木 [ 11-12] 、魔芋 [ 13]等的快繁体系中得到应用 ,但还未见长寿花
试管苗瓶外生根的相关报道 。笔者采用带腋芽茎段和叶片
为外植体 ,探索长寿花直接诱导芽的高繁殖组培体系 ,同时
也对长寿花组培苗瓶外生根技术进行研究 ,以促进长寿花的
工厂化生产 ,满足市场需求。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验材料。无病虫害的优质重瓣长寿花 ,购于花卉
市场。
表 1　不同外源激素配比对丛芽增殖的影响
Table1　 Efectofdifferentexogenoushormonecombinationsontheproliferationofclusterbud
培养基号No.ofmedium
外源激素∥mg/LExogenoushormones
6-BA NAA GA3
接种数∥株Numberofinoculation
污染数∥株Numberofpolution
丛芽增殖数∥株Numberofclusterbud sproliferation
生长势Growthpotential
增殖率∥%Prolifer-ationrate
I 1.00 0.10 - 16 1 8 + 53.33
II 0.50 0.10 - 16 - 13 +++ 81.25II 0.20 0.05 - 20 - 18 ++ 90.00IV 2.00 0.10 0.10 20 - 17 + 85.00V 1.00 0.10 0.10 20 - 18 ++ 90.00VI 0.50 0.10 0.10 20 - 19 +++ 95.00VII 0.20 0.05 0.10 20 - 16 + 80.00VII 0.20 0.05 0.50 20 - 13 + 65.00IX 0.20 0.05 1.00 19 - 14 + 73.68X 0.20 0.05 1.50 20 1 12 + 60.00XI 0.20 0.05 2.00 20 - 16 ++ 80.00
　注:增殖率 =诱导丛芽增殖数 /未污染接种丛芽数 ×100%;+,差、++,一般、 +++,较好。下同。
　Note:Theproliferationrate=Numberofclusterbud sproliferation/thenumberofuncontaminatedclusterbuds×100%;+standsforbad;++standsfor
ordinary, +++standsforbeter.Thesameasbelow.
基金项目　贵州省优秀科技教育人才省长基金项目(S2004-17);贵州省
高层次人才科研条件特助(Q2005-4);贵阳医学院青年基金
项目(K2007-48)。
作者简介　刘红美(1975-), 女, 贵州遵义人 ,博士 ,副教授 ,从事植物
生物技术方面的研究。
收稿日期　 2010-01-25
1.1.2　培养基 。
1.1.2.1　芽诱导培养基。MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.20
mg/L。
1.1.2.2　继代增殖培养基。以 MS为基本培养基 ,选取不同
浓度的 6-BA、NAA、GA3外源激素进行配比(表 1),从中筛选
责任编辑　朱新秀　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(12):6112-6115
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.12.139
出繁殖倍数高的最佳激素组合继代增殖培养基 。
1.1.2.3　生根培养基。分别以 MS和 1/2MS为基本培养基 ,
添加不同浓度的 NAA,以及 NAA和 6-BA的不同浓度配比
(表 2),从中筛选出生根率高的最佳生根培养基。以上培养
基均附加蔗糖 3%,琼脂 0.45%, pH值 5.80 ～ 5.95,并在 121
℃下灭菌 20 min。
表 2　不同外源激素配比对芽苗生根的影响
Table2　Effectsofdifferentexogenoushormonecombinationontherootingofshoots
培养基代号
No.ofmedium
基本培养基
Basalmedium
6-BA
mg/L
NAA
mg/L
接种芽数∥株
NumberofInoculatedshoots
生根芽数∥株
Numberofrootingshoots
平均根数∥株
Averagerootnumber
生长势
Growthpotential
① 1/2MS - 0.10 40 40 18 +++
② 1/2MS - 0.20 40 40 20 ++
③ MS - 0.10 40 40 11 ++
④ MS - 0.20 40 40 9 +
