全 文 ：大孔树脂分离纯化松潘乌头总生物碱研究
王小芳， 张喜民* ， 邓月婷， 卢 英， 吴秀琴， 贾继禧
(甘肃陇神戎发药业股份有限公司，甘肃 兰州 730101)
收稿日期:2013-02-15
基金项目:甘肃省战略性新型产业关键核心技术研究与开发专项 (甘发改高技 ［2011］ 1590 号;甘财建 ［2011］ 309 号)
作者简介:王小芳 (1982—)，女，工程师，硕士，主要从事新药开发与研究工作。Tel:13919189739，E-mail:duxing1025@163. com
* 通信作者:张喜民 (1956—) ，男，正高级工程师，主要从事新药开发与研究工作。Tel: (0931)6278946
摘要:目的 优选大孔树脂分离纯化松潘乌头总生物碱的工艺条件。方法 采用响应面分析法，以松潘乌头总生物碱的
量为考察指标。结果 最佳工艺条件:上样液 pH为 5. 0、上样液质量浓度为 0. 2 g /mL、洗脱液乙醇体积分数为 75%，
ＲSD为 1. 78%。此条件下得到松潘乌头总生物碱含有量为 22%。结论 优选得到的工艺稳定可行，适合工业大生产。
关键词:松潘乌头;总生物碱;大孔树脂;纯化工艺
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)04-0860-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 04. 045
松潘乌头 (Aconitun sungpanense Hand-Mazz)［1］为毛茛科
乌头属植物，主要分布在甘肃、青海、四川、陕西、宁夏、
山西等地。别名火焰子、蔓乌药、羊角七、藤乌药。民间用
于治疗跌打损伤、类风湿性关节炎引起的疼痛和红肿等症
状［2-5］。本课题组在前期对其化学成分及药效学方面进行了
试验研究，发现松潘乌头的有效成分总生物碱，表现出较强
的镇痛、抗炎作用。为了深入研究开发松潘乌头的可利用价
值，以富集确定有效部位为目的，本实验采用大孔树脂对其
总生物碱提取纯化工艺进行研究，提高其生物碱量，为下一
步制剂研究以及新药申报等方面的工作提供研究依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 松潘乌头 (Aconitun sungpanense Hand-Mazz)采
自甘肃天水，由甘肃林业职业技术学院任继文教授鉴定。
1. 2 仪器及试剂 KQ-500M 超声波清洗仪 (东莞市科桥
超声波设备有限公司);TU-1901 紫外分光光度计 (北京普
析通用仪器有限责任有限公司) ;YP502N 电子天平 (上海
菁海仪器有限公司);乌头碱对照品 (中国食品药品检定
研究院) ;氨水 (分析纯) ;硫酸 (分析纯) ;氢氧化钠
(分析纯) ;三氯甲烷 (分析纯) ;乙醚 (分析纯) ;溴甲酚
绿 (分析纯);冰醋酸 (分析纯) ;无水硫酸钠 (分析纯) ;
D101、AB-8、X-5、D-001 (安徽三星树脂公司) ;NKA-9
(天津波鸿树脂科技有限公司)。
2 方法与结果
2. 1 松潘乌头总生物碱的制备 称取粉碎后过 60 目筛的
松潘乌头药材 200 g，置提取设备中，用 10%碳酸钠溶液润
湿，拌匀，放置 4 h，加入 75%的乙醇 1 000 mL，充分搅
拌，功率为 500 W 超声提取［6］30 min，重复操作 3 次，合
并提取液，减压回收乙醇得松潘乌头总生物碱浸膏。
2. 2 总生物碱测定 ( 酸性染料比色法) ［7-8］
2. 2. 1 乌头碱对照品溶液的制备 精密称取乌头碱对照品
0. 029 8 g，置 100 mL量瓶中，用 0. 01 mol /L盐酸溶解并稀
释至刻度，即得乌头碱对照品质量浓度为 0. 298 mg /mL。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 精密称取“2. 1”项制备的松
潘乌头总生物碱浸膏 2 g，置 100 mL量瓶中用 0. 01 moL的
盐酸溶解并稀释至刻度，即得松潘乌头总生物碱质量浓度
为20 mg /mL。
