全 文 ：　论　　著　
墓头回提取液对小鼠移植瘤 U14 瘤体内微血管
密度 VEGF 和 bFGF 表达的影响
蒋秋燕 , 　方　刚 , 　苏莉鸣 , 　钟　璐
　　基金项目:2007年广西自然科学基金资助项目(№:桂科自 0728183)及 2007年广西壮族自治区大型仪器协作共用网资助项目
作者单位:530023　南宁 ,广西中医学院第一附属医院妇产科(蒋秋燕);530001　广西中医学院(方　刚 ,钟　璐);530012　南宁市红十
字会医院(苏莉鸣)
作者简介:蒋秋燕(1963-),女 ,副主任医师 、副教授 ,硕士研究生导师 ,研究方向:妇科肿瘤防治研究。 E-mail:jqy1688@163.com ,电
话:0771-5848620。
　　[ 摘要] 　目的　探讨墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14 移植瘤瘤体组织微血管密度 、VEGF、bFGF 表达
的影响。方法　将 SPF 级雌性 KM 小鼠随机分成墓头回提取液高 、中 、低剂量组 、顺铂组及模型组 ,以观察
墓头回提取液对 U14 实体瘤肿瘤组织微血管密度 、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子
(bFGF)表达的影响。结果　墓头回提取液高 、中剂量组和顺铂组的宫颈癌 U14 移植瘤瘤体内微血管密度
均明显低于模型组;墓头回提取液高 、中剂量组和顺铂组均可降低 U14 移植瘤瘤体内 VEGF 的表达;墓头
回提取液高剂量组和顺铂组均可降低 U14 移植瘤瘤体内 bFGF 的表达。结论　墓头回提取液能明显抑制
U14 移植瘤瘤体血管形成 ,并能降低 VEGF、bFGF的表达 , 提示墓头回提取液有抗肿瘤作用。
[ 关键词] 　墓头回提取液;　小鼠宫颈癌 U14;　微血管密度;　VEGF;　bFGF
　　[ 中图分类号] 　R 737.33 　[ 文献标识码] 　A　[文章编号] 　1674-3806(2009)01-0004-04
Ef fect of the extracting solution from mutouhui on the microvessel-density and VEGF/bFGF expression in the
U14 replanted tumor tissues of the mice that had cervical carcinoma　J IANG Qiu-yan , F ANG Gang , S U Li-
ming , et al.First Teaching Hospital of Guangxi University of T raditional Chinese Medicine , Nanning
530023 , China
[ Abstract] 　Objective　To explore the effect of the ex tracting solution from mutouhui on the micro vessel-
density and VEGF/ bFGF expression in the U14 replanted tumor tissues of the mice that had cervical carcinoma.
Methods　The SPF female mice were divided into high dose/ middle dose/ light dose of the ex tracting solution
g roup , cisplatin g roup and model group randomly.Then the effect of the ex tracting solution from mutouhui on the
microvessel-density and VEGF/ bFGF expression in the U14 replanted tumor tissues of the mice that had cervical
carcinoma were observed.　Results　The microvessel-density in high dose/ middle dose of ex tracting solution
g roup and cisplatin group was lower than that in model g roup;VEGF expression in high dose/ middle dose of ex-
tracting solution g roup and cisplatin g roup was lower than that in model g roup;bFGF expression in high dose/
middle dose of ex tracting solution g roup and cisplatin group w as lower than that in model group.　Conclusion　The
ex tracting solution from mutouhui is against the formation of the microvessel-density in U14 transplanted tumor ,
and it also can reduce the VEGF/ bFGF expression , all these show tha t extracting solution from mutouhui has the
effect of anti-tumor.