⑤ MS 0.05 0.10 40 40 13 ++
⑥ MS 0.05 0.20 40 40 13 +
1.2　方法
1.2.1　外植体消毒与接种。剪取幼嫩茎段和叶片 ,流水冲
洗 ,再置于超净工作台上进行常规消毒 。即先用 75%的乙醇
浸泡 0.5min,用灭菌水冲洗 2次。然后用 2%的次氯酸钠消
毒 3min,灭菌水洗 2次 ,再用 2%的次氯酸钠消毒 3min,用灭
菌水冲洗 5次 ,放在灭菌滤纸上吸去表面水分。把已灭菌的
叶片剪成 1.0cm2大小的小块 ,茎段切成带腋芽段 ,约 1.0cm
长 ,接种到诱导芽的培养基上 。放置于培养室温度(25 ±
2)℃,光照强度 1 800 ～ 2 000lx,光照时间 12 h/d培养。 40d
后统计污染数和诱导率。
1.2.2　继代培养 。将诱导出的芽丛切成大小相当的小块分
别接种于含不同激素组合的继代增殖培养基(表 1)中进行培
养;统计污染数 ,丛芽增殖块数和生长势 ,筛选出最佳不同外
源激素配比的高繁殖培养基。
1.2.3　生根培养 。
1.2.3.1　瓶内生根法 。将生长健壮的芽丛取出分离出单
株 ,转接到生根培养基上(表 3)诱导生根;统计生根芽数 、平
均根数和生长势。
1.2.3.2　瓶外生根法 。将海绵切成 11.0cm×6.0 cm×4.0
cm大小 ,并在每块海绵体上切出深 2.5cm的小口 ,每条小口
之间的间距为 2.0cm左右;并将其放置到营养液中浸泡 2d,
即可将生长健壮的组培单株试管苗以一定的株距接种于海
绵小口中 ,置于室温下培养并保持海绵湿润 。
2　结果与分析
2.1　植株茎段及叶片外植体芽诱导培养　将茎段和叶片
分别接种各 50株到芽诱导培养基上 , 13d后 ,叶片增厚 ,表面
变得粗糙并未诱导出芽;茎段插入培养基部分膨大并诱导出
腋芽(图 1)。再培养 35 d后 ,叶片在切口处也诱导出不定
芽 ,但数量只有少数几个。随着培养时间的延长 ,茎段的腋
芽不断增殖 ,进而形成了芽丛。
　　40 d后 ,统计的污染数和诱导率如表 3所示。
　　由表 3可知 ,长寿花组培快繁最佳的外植体是腋芽茎
段 ,不仅诱导出芽的时间短 ,而且有较高的诱导率 ,达 95%以
上 。分析原因可能是 ,一方面未分化出的腋芽在较低的外源
激素刺激下被启动 ,另一方面培养基中的外源激素浓度比有
利于腋芽的诱导。叶片诱导出芽效果差 ,时间长 ,诱导率低。
2.2　丛芽继代增殖培养　将茎段上诱导出的芽丛切成大小
图 1　茎段诱导出的腋芽
Fig.1　Theaxilarybudinductionfromstemsegments
相当小块分别接种于含不同激素组合的继代增殖培养基中
进行培养 ,考察不同激素组合的培养基对丛芽增殖的影响 ,
结果如表 1所示。
表 3　不同类型外植体诱导出芽结果
Table3　Theinductionresultsofbudsfromdifferenttypesofexplant
外植体类型Typesofexplant
接种数∥株Numberofinoculation
污染数∥株Numberofpolution
诱导出芽的外植体数∥株Numberofexplantswithinducedbud
诱导率∥%Inductionrate
叶片 50 10 9 21.95
茎段 50 7 38 95.35
　注:诱导率 =出芽数 /未污染外植体数×100%。
　Note:Inductionrate=numberofbuds/ thenumberofuncontaminatedex-
plants×100%.
　　结果表明 , 11种培养基均能诱导丛芽的增长 ,发生反应
的丛芽增殖块 、增殖倍数都较高 ,它们的区别在于总体发生
反应的株数和生长势 。有的丛芽增殖块发生反应的数目较
多 ,但是生长势不佳 ,大多是一些无规则的芽 ,对后续生根得
到健壮的小苗不利;表 1中IV、VI和 IX3组的增殖率都大于
70.00%,但是它们的生长势欠佳。在 VI～XI的 5组中 6-BA
和 NAA的配比一样 ,只有不同浓度的 GA3对丛芽增殖起作
用 ,增殖率都在 60.00%～ 80.00%,增殖倍数也高 ,但是它们
的芽苗矮短 、密集 ,生长势差 ,并有大量气生根等不良生长现
611338卷 12期　　　　　　　　　　　　　　　　刘红美等　长寿花高繁殖组培体系及瓶外生根技术
象(图 2);在 XI组 GA3浓度达到 2.00 mg/L时生长势一般 ,
会出现生长过旺 ,茎明显偏细并有大量气生根等不良生长现
象;在 VI组诱导丛芽增殖率为 95.00%,且生长势较好 ,繁殖
倍数高达 20倍以上。所以 , VI组培养基为高繁殖倍数的最
佳培养基组合。
注:左图为矮短 ,生长势差;右图为大量白色气生根。
Note:Left,shortplantletwithpoorgrowth;Right, alargenumberofwhiteaerialroot.
