全 文 ：书收稿日期:2014-03-10
基金项目:中国西南野生生物种质资源库项目(0802261411) ;国家和云南省联合基金(U1136603) ;国家自然科学基金(31100178) ;云南省
政府创新团队计划(2009CI011)
作者简介:杨杨(1978 －) ，女，助理研究员，硕士，从事植物组织培养与基因工程研究。Email:yangyang2@ mail． kib． ac． cn。通讯作者:李德
铢(1963 －)男，研究员，博士，从事植物系统学和生物地理学研究。Email:dzl@ mail． kib． ac． cn;郭振华(1975 －)女，研究员，博士，从事竹类植
物研究。Email:guozhenhua@ mail． kib． ac． cn
小叶龙竹高频植株再生系统的建立
杨 杨，何 俊，程治英，李德铢* ，郭振华*
(中国科学院昆明植物研究所，西南野生生物种质资源库，云南 昆明 650204)
摘 要 以离体保存的小叶龙竹试管丛芽为外植体进行脱分化形成愈伤组织和愈伤组织再分化的研
究。结果如下:① 丛芽、茎尖、茎节和叶片，都能长出愈伤组织，效果较好的是丛芽、茎尖，其次为茎节，
叶片较差。② 最适培养基为 MS + 2，4-D 3 mg·L －1 + Kt 0． 2 mg·L －1 + S 3%。③ 1 ～ 3 代愈伤组织
分化芽的频率高，每隔 6 ～ 8 个月新启动一批丛芽诱导产生愈伤组织，可以保证高频稳定的愈伤组织再
生系统的建立，以供后续的转基因研究。
关键词 小叶龙竹;丛芽;愈伤组织培养;植株再生
Establishment of High Frequency Ｒegeneration System of
Dendrocalamus barbatus Hsuen et D． Z． Li
YANG Yang，HE Jun，CHENG Zhi-ying，LI De-zhu，GUO Zhen-hua
(Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，
China Germplam Bank of Wild Species，Kunming 650204，Yunnan，China)
Abstract The in vitro cultured clumpy buds of Dendrocalamus barbatus Hsuen et D． Z． Li
were used to induce calli and regenerate plantlets from calli． The results showed that the calli
could be induced from clumpy buds，shoot tips，internodes and leaves respectively，and the
clumpy buds was the most effective． The optimum medium for calli induction was MS + 2，4-D
3． 0 mg·L －1 + Kt 0． 2 mg·L －1 + S 3% ． A high frequency plant regeneration system for this
species can be established by induced calli from new clumpy buds in every 6 to 8 months，
which could be provided for transgenic research．
Key words Dendrocalamus barbatus;Cluster buds;Callus culture;Plant regeneration
小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus Hsueh et D． Z． Li)［1］属禾本科竹亚科牡竹属竹种，又名“埋桑郎”(西
双版纳傣族语)和“埋桑”(金平傣族语)。小叶龙竹为大型合轴丛生竹，秆高 15 ～ 18 m，直径 10 ～ 15 cm;主
要分布在云南南部、越南、缅甸和老挝北部，海拔 360 ～ 1 100 m的热带和南亚热带区域［2 － 4］。由于小叶龙竹
竹笋品质佳、秆材纤维长、材质细致、材性优良，是产区最重要优质的笋用、制炭、建材、编制和纸浆用竹类;同
时，梢头弯或微下垂，竹秆光滑，生长迅速，姿态优美，亦为优良的景观用竹，是我国南部热带地区最具发展前
景的大型经济竹种之一［5 － 9］。但小叶龙竹在遗传育种方面的研究还相当薄弱，尤其是基因工程育种方面才
刚开始起步。本文通过对小叶龙竹愈伤组织的诱导和体细胞再生植株体系的建立，为其通过转基因操作进
第33卷 第4期
2 0 1 4 年 1 1 月