2. 2. 3 测定波长的选择 精密吸取乌头碱对照品溶液及供
试品溶液各 1. 0 mL，置于具塞试管中，加氨试液 0. 5 mL，
用乙醚 ∶ 三氯甲烷 (体积比 3 ∶ 1)4 mL提取两次，合并提
取液，蒸干，残留物加 0. 01 mol /L 盐酸 1. 0 mL 溶解，加
pH 3. 05 的醋酸盐缓冲液 5. 0 mL 与溴甲酚绿指示液
2. 0 mL，摇匀，再精密加人三氯甲烷 8. 0 mL，充分振摇，
静置，分取三氯甲烷层，加无水 Na2SO4 脱水后，以
0. 01 mol /L盐酸同法作空白。分别在 200 ～ 800 nm 波长范
围内进行扫描。结果表明，乌头碱对照品和供试品溶液在
416 nm处均有最大吸收，故选择 416 nm为检测波长。
2. 2. 4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 0. 1、0. 25、
0. 5、0. 75、1. 0 mL，置于具塞试管中，再分别补加
0. 01 mol /L的盐酸 0. 9、0. 75、0. 5、0. 25、0 mL 之后，按
照波长选择的方法，以 0. 01 mol /L 盐酸同法作空白在
416 nm下测定吸光度。以乌头碱对照品质量浓度为横坐标，
吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y =0. 191 2x －
0. 008 8，r2 = 0. 999 8，线性范围为 0. 029 8 ～ 0. 298 mg /mL。
2. 2. 5 精密度试验 精密量取 0. 298 mg /mL乌头碱对照品
溶液 1. 0 mL，置于具塞试管中，参照“2. 2. 4”项下方法
操作，于 416 nm处测定吸光度，连续测定 6 次。结果 ＲSD
为 0. 73%，说明仪器所测数据准确可靠。
2. 2. 6 重复性试验 精密称取同一批制备的松潘乌头总生
物碱浸膏 6 份，各 2 g，分别按“2. 2. 2”项下方法制备供
试品溶液，按“2. 2. 4”项下方法操作，于 416 nm 处测定
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吸光度，结果 ＲSD为 0. 89%。表明该方法重复性良好。
2. 2. 7 稳定性试验 精密吸取“2. 2. 2”项下制备的供试
品溶液 1. 0 mL，按“2. 2. 4”项下方法操作，显色后分别
在 0、5、15、25、35、45、55 min 于 416 nm 处测定吸光
度，ＲSD为 0. 75%。结果表明，该方法在 55 min内稳定。
2. 2. 8 加样回收率试验 精密吸取 6 份“2. 2. 2”项下制
备的供试品溶液各 1. 0 mL，分别精密加入 1. 0 mL 乌头碱
对照品溶液 (0. 298 mg /mL)，混匀，比色法测定吸光度。
根据回归方程计算回收率。乌头碱的平均回收率为
99. 8%，ＲSD为 2. 46%。
2. 2. 9 样品的测定 定量取上柱后的洗脱液旋转蒸干，残
留物加定量的 0. 01 mol的盐酸溶解，按上述乌头碱对照品
的处理方式进行测定。
2. 3 大孔树脂纯化松潘乌头生物碱
2. 3. 1 大孔树脂的预处理 用体积分数为 95%乙醇将树
脂浸泡 24 h，使其充分溶胀，然后用乙醇清洗至洗出液与
水混合 (体积比 1 ∶ 5)无白色浑浊后，再用大量蒸馏水洗
去乙醇，备用。
2. 3. 2 大孔树脂的筛选 通过静态吸附法对 D101、X-5、
AB-8、NKA-9及 D-001型树脂进行筛选，确定纯化松潘乌头
生物碱的树脂类型［9］。具体操作如下:精密称取 10 g 树脂
D101、X-5、AB-8、NKA-9 及 D-001，经过预处理之后分别
置于 100 mL锥形瓶中，加入过量松潘乌头生物碱提取液，
室温条件下振摇 24 h，使之充分吸附。测定吸附后松潘乌头
生物碱提取液中总生物碱的量。将静态吸附饱和的树脂，加
体积分数为 95%的乙醇溶液，在室温条件下振摇 24 h，测定
乙醇中生物碱的量。重复 3次，根据测定的结果，计算各树
脂的平均静态吸附率与解吸附率，结果见表 1。