图 2　异常现象
Fig.2　Abnormalphenomenon
2.3　试管苗生根培养
2.3.1　瓶内生根法。将所诱导的芽长到 1.5 ～2.5cm时 ,将
生长健壮的芽丛取出分离出单株 ,转接到生根培养基上诱导
生根。培养 8d后 ,芽苗基部膨大;13d部分可见白色根尖长
出 ,不产生愈伤组织;30 d后根长可至 1.0 cm左右 ,但生根
的效果有所不同(表 2)。
　　由表 2可知 ,每一组培养基都能诱导根的生长 ,诱导率
均为 100%。在以 1/2MS为基本培养基中诱导芽苗生根率
较高 ,其中在附加 0.10 mg/LNAA的培养基中诱导的根 ,生
长速度快 ,根数及粗度适宜(图 3),植株和根的生长势好;而
在附加较高浓度 NAA的培养基中诱导的根较细短 ,生长势
一般。在以 MS为基本培养基中 ,附加低浓度 6-BA培养基
能较小范围内提高每颗芽苗根的数量 ,植株和根的生长势一
般 。综合平均根数和生长势考虑 ,得出以附加 0.10 mg/L
NAA外源激素的 1/2MS基本培养基为最佳生根培养基。
图 3　瓶内生根
Fig.3　 Inside-tuberooting
2.3.2　瓶外生根法。将生长健壮带 3对叶的组培苗取出 ,
去掉下面一对叶 ,按一定的株距插入处理过的海绵小口中
(图 4),放置于室温下培养并保持海绵湿润 , 9 d左右开始生
根 ,经过 25d后根不断增多增长(图 5),生根率可达 95%。
试验表明 ,海绵是一种适合组培苗瓶外生根的载体。
图 4　瓶外生根
Fig.4　Outside-tuberooting
2.4　试管苗移植　将蛭石和珍珠岩以 1∶2混匀 ,用 1/1 000
的百菌清水溶液喷洒均匀并密封保存 , 10 d后打开封口敞开
2d,即可使用。瓶内生根苗移栽前需在室温下打开瓶口 ,炼
苗 2 ～ 3 d,以使小苗逐渐适应外界环境 ,从培养瓶中取出小
苗 ,洗净苗根上的培养基 ,分别移栽到装有基质的穴盘中培
养;瓶外生根苗直接移栽到装有基质的穴盘中培养。放置于
室内培养 ,温度(25 ±2)℃,光照强度 1 800 lx,光照时间 12
h/d,保持湿度适中 , 35 d后统计成活小苗成活数和生长势
(图 6),结果见表 4。
　　由表 4可知 ,瓶外生根得到的有根小苗成活率达 100%,
而瓶内生根小苗成活率只有 81.11%。可能原因在于 ,瓶外
生根小苗是在外界环境下培养获得 ,适应外界环境的能力
强 ,比较容易成活。说明瓶外培养生根对组培苗起过渡锻炼
6114 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
图 5　瓶外生根苗
Fig.5　 Outside-tuberootingseedlings
图 6　移栽成活苗
Fig.6　Thesurvivaltransplantingplantlet
作用 ,增强了对外界环境的适应能力 ,移栽成活率高。
3　讨论
(1)利用组织培养方法繁育长寿花种苗不受季节影响 ,
具有繁殖速度快 、数量多等优点。与叶片相比 ,最好的外植
体是茎段 。增殖倍数上 , 6-BA、NAA、GA3外源激素不同配比
表 4　不同生根方法小苗移栽成活比较
Table4　Comparisonoftransplantingplantlet ssurvivalbydifferent
rootingmethods
生根方法
Rootingmethod
移栽数
Transplantnumber
成活数
Survivalnumber
成活率∥%
Survivalrate
瓶内生根 90 73 81.11
瓶外生根 90 90 100.00
影响较大 , 3者的配比直接影响芽的增殖和伸长 。该研究获
得长寿花高倍繁殖最适宜的培养基为 MS+6-BA0.50mg/L
+NAA0.10mg/L+GA3 0.10 mg/L。
　　(2)提高组培苗移栽的成活率 ,是离体繁殖的组培苗大
量应用于生产的决定条件。试验证明 ,瓶外生根技术能大大
提高组培苗移栽的成活率。
该试验基于滤纸桥瓶外生根技术易受杂菌污染和滤纸
一次性使用等缺点 ,采用海绵作为载体进行瓶外生根。结果
表明 ,利用海绵作为载体进行长寿花的瓶外生根 ,不易受到
杂菌的污染 ,而且由于海绵保水性好 ,能提供试管苗生根的
适宜环境 ,管理粗放 ,还可以重复利用 ,是一种非常好的瓶外
生根载体。
参考文献
[ 1] 李芝强 ,张荣蛰.室内花卉———长寿花 [ J].林木花卉 , 1998(5):50.[ 2] 张淑敬.长寿花栽培技术 [ J].河北农业科技 , 2002(6):30.