[ Key words] 　Extracting solution from Mutouhui;　Mice of U14 cervical carcinoma;　Micro vessel densi-
ty;　VEGF;　bFGF
　　为了进一步探讨墓头回提取液抗肿瘤的机理 ,
我们根据前期实验研究“墓头回提取液对荷 U14宫
颈癌小鼠血液流变学的影响”为基础 ,该实验结果证
实墓头回提取液可以降低 U14 宫颈癌小鼠的血液
粘度而起到抗肿瘤的作用[ 1] 。本实验直接从墓头回
提取液对小鼠宫颈癌 U14 移植瘤瘤体组织微血管
密度 、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞
生长因子(bFGF)表达的影响来探讨其作用机制 ,现
·4· 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Chinese Journal of New C linical Medicine , January 2009 , Volume 2 , Number 1
报告如下 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　动物及瘤株　SPF 级雌性 KM 小鼠 100只 ,
体重(20±2)g ,购于广西医科大学实验动物中心 ,符
合健康一级动物标准 ,合格证号:SCXK 桂 2003-
0003 。U14宫颈癌细胞株:购于上海药物研究所 ,在
昆明小鼠腹腔内传代 。
1.1.2　药物及试剂　墓头回原药材 1.0 kg ,购于广
西中医学院第一附属医院中药房 ,经广西中医学院
中药鉴定研究所鉴定为异叶败酱(patrinia hetero-
phylla bge),粉碎后用 5000 ml蒸馏水浸泡 0.5 h ,
水煎煮2次 ,水提取液冷却后与 75%乙醇以 10∶1比
例醇沉 10 h ,真空过滤器过滤 ,合并 2 次滤液 ,加热
浓缩至 100 ml ,水浴加热 ,得到浸膏 150 g ,保存备
用;顺铂 (齐鲁制药有限公司 ,批号:706031CF)临
用时以注射用水配制成所需浓度(1 mg/ml);CD34
免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司),
V EGF 、bFGF 免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生
物公司);其他所用试剂均为分析纯 。
1.2　实验方法
1.2.1　移植瘤模型的建立[ 2] 　将未带瘤 KM 小鼠
称重 ,随机分为 5组 ,每组 10 只 , 墓头回提取液高 、
中 、低 3个剂量组 、顺铂组 、模型组 。在无菌条件下 ,
取预先在昆明小鼠体内传代第 7天的 U14 肿瘤细
胞(腹水),以无菌生理盐水按 1∶3稀释 ,调整细胞数
约为 2.0×109 个/ L ,于每只小鼠右前肢腋下注射
0.2 ml。
1.2.2　给药　参照预实验及活性筛选给药量 ,将墓
头回浸膏配制为墓头回提取液高 、中 、低 3个剂量 ,
按所含浸膏量计算 , 分别为 1500 , 750 和 375 mg/
(kg·bw);从接种第 2天开始 ,墓头回提取液组按体
重0.2 m l/(10g·bw)定时分组灌胃给药;顺铂组腹
腔注射顺铂注射液 3 mg/(kg·bw);模型组每只每天
予生理盐水 0.5 ml灌胃。以上均连续给药 10 d。
1.2.3　指标检测
1.2.3.1　瘤体组织病理形态观察　剖取实体瘤瘤
体 ,首先进行肉眼观察形态 、色泽 ,触摸质地 ,部分瘤
体剖体观察 ,然后对瘤体进行常规石蜡包埋 、切片 、
HE染色 ,光镜下观察。
1.2.3.2　微血管密度(MVD)检测[ 3] 　(1)各组肿
瘤组织切片常规脱蜡 、水化 , EDTA 液抗原修复后 ,
加抗鼠 CD34单克隆抗体 ,然后按福州迈新两步法
试剂盒操作步骤进行:加试剂 A和 B ,加新配制的底
物DAB溶液 。苏木素复染 ,盐酸酒精分化 ,梯度酒
精脱水干燥 ,中性树胶封片 。实验设阳性与阴性对
照。(2)结果判定标准:CD34 阳性内皮细胞被染成
棕黄色。由内皮细胞形成的条状 、隙状等孤立或簇
状结构并有管腔 ,且管腔小于 8个红细胞大小者为
一条血管;相互分离的内皮细胞但无明显管腔亦按
1条血管计数 。血管腔大于 8个红细胞或管壁可见
平滑肌者不计入内。(3)微血管密度计数方法:先在
低倍镜下(100倍)确定 3 个 CD34阳性着色最密集
的区域 ,然后在高倍视野(400倍)下计数微血管 ,取
3个视野的均值作为微血管密度(MVD)。肿瘤内硬