表 1 树脂的吸附率与洗脱率
树脂型号 饱和吸附量 /(mg·g － 1) ＲSD /% 洗脱率 /% ＲSD /%
D101 31. 63 1. 04 94. 32 1. 10
AB-8 25. 05 1. 91 85. 19 0. 52
X-5 29. 78 2. 10 92. 74 1. 46
NKA-9 30. 24 1. 52 80. 79 0. 77
D-001 27. 76 1. 16 56. 16 1. 41
由表 1 可见，大孔吸附树脂 D101 的饱和吸附量及洗脱
率均优于其余树脂，因此，选择 D101 树脂进行工艺参
数考察。
2. 3. 3 单因素试验 将预处理后的 D101 树脂装入 D3. 5
cm × 30 cm的玻璃柱中，树脂填装高度为 20 cm，水洗至
无醇味。考察上样液质量浓度、上样液 pH、洗脱液质量浓
度及洗脱液 pH，对 D101 大孔树脂吸附性能及洗脱参数的
影响。
2. 3. 3. 1 上样液质量浓度的考察 将 5 份定量的松潘乌头
总生物碱提取液分别稀释成 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、
0. 50 g /mL，以 1. 5 BV /h 体积流量上样，检测采用酸性条
件下与碘化铋钾反应产生橘红色沉淀泄漏;待吸附饱和之
后测定吸附剩余液中总生物碱的量，重复 3 次，根据测定
的结果，计算各质量浓度下平均吸附量，结果见表 2。
表 2 松潘乌头生物碱提取液质量浓度对D101吸附量的影响
上样液质量浓度 /(g·mL －1) 吸附量 /(mg·g － 1) ＲSD /%
0. 10 20. 01 0. 35
0. 15 24. 93 1. 34
0. 20 29. 49 0. 86
0. 25 29. 54 1. 56
0. 50 29. 72 0. 88
表 2 表明，随着松潘乌头生物碱提取液质量浓度的增
大，D101 对松潘乌头生物碱的吸附量逐渐增加，当质量浓
度为 0. 20 g /mL，D101 对松潘乌头生物碱的吸附量达到
29. 49 mg /g，此后质量浓度增加，吸附量没有显著增加，
说明质量浓度为 0. 2 g /mL 时，D101 对松潘乌头生物碱的
吸附量已接近饱和。因此，在 D101 动态吸附松潘乌头生物
碱的实验中，最佳质量浓度为 0. 2 g /mL。
2. 3. 3. 2 上样液 pH 的考察 取 3 份等量的松潘乌头总生
物碱提取液，用氨水分别调 pH于 4、5、6 之后定容，使其
质量浓度为 0. 20 g /mL，以 1. 5 BV /h 体积流量上样，检测
采用酸性条件下与碘化铋钾反应产生橘红色沉淀为泄漏;
待吸附饱和之后测定吸附剩余液中总生物碱的量。重复 3
次，根据测定的结果，计算不同上样液 pH 下平均吸附量，
结果见表 3。
表 3 松潘乌头生物碱提取液 pH对 D101 吸附量的影响
上样液 pH 吸附量 /(mg·g － 1) ＲSD /%
4 28. 54 1. 50
5 30. 12 1. 44
6 27. 27 0. 63
表 3 表明，松潘乌头总生物碱提取液的 pH 为 5 时，
D101对松潘乌头生物碱的吸附量达到最高 30. 12 mg /g，所
以本实验选择总生物碱提取液的 pH为 5 时上样。
2. 3. 3. 3 洗脱液 pH的考察 取 4 份 0. 2 g /mL、pH5 的松
潘乌头总生物碱提取液，分别以 1. 5 BV /h 体积流量上样，
检测采用酸性条件下与碘化铋钾反应产生橘红色沉淀为泄
漏;待吸附饱和之后，用蒸馏水以 2 BV /h的体积流量对杂
质进行洗脱，再分别用 pH 为 4、5、6、7，体积分数为
95%的乙醇以 2 BV /h的体积流量对总生物碱进行洗脱，收
集洗脱液，测定洗脱液中总生物碱的量。重复 3 次，计算
其平均值，结果见表 4。
表 4 洗脱液 pH对生物碱纯化率的影响
洗脱液 pH 生物碱 /% ＲSD /% 洗脱率 /% ＲSD /%
4 19. 68 1. 45 90. 74 0. 92
5 20. 26 1. 15 92. 43 1. 17