[ 3] 吴丽芳 ,屈云慧 ,杨春梅.长寿花的组培快繁 [ J] .云南农业科技, 2001
(4):21.
[ 4] 崔广荣 ,王彦.长寿花组织培养的研究 [ J].河南职业技术师范学院学
报, 2003(1):5l-53.
[ 5] 陈玉梁 ,支晓刚 ,张艳萍,等.长寿花叶盘离体培养及植株高效再生研
究[ J] .中国农学通报 , 2004, 20(5):33-34.
[ 6] 陈超,王桂兰,田立民,等.长寿花胚性愈伤组织的诱导及胚状体再生
[ J].园艺学报, 2004, 31(2):249-252.
[ 7] 黄双龙 ,赖钟雄 ,林秀莲,等.红花长寿花愈伤组织的诱导和植株再生研究[ J].农业生物技术科学, 2006, 22(2):48-52.
[ 8] 孙仲序 ,刘静,王玉军,等.果树组培苗瓶外滤纸桥生根技术研究 [ J].
园艺学报, 2001, 28(4):345-347.
[ 9] 徐振华 ,王学勇 ,李敬川,等.试管苗瓶外生根的研究进展 [ J].中国农
学通报 , 2002, 18(4):85-88.
[ 10] 范志强,刘玲艳,谭志坤,等.苹果砧木M9组培苗幼苗瓶外生根研究
[ J].山东林业科技 , 2005(6):13-14.
[ 11] 范志强,付瑞 ,陈爱美 ,等.黄金槐组培苗的瓶外生根试验[ J].山东林
业科技, 2005(5):19-20.
[ 12] 黄卓忠,严华兵.试管苗瓶外生根技术 [ J] .广西农业科学, 2007, 38(2):124-126.
[ 13] 刘贵周,谢世清,赵庆云,等.优质魔芋组培苗瓶外生根的研究 [ J] .西
南农业学报, 2005(4):62-63.
(上接第 6089页)
[ 31] 刘昀,李冉辉,郑易之,等.大豆PM2蛋白及 22氨基酸结构域可提高
烟草植株耐盐性 [ J].深圳大学学报:理工版, 2007, 24(1):95-101.
[ 32] 戴秀玉 ,王忆琴 ,杨波.大肠杆菌海藻糖合成酶基因对提高烟草抗逆性能的研究 [ J].微生物学报, 2001, 41(4):427-431.
[ 33] ESPINOSA-RUIZA, BELLESJM, SERRANOR.Arabidopsisthaliana
AtHAL3:Aflavorproteinrelatedtosaltandosmotictoleranceandplant
growth[ J].ThePlantJournal, 1999, 20:529-539.
[ 34] 李自超 ,张新春 ,张丽.转mtlD基因旱稻的耐盐性研究 [ J] .中国农业
大学学报 , 2004, 9(6):38-43.
[ 35] 吴科瀛,梁玉玲.烟草 BY2细胞培养及盐胁迫研究[ J] .畜牧与饲料科
学, 2009, 30(4):8-9.
[ 36] 陈瑞利,胡俊红,冯保江.盐胁迫对黄瓜幼苗光合作用的影响[ J].畜
牧与饲料科学 , 2009, 30(4):12-14.
[ 37] 白春利,阿拉塔,塔娜 ,等.盐分胁迫下乌拉特肋脉野豌豆种子萌发特性的研究 [ J].畜牧与饲料科学, 2008, 29(3):7-10.
611538卷 12期　　　　　　　　　　　　　　　　刘红美等　长寿花高繁殖组培体系及瓶外生根技术