化区域和肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计
数。
1.2.3.3　VEGF 和 bFGF 表达检测[ 4] 　免疫组化
SABC 法检测 VEGF 、bFGF 表达水平。免疫组化
SABC法 ,具体操作按说明书进行。免疫组化染色
评分按 Rahman 等[ 5] 的方法进行 ,即 VEGF 、bFGF
的评分标准是以细胞质呈棕褐色颗粒状染色为阳性
反应 。根据着色细胞的比例(染色范围)染色强度及
染色范围(阳性细胞比率)分为 0 ～ 4级 ,阴性为 0
分;阳性细胞 1%～ 25%为1分 ,26%～ 50%为 2分 ,
51%～ 75%为 3分 ,76%～ 100%为 4分;染色强度
划分为 0 ～ 3级 ,阴性为 0分 ,弱阳性为 1分 ,中等强
度为 2 分 ,强阳性为 3分 ,两者得分相加为最后评
分。
1.3　统计方法 　采用 SPSS11.0 统计学软件包进
行统计学处理 ,VEGF 、bFGF 的表达及微血管密度
记数以( x ±s )表示。VEGF 、bFGF 的表达及微血
管的密度比较行 t 检验 。
2　结果
2.1　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14瘤体病理形
态观察
2.1.1　肉眼观察　KM 小鼠 U14实体瘤为球形结
节状 ,质脆细嫩 ,剖面呈鱼肉状 。模型组瘤体体积明
显大于墓头回提取液组高 、中剂量组和顺铂组 ,少数
可见侵袭性生长现象 ,未见有腹水形成。墓头回提
取液组高 、中剂量组和顺铂组小鼠的瘤体较小 ,形状
规则 ,易剥离 , 无侵袭性生长现象和腹水形成。
2.1.2　光镜观察　通过对瘤体进行 HE 染色 ,光镜
观察显示 ,模型组细胞生长旺盛 ,多呈团灶状分布 ,
有的呈腺样排列 ,细胞核形态规则 ,一般呈椭圆形或
卵圆形 ,细胞核膜结构清晰 、完整 ,核内常染色质多
等(见图 1-A);墓头回提取液低剂量组与模型组之
间无明显差异。墓头回提取液高剂量组肿瘤细胞呈
·5·中国临床新医学　2009年　1月　第 2卷　第 1期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
团索状实性排列或弥漫性分布 ,细胞大小不等 ,形态
不规则 ,多有变性 ,可见多数肿瘤细胞坏死 ,坏死区
周围可见部分凋亡细胞(见图 1-B);墓头回提取液中
剂量组肿瘤细胞出现坏死区域和数量明显少于墓头
回提取液高剂量组 。顺铂组肿瘤细胞呈弥漫性分
布 ,可见片状坏死 ,细胞正常结构消失。
图 1　小鼠宫颈癌 U14 瘤体组织病理形态
2.2　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14瘤体微血管
密度的影响　经免疫组化染色后的切片 ,CD34阳性
细胞呈现棕黄色或棕褐色染色 ,多位于瘤细胞之间 ,
显示的微血管形态不一 ,结构紊乱 ,呈椭圆 、裂隙状
等 ,只有部分可见明确管腔 。模型组可见微血管广
泛分布于肿瘤组织间质内 ,墓头回提取液低剂量组
与空白模型组比较差异无统计学意义(P >0.05)。
与模型组比较 ,墓头回提取液高 、中剂量组和顺铂组
能明显降低瘤组织微血管密度 ,差异均有统计学意
义(P<0.01)。见表 1。
表 1　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14 瘤体
微血管密度的影响( x ±s)
组　别 例数(n)前 后
剂　量[ mg/(kg·bw)] 微血管密度(条/cm2) t P
模型组 10 9 0 19.61±3.09
墓头回低剂量组 10 9 375 17.94±3.08 1.147 0.268
墓头回中剂量组 10 9 750 15.00±2.46＊＊ 3.501 0.003
墓头回高剂量组 10 10 1500 12.10±2.32＊＊ 6.034 0.000
顺铂组 10 9 3 9.83±1.66＊＊ 8.364 0.000
　　注:各用药组与模型组比较 , ＊＊P<0.01
2.3　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14瘤体 VEGF
表达的影响　免疫组化结果显示:模型组 U14小鼠
瘤体组织中 VEGF 有较高表达(图 2-A);墓头回提
取液低剂量组与模型组比较无明显降低瘤体组织中
VEGF 表达的作用(P >0.05);与模型组比较 ,墓头
回提取液中剂量组能降低瘤组织中 VEGF 表达 ,差
异有统计学意义(P <0.05)(图 2-B);与模型组比
较 ,墓头回提取液高剂量组和顺铂组能明显降低瘤
组织中 VEGF 表达 , 差异均有统计学意义(P <