6 22. 43 2. 02 90. 96 1. 60
7 18. 92 2. 07 91. 79 1. 71
表 4 表明，洗脱液 pH从 4 增加到 6，洗脱液中总生物
碱的量也随之增大;而 pH从 6 增加到 7，洗脱液中总生物
碱的量反之降低;随着 pH 的变化，洗脱率没有明显的变
化;因此，此实验选择洗脱液 pH为 6 进行洗脱。
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2. 3. 3. 4 洗脱液体积分数的考察 取 5 份 0. 2 g /mL、pH5
的松潘乌头总生物碱提取液，分别以 1. 5 BV /h体积流量上
样，检测采用酸性条件下与碘化铋钾反应产生橘红色沉淀
为泄漏;待吸附饱和之后用 5 BV 的蒸馏水以 2 BV /h 的体
积流量对杂质进行洗脱，再用 pH 为 6、体积分数为 40%、
50%、60%、75%、95%的乙醇以 2 BV /h的体积流量对总
生物碱进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总生物碱的
量。平行 3 组，计算平均值，结果如下表所示:
表 5 洗脱液体积分数对生物碱纯化率的影响
洗脱液体积分数 /% 生物碱 /% ＲSD /% 洗脱率 /% ＲSD /%
40 21. 78 3. 15 80. 26 1. 12
50 22. 14 2. 28 84. 91 1. 70
60 22. 35 2. 31 88. 12 1. 13
75 25. 04 2. 51 92. 48 1. 04
95 21. 98 3. 57 96. 03 0. 56
表 5 表明，体积分数为 75%的乙醇洗脱液中总生物碱
的量较高，而 40%、50%、60%、95%的洗脱液中总生物
碱含量相差不大;洗脱率随着乙醇洗脱液体积分数的增加
而增大，故确定洗脱液的体积分数为 75%。
2. 3. 4 响应面试验
2. 3. 4. 1 响应面试验设计及结果 根据单因索试验结果，
选取上样液 pH、上样液质量浓度、乙醇体积分数等 3 个因
素进行试验设计结果见表 6。
表 6 响应面实验法因素和水平
因素
水平
－ 1 0 1
上样液 pH(A) 4 5 6
上样液质量浓度(B) 0. 1 0. 2 0. 3
乙醇体积分数(C) 55% 75% 95%
2. 3. 4. 2 响应面分析方案及结果 结合单因素试验结果，
进行 BoX-Behnken 中心组合实验设计，利用 Design-Expert
7. 0 软件进行数据拟合，建立数学模型，并获得大孔树脂
D101 纯化松潘乌头总生物碱工艺的最佳条件，响应面分析
试验设计方案与试验结果见表 7。
2. 3. 4. 3 模型的建立及其显著性检验 利用 Design-Expert
7. 0 软件对表 7 试验数据进行多元回归拟合，得到生物碱
量 (Y)对上样液 pH (A)、上样液质量浓度 (B)、乙醇
体积分数 (C)的二次多项回归模型为:
Y = 222. 96 － 4. 43A － 2. 57B + 0. 45C － 5. 64AB +
5. 92AC － 0. 68BC － 31. 52A2 － 13. 97B2 － 17. 87C2
对该模型方程求一阶偏导数等于零，求出最佳条件为:
上样液 pH为 5. 0、上样液质量浓度为 0. 2 g /mL、洗脱液乙
醇的体积分数为 75%。该回归模型进行方差分析，结果见
表 8。
根据统计学相关知识对方差分析表进行分析，模型的
P ＜ 0. 000 1，模型失拟项 (P = 0. 125 5)不显著，说明可
以用该模型来分析和预测大孔树脂 D101 纯化松潘乌头总
表 7 响应面方案及试验结果
编号
A
上样液 pH
B
上样液质量浓度
C
乙醇体积分数
松潘乌头总碱 /
(mg·g － 1)
1 5 0. 3 95% 187. 65
2 4 0. 3 75% 189. 49
3 4 0. 2 95% 170. 04
4 5 0. 2 75% 227. 36
5 5 0. 2 75% 223. 94
6 5 0. 2 75% 221. 81
7 5 0. 1 95% 194. 15