竹 子 研 究 汇 刊
JOUＲNAL OF BAMBOO ＲESEAＲCH
Vol． 33，No． 4
Nov．，2 0 1 4
行遗传改良提供关键技术。
1 材料与方法
1． 1 材料
小叶龙竹(Dendrocalamus barbatus Hsueh et D． Z． Li) ，种子于 2009 年 4 月采自高黎贡山。种子经常规
消毒后，在人工培养基上萌发，诱导产生丛芽，并建成了单粒种子的无菌无性系，以丛芽的形成保存在中国西
南野生生物种质资源库的离体库。本试验采用保存在离体库的丛芽做试验材料。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养条件 培养室温度为(25 ± 3)℃，暗培养为 24 h·d －1，光照培养照光时间 12 h·d －1，光照强度
为 20 μmol·m －2·s － 1。基本培养基为 MS［10］，所用培养基 pH为 5． 8。
1． 2． 2 外植体类型的选择 选用丛芽(5 芽 /丛，芽高度 1 cm左右) ;叶片切段(从丛芽上取叶片，切段) ;茎
节(从丛芽上切取带节的茎段)和茎尖。每处理接种 6 瓶，每瓶接种 6 块材料，每处理重复 3 次。
1． 2． 3 最适培养基的筛选 观察每处理愈伤组织出现的时间和愈伤组织大小来进行比较(培养 60 d 时进
行)。
(1)2，4-D浓度对外植体诱导愈伤组织的影响，设计了 4 个处理:①MS + 2，4-D 2． 0 mg·L －1(单位下
同) ，②MS +2，4-D 3． 0，③MS +2，4-D 5． 0，和④MS +2，4-D 10． 0;
(2)最适 2，4-D浓度与细胞分裂素组合使用对诱导愈伤组织的影响，实验包括下面几组:⑤MS + 2，4-D
3． 0 + Kt 2． 0，⑥MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 5，⑦MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2，⑧MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 1，⑨MS +
2，4-D 3． 0 + BA 1． 0，⑩MS +2，4-D 3． 0 + BA 0． 2，MS +2，4-D 3． 0 + TDZ 0． 1;
(3)有机添加物对诱导愈伤组织的影响，以 MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 为基本培养基分别附加 CM 20%、
蛋白胨 1 g·L －1、LH 1 g·L －1、CH 1 g·L －1、Ad 20 mg·L －1和 ye 1 g·L －1;
(4)糖浓度对诱导愈伤组织的影响，分两组试验:MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 + S 3%和 MS + 2，4-D 3． 0 +
Kt 0． 2 + S 6%;
(5)光照培养和暗培养对愈伤组织诱导的影响。
2 实验结果与分析
2． 1 外植体类型对诱导愈伤组织的影响
我们选用小叶龙竹的叶片切段、茎段、茎尖和丛芽作为诱导愈伤组织的外植体，实验结果如下:培养基为
MS +2，4-D 3． 0 + S 3%。叶片切段培养约 5 d，大部分叶切段开始不可逆转的黄化、死亡，培养到 57 d 时，3
次重复共计 108 片叶段，仅有 9 个叶切段长出 0． 2 cm2大小的白色愈伤组织，诱导率仅为 8． 3%。我们是用
真正意义的叶片，首次得到愈伤组织。虽然 Huang 等［11 ～ 12］报道用叶片诱导愈伤组织成功，但他们选用的是
侧枝顶芽的叶片和茎尖一起做外植体才得到的。说明成熟叶片诱导愈伤组织十分困难，并且诱导出的愈伤
组织没能进一步发育。茎段培养在MS +2，4-D 3． 0 的培养基上 50 d左右开始长出愈伤组织，培养 60 d后愈
伤组织大小为 0． 2 ～ 0． 3 cm2，诱导率为 58． 3%(108 块中长 63 块)。单芽和丛芽在培养基上初现愈伤组织的
天数分别是 31 d或 36 d。愈伤组织大小为 0． 2 ～ 0． 3 cm2 或 0． 3 ～ 0． 5 cm2，60 d后诱导率均达到 100%。结
果显示丛芽是最适合的诱导愈伤组织的材料，因此以下各组试验，仅选用丛芽做外植体。
2． 2 2，4-D浓度对丛芽诱导愈伤组织的影响
2，4-D是诱导愈伤组织的关键因素。试验结果见表 1。
从表 1 可以看出:MS +2，4-D 2． 0、3． 0、． 05 和 10． 0 4 种浓度培养丛生芽，均可诱导出愈伤组织。从愈伤
组织初现时间来看，MS +2，4-D 2． 0 和 MS + 2，4-D 3． 0 较合适，分别培养 31 d 和 40 d 就长出来乳白色愈伤