0.01)(图 2-C)。见表 2 。
图 2　VEGF 在小鼠宫颈癌 U14 瘤体组织中的表达变化
表 2　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14 瘤体
组织 VEGF表达的影响( x±s)
组　别 例数(n)前 后
剂　量[ mg/(kg·bw)] VEGF 表达(分) t P
模型组 10 9 0 5.61±0.70
墓头回低剂量组 10 9 375 5.06±0.92 1.447 0.167
墓头回中剂量组 10 9 750 4.61±0.86＊ 2.714 0.015
墓头回高剂量组 10 10 1500 3.55±0.98＊＊ 5.208 0.000
顺铂组 10 9 3 2.89±0.78＊＊ 7.796 0.000
　　注:各用药组与模型组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
2.4　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14 瘤体 bFGF
表达的影响　免疫组化结果显示:模型组 U14 小鼠
瘤体组织中bFGF 均有较高表达(图 3-A);墓头回提
取液中 、低剂量组对瘤体组织 bFGF 表达与空白模
型组比较 ,差异无统计学意义(P >0.05);与模型组
比较 ,墓头回提取液高剂量组和顺铂组能降低瘤组
织中 VEGF 表达 ,差异有统计学意义 (P <0.05)
(图 3-B)。见表 3 。
表 3　墓头回提取液对小鼠宫颈癌 U14 瘤体
组织 bFGF 表达的影响( x±s)
组　别 例数(n)前 后
剂　量[ mg/(kg·bw)] VEGF 表达(分) t P
模型组 10 9 0 5.11±0.74
墓头回低剂量组 10 9 375 4.78±0.62 1.037 0.315
墓头回中剂量组 10 9 750 4.50±0.87 1.609 0.127
墓头回高剂量组 10 10 1500 4.10±0.99＊ 2.489 0.023
顺铂组 10 9 3 4.06±1.04＊ 2.474 0.025
　　注:各用药组与模型组比较 , ＊P<0.05
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图 3　bFGF在小鼠宫颈癌 U14 瘤体组织中的表达变化
3　讨论
3.1　VEGF 是最有效的血管形成因子之一 ,对内皮
细胞具有特异性分裂能力。近几年 VEGF 表达情
况的研究表明 ,肿瘤 VEGF 的高表达与肿瘤已达晚
期或不良预后明显相关[ 6] 。V EGF 是一种可溶性
肽 ,可由肿瘤分泌进入各种体液当中。VEGF 的生
物功能主要有刺激内皮细胞增生 ,促进血管形成并
增加微小血管的渗透性 ,为肿瘤细胞的生长和血管
网的建立提供营养 。bFGF 是一种多功能的生长因
子 ,是一种多肽因子 ,因其信号传导复杂 、生物学作
用具多效性而倍受关注。其除对成纤维细胞和血管
内皮细胞有促增殖作用外 ,还参与肿瘤的发生和发
展 ,特别对肿瘤浸润和转移有重要意义。它能通过
受体与相应的靶细胞(如血管内皮细胞和成纤维细
胞)结合 ,增加内皮细胞的化学趋向性 ,促进血管内
皮细胞分裂和毛细血管出芽生长 ,诱导蛋白溶解酶
生成 ,有利于内皮细胞芽穿透基质等 ,新生的毛细血
管既为肿瘤的生长提供了营养 ,又为肿瘤的转移准
备了有利的条件 。血管生成与肿瘤的生长和转移密
切相关。
3.2　本实验前期研究从降低血液粘度方面进行抗
宫颈肿瘤研究 ,此次实验检测了墓头回提取液对小
鼠宫颈癌 U14 瘤体组织中基本形态变化 、MVD 、
V EGF 、bFGF 表达的影响 ,其中基本形态变化结果
显示 ,墓头回提取液可使肿瘤细胞呈团索状实性排
列或弥漫性分布 ,导致多数肿瘤细胞坏死 ,坏死区周
围可见部分凋亡细胞 。观察微血管密度发现 ,墓头
回提取液高 、中剂量组能明显降低瘤组织微血管密
度 ,并且均能降低 U14 小鼠瘤体组织中 VEGF 、
bFGF 的表达 ,并呈一定的量效关系 ,这可能与墓头
回提取液通过降低了瘤体组织中 VEGF 、bFGF 的
表达 ,使肿瘤血管形成受到抑制 ,从而起到抑制肿瘤
生长的作用有关。
因此 , 墓头回提取液不仅可导致小鼠宫颈癌
U14瘤体中肿瘤细胞坏死 , 还可通过降低瘤体中
VEGF 、bFGF 的表达 ,提示墓头回提取液有抗肿瘤
作用。
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[ 收稿日期　2008-11-10] [ 本文编辑　韦挥德　刘京虹]
·7·中国临床新医学　2009年　1月　第 2卷　第 1期