8 6 0. 2 95% 179. 35
9 4 0. 2 55% 179. 64
10 5 0. 2 75% 219. 08
11 6 0. 1 75% 176. 73
12 4 0. 1 75% 180. 66
13 6 0. 2 55% 165. 26
14 5 0. 2 95% 222. 63
15 5 0. 1 55% 195. 94
16 6 0. 3 95% 163. 02
17 5 0. 3 55% 186. 73
表 8 回归模型方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性
Model 7 457. 88 9 828. 65 42. 88 ＜ 0. 000 1 ＊＊＊
A 157. 27 1 157. 27 8. 14 0. 024 6 *
B 52. 99 1 52. 99 2. 74 0. 141 7
C 1. 64 1 1. 64 0. 085 0. 779 4
AB 127. 01 1 127. 01 6. 57 0. 037 3 *
AC 140. 30 1 140. 30 7. 26 0. 030 9 *
BC 1. 84 1 1. 84 0. 095 0. 766 9
A2 4 182. 41 1 4 182. 41 216. 45 ＜ 0. 000 1 ＊＊＊
B2 821. 97 1 821. 97 42. 54 0. 000 3 ＊＊＊
C2 1 345. 25 7 1 345. 25 69. 62 ＜ 0. 000 1 ＊＊＊
Ｒesidual 135. 26 3 19. 32
Lack of Fit 98. 45 4 32. 82 3. 57 0. 125 5
Error 36. 81 16 9. 2
Total 7 593. 14
注:＊＊＊P ＜ 0. 001，＊＊P ＜ 0. 01，* P ＜ 0. 05
生物碱的工艺结果。从回归方程模型因变量的方差分析可
知:模型的一次项 A差异显著;交叉项 AB、AC差异显著;
二次项 A2、B2、C2 差异极显著，说明所选因素与响应值之
间不是简单的线性关系。依据回归方程的系数值和方差分
析表可知，在响应面的试验范围内因素的主效应关系为:
上样液 pH ＞上样液质量浓度 ＞洗脱液体积分数。
2. 3. 4. 4 响应曲面分析 由多元回归方程可以得到不同因
素对成分量影响的响应面及其等高线图。等高线图表示在
同一椭圆形的曲线上，生物碱的量是相同的。在椭圆形区
域中心，生物碱量最高，由中心向边缘逐渐降低。响应曲
面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变非常敏感，
而曲面坡度相对平缓，表明操作条件的改变对响应值的改
变会比较小。根据上述性质可以看出:上样液质量浓度与
上样液 pH，上样液 pH与洗脱液体积分数存在明显的交互
效应，而上样液质量浓度与洗脱液体积分数交互效应不明
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显。见图 1 ～图 3。
2. 3. 4. 5 最优工艺条件求取与验证 通过 Design-Expert
7. 0 软件求得大孔树脂 D101 纯化松潘乌头总生物碱的最佳
工艺条件如下:上样液质量浓度为 0. 2 g /mL，上样液 pH
为 5. 0，洗脱液体积分数为 75%，在此条件下进行 6 次验
证试验，则松潘乌头总生物碱的平均含有量为 223 mg /g，
ＲSD为 1. 78%。表明实验设计和响应面法优化得到的提取
工艺参数准确可靠，具有实用价值。
图 1 上样液质量浓度和上样液 pH对纯化率的影响
图 2 上样液 pH和洗脱液体积分数对纯化率的影响
图 3 上样液质量浓度和洗脱液体积分数对纯化率的影响
3 讨论
本实验采用大孔吸附树脂 D101，通过单因素试验和响
应面回归分析法，达到了纯化松潘乌头总生物碱的工艺目
的。考察了上样液质量浓度、上样液 pH值、洗脱液体积分
数和洗脱液 pH对大孔吸附树脂 D101 纯化松潘乌头总生物
碱的影响，响应面法研究表明大孔吸附树脂 D101 纯化松潘