组织。随着 MS +2，4-D浓度的增加，初现愈伤组织的时间延长为 41 d 和 55 d。从培养丛芽 60 d 后统计愈
2 竹 子 研 究 汇 刊 第 33 卷
伤组织大小看，MS +2，4-D 3． 0 更好，愈伤组织大小达到 0． 3 ～ 0． 5 cm2。
表 1 2，4-D浓度对丛芽诱导愈伤组织的影响
Tab． 1 The effects of 2，4-D concentration on the induction of callus from clumpy buds
培养基
Culture medium /(mg·L －1)
丛芽初现愈伤组织的天数
The time for callus to take shape /d
愈伤组织大小
Callus size /cm2
MS + 2，4-D 2． 0 31 0． 1 ～ 0． 2
MS + 2，4-D 3． 0 40 0． 3 ～ 0． 5
MS + 2，4-D 5． 0 41 0． 1 ～ 0． 3
MS + 2，4-D 10． 0 55 0． 1 ～ 0． 5
2． 3 细胞分裂素种类和用量及其与 MS +2，4-D 3． 0 组合使用对诱导愈伤组织的影响
表 2 细胞分裂素与MS +2，4-D 3． 0 组合使用对诱导愈伤组织的影响
Tab． 2 The combined effects of cytokinins and MS 3． 0 + 2，4-D on the induction of callus
培养基
Culture medium /(mg·L －1)
外植体初现愈伤组织的天数
The time for callus to take shape /d
愈伤组织大小
Callus size /cm2
MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 2． 0 34 0． 2 ～ 0． 4
MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 5 28 0． 3 ～ 0． 5
MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 25 0． 3 ～ 0． 8
MS + 2，4-D 3． 0 + Kt 0． 1 40 0． 2 ～ 0． 3
MS + 2，4-D 3． 0 + BA 1 27 0． 3 ～ 0． 4
MS + 2，4-D 3． 0 + BA 0． 2 19 0． 3 ～ 0． 5
MS + 2，4-D 3． 0 + TDZ 0． 1 35 0． 3 ～ 0． 5
从表 2 可以看出:MS +2，4-D 3． 0 为基本培养基附加细胞分裂素(Kt、BA 和 TDZ)均对愈伤组织初现时
间有所提前，愈伤组织大小有所增加。综合考虑我们认为 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 组合的培养基最佳。
2． 4 有机添加物对诱导愈伤组织的影响
以 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 为基本培养基，分别附加 CM 20%、蛋白胨 1 g·L －1、LH 1 g·L －1、CH 1 g·
L －1、Ad 20 mg·L －1和 ye 1 g·L －1，观察愈伤组织初现时间和愈伤组织大小，差异不明显，均培养 34 d 后初
现愈伤组织，培养 60d后愈伤组织大小除附加 CM 20%、蛋白胨 1 g·L －1和 Ad 20 mg·L －1的几组培养基愈
伤组织大小为 0． 4 cm2，其余均为 0． 3 cm2。
2． 5 糖浓度对诱导愈伤组织的影响
以 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 为基本培养基，附加糖浓度为 3%和 6%。含糖 3%的一组 25d 初现愈伤组
织，培养 60d后愈伤组织大小为 0． 3 ～ 0． 8 cm2。而含糖 6%的另一组，33d初现愈伤组织，其大小仅为 0． 2 ～
0． 5 cm2。这说明提高糖浓度并不能促进愈伤组织的生长和发育。因为糖在组培中是不可缺少的，它的作用
是提供 C源和调节渗透压。S 3%最适合小叶龙竹愈伤组织培养时所需。
2． 6 光照培养和暗培养对愈伤组织诱导的影响
光照培养条件下，丛芽块 25 d初现愈伤组织，培养 60 d的愈伤组织大小为 0． 2 ～ 0． 5 cm2。而暗培养条
件下的培养物 40 d才初现愈伤组织，培养 60 d愈伤组织大小为 0． 2 ～ 0． 3 cm2。二者诱导愈伤组织的形成均
达 100%。这说明光照条件下(只要光强合适)诱导愈伤组织产生和生长更比暗培养条件有利。
2． 7 高频稳定的植株再生系统的建立