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乌头总生物碱的最佳工艺条件为:松潘乌头提取液质量浓
度为 0. 2 g /mL，pH为 5. 0，乙醇洗脱体积分数为 75%，在
此条件下松潘乌头含有量为 22%，工艺简便，参数稳定可
靠，因此，大孔吸附树脂 D101 适宜于松潘乌头总生物碱的
分离纯化，通过中试研究可应用于工业生产，也为相关研
究的进一步开展提供了可靠的实验依据。
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正交实验优化微波辅助提取忍冬藤中绿原酸和咖啡酸工艺研究
李 克， 吴龙琴， 汤 淏， 王曙东*
(南京军区南京总医院，江苏 南京 210002)
收稿日期:2013-04-02
基金项目:军队医疗机构制剂标准提高科研专项重点课题 (13ZJZ13)
作者简介:李 克 (1955—)，男，硕士，主任技师，研究方向:药物分析及临床生化研究。E-mail:liker1017@ 163. com
* 通信作者:王曙东，男，主任药师，研究方向:中药制剂。Tel:(025)80860161;E-mail:wangshudong163@ sina. com
摘要:目的 以正交试验优选确定忍冬藤中绿原酸和咖啡酸微波辅助提取工艺条件。方法 以高效液相色谱测定绿原
酸、咖啡酸提取得率为考察指标，微波功率、液固比、提取时间和提取次数为考察因素，每个因数分别选取三个水
平，进行 L9(3
4)正交试验。以直观分析法和方差分析法分析研究微波辅助提取忍冬藤中绿原酸、咖啡酸的影响因
素，确定最佳提取工艺，并将其与水提醇沉提取法及超声提取法进行对比。结果 各因素对绿原酸和咖啡酸提取得率
影响顺序为:提取次数 ＞ 提取时间 ＞液固比 ＞微波功率。最佳提取工艺为功率 700 W，24 倍水，微波提取 3 次，每
次 4 min。结论 微波辅助提取工艺具有效率高、时间短、低耗、环保等优点，对忍冬藤中绿原酸和咖啡酸提取率与
水提醇沉提取法相近，优于超声提取法，是一种适合于忍冬藤有效成分提取的有效方法，可为忍冬藤工业化生产工艺
提供参考。
关键词:忍冬藤;绿原酸;咖啡酸;微波辅助提取;正交试验;提取工艺
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)04-0864-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 04. 046
忍冬藤 Lonicerae Japonicae Caulis 系常用中药，含有多
种有机酸。其中咖啡酸、绿原酸具有降血压、降血糖、抗
菌、抗病毒以及抗氧化等多种药理活性［1-4］，是评价忍冬藤
药材质量的主要有效成分指标。
传统的忍冬藤有效成分提取工艺多为水煎法，该工艺
的不足在于提取时间过长、耗能较大。微波辅助萃取 (Mi-
crowave Assisted Extraction，MAE)，又称微波萃取 (Micro-
wave Extraction，ME)是微波和传统的溶剂萃取法相结合
而成的一种萃取方法。自 1986 年首先提出后［5］，因其具有
设备要求较低、操作方便、提取效率高、能耗小以及成本
低等特点，在中草药有效组分提取领域呈现出良好的应用
前景，成为一种有发展潜力的提取新工艺［6-11］。本实验采
用高效液相色谱法检测，以忍冬藤中有效成分绿原酸、咖
啡酸为考察指标进行正交试验，优化并选定了忍冬藤药材
的微波辅助萃取提取工艺，并与超声提取法以及水提醇沉
法等工艺进行了比较。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪系统由二极管阵列检测器、自动进样
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2014 年 4 月
第 36 卷 第 4 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
April 2014
Vol． 36 No． 4