在我们的实验中，以丛芽切段做外植体，在 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 + S 3%的培养基上培养，一般培养 4
周左右，便有愈伤组织产生。愈伤组织产生部位多在丛生芽基部切口处，也有个别或极少数产生在丛芽块顶
端的叶腋处。愈伤组织继代周期约为 50 d，继代 1 次为 1 代，依此类推。丛芽开始形成的愈伤组织为乳白
色，质地疏松，易散开，随着培养时间的延长(约 50 d) ，乳白色愈伤组织生长速度极快，同时在乳白色愈伤组
织块上出现颗粒状堆积的(颗粒大小如粟米)紧密的瘤状结构的胚性愈伤组织。值得一提的是，丛芽切段在
MS +2，4-D 3． 0 + TDZ 0． 1 + S 3%的培养基上，培养 39 d 后直接形成了颗粒状堆积的乳白至浅黄色致密的
3第 33 卷第 4 期 杨 杨等:小叶龙竹高频植株再生系统的建立
胚性愈伤组织。这些胚性愈伤组织在 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 + S 3%的培养基上培养 3 个月左右，可形成
分散的小绿点或小片(面积约 0． 5cm2)绿色小区，继而形成胚芽，每块愈伤组织可达 1 ～ 7 个芽点，他们能继
续生长发育，长高的同时基部也长根来形成完整试管苗。细胞分裂素有促进胚性愈伤组织发芽的作用，如第
一代愈伤组织在 MS +2，4-D 3． 0 + S 3%的培养基上培养 133 d才形成胚芽，而在 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 +
S 3%培养基上的第 1 代胚性愈伤组织 92 d便有绿色胚芽点出现。第 2 代胚性愈伤组织培养 108 d 出现胚
芽，第 3 代胚性愈伤组织培养 128 d长出胚芽，1 ～ 3 代胚性愈伤组织芽的分化率均达到 100%。连续继代，
培养材料的繁殖速度、生长状况和再生能力都有逐渐衰退的趋势。第 4 ～ 6 代胚性愈伤组织形成胚芽的天数
均长为 148 d、194 d和 236 d。而且，愈伤组织分化芽的能力也降低，为 20% ～50%。因此我们提出:小叶龙
竹丛芽切段培养的 1 ～ 3 代愈伤组织作为目的基因的受体。每隔 6 ～ 8 个月从离体库取出丛芽瓶苗进行新一
轮的愈伤组织诱导，所得愈伤组织块除用作目的基因受体外，还可筛选对转化剂有良好敏感性的愈伤组织
块，这为转基因操作提供了良好的基础。
1．小叶龙竹致密型愈伤组织;2．小叶龙竹松散型愈伤组织;3．小叶龙竹初现芽点;4．小叶龙竹初分化苗;
5 ～ 6．小叶龙竹生根培养;7．小叶龙竹组培苗移栽成活。
1． The compact callus of D． barbatus;2． The loose callus of D． barbatus;3． The early differentiation bud points of
D． barbatus;4． The differentiation of D． barbatus;5 ～ 6． Ｒoot induction of D． barbatus;7． The transplantation of D．
barbatus．
图 1 小叶龙竹稳定再生系统建立
Fig． 1 The stable callus induction and plant regeneration system of D． barbatus
4 竹 子 研 究 汇 刊 第 33 卷
3 讨 论
以中国西南野生生物种质资源库离体库保存的小叶龙竹丛芽切段为外植体，脱分化产生愈伤组织和胚
性愈伤组织，最适培养基为 MS +2，4-D 3． 0 + Kt 0． 2 + S 3%。培养基加 Kt，有促进愈伤组织发生和生长的作
用。也有人认为培养基加 Kt有抑制或不利愈伤组织生长的作用［13 － 14］，这是因为他们加入 Kt 的量过高，诱
导培养的物种和外植体类型不同造成的。2，4-D 是诱导外植体脱分化形成愈伤组织的关键因素，几乎所引
用的文献均如此［15 － 24］。而小叶龙竹则以 2，4-D浓度为 2 ～ 3 mg·L －1较合适。1 ～ 3 代愈伤组织，再分化率
几乎可达 100%，具有高频稳定的再生能力，可作为目的基因的受体。每隔 6 ～ 8 个月重新诱导丛芽脱分化
形成愈伤组织，这样就可保证 1 ～ 3 代愈伤组织有充足数量。在做受体的同时，供选择对转化剂有良好敏感
性的愈伤组织，为转基因操作提供充足的原材料。另外，1 ～ 3 代愈伤组织分化胚芽形成植株没有发现形态
学上的变异。鉴于愈伤组织长期继代培养，有可能产生遗传变异，可以利用多代培养的愈伤组织再生植株，
从中选择变异，有可能得到常规育种中难以获得的新类型。
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