全 文 ：李 光，龚 宁． 干旱胁迫对金线兰 POD活性及同工酶酶谱的影响［J］． 江苏农业科学，2014，42(11):208 － 209．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2014． 11． 073
干旱胁迫对金线兰 POD活性及同工酶酶谱的影响
李 光1，2，龚 宁2
(1．安顺学院农学院，贵州安顺 561000;2．贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001)
摘要:对生长一致的金线兰组培苗进行干旱胁迫试验，采用分光光度法和同工酶电泳技术分别研究了干旱胁迫期
间金线兰 POD活性及同工酶酶谱的变化。结果表明:干旱胁迫下，金线兰 POD 活性呈现“M”形的变化规律，同工酶
条带数量发生改变，在胁迫的前 2 d，在“－”区产生 4 条新的酶带，表明在干旱胁迫下，金线兰试管苗迅速诱导 POD 新
酶带以适应胁迫环境。胁迫 3 d，酶带条数减少到 5 条，与此同时 POD活性也降到最低。从胁迫后 4 d 起，在“+”区
产生 2 条新的酶带。这可能是 POD同工酶的表达基因有部分关闭或开启，导致酶带条数的增减。
关键词:干旱胁迫;金线兰;同工酶酶谱
中图分类号:Q945． 78 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)11 － 0208 － 02
收稿日期:2014 － 01 － 07
基金项目:贵州省科学技术基金［编号:黔科合 J字(2008)2097 号］;
贵州省科技创新人才团队建设项目［编号:黔科合人才团队
(2009)4007 号］;贵州省教育厅优秀科技创新人才支持计划［编
号:黔教合 KY字(2013)148 号］。
作者简介:李 光(1980—)，男，河南商丘人，博士，副教授，主要从事
植物学和作物遗传育种研究。E － mail:lg20029@ 126． com。
通信作者:龚 宁，硕士，教授，主要从事植物生理、细胞生物学研究。
E － mail:gn2033@ 126． com。
干旱胁迫导致植物体内产生大量的活性氧，活性氧可以
导致蛋白质、膜脂、DNA 及其他细胞组分严重损伤［1 － 3］。在
植物的抗氧化酶系统中，POD 能将 H2O2 分解为无害的 H2O
和 O2，降低细胞内活性氧的浓度，对维持植物正常的生理功
能具有重要意 义［4 － 6］。金 线 兰［Anoectochilus roxburghii
(Wall．)Lindl］，别名花叶开唇兰，为兰科开唇兰属植物［7］，
生活在阴湿环境中，干旱胁迫对金线兰的伤害较其他逆境严
重。目前，金线兰组培快繁已经取得成功，已经进行工厂化生
产，但是有关金线兰组培苗抗旱的研究鲜见报道，本试验对干
旱胁迫下金线兰的 POD活性和同工酶变化进行研究，为进一
步了解干旱胁迫条件下金线兰的生理响应机制提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料为生长一致的金线兰组培苗，由贵州师范大学生命
科学学院培养室提供。
1． 2 方法
取出金线兰组培苗，无菌水将幼根冲洗干净，放入 MS营
养液中适应性培养 3 d，再移入含不同浓度 PEG6000 的溶液
中进行根际干旱胁迫处理。PEG6000 的干旱胁迫设 4 个浓度
处理:10%(处理Ⅰ)、20% (处理Ⅱ)、30% (处理Ⅲ)、40%
(处理Ⅳ)，每种处理重复 3 次。同工酶分析选择 20%
PEG6000 处理的金线兰组培苗，培养温度为(23 ± 2)℃，每天
光照 12 h(08:00—20:00)，光照强度为 3 000 lx。
1． 2． 1 粗酶液的制备 准确称取成熟鲜叶 0． 50 g，加入预冷
的酶提取液 (50 mmol /L pH 值 7． 8 磷酸缓冲液内含
0． 1 mmol /L EDTA，0． 3% TritonX － 100，4% PVP)5 mL，冰浴
充分研磨，于冷冻离心机(4 ℃)12 000 r /min 离心 20 min，上
清液即为粗酶液，冷藏备用。
1． 2． 2 过氧化物酶(POD)活性的测定 采用愈创木酚
法［8］，3． 0 mL反应混合液(50． 0 mmol /L 磷酸缓冲液 500 mL
中含 0． 28 mL 愈创木酚和 30% 的 H2O2 0． 19 mL)中加入
50． 0 μL 酶液，迅速摇匀，测 D470 nm。每 30 s读数 1 次，以每分
钟吸光度变化值表示酶活性大小，单位为 U/(min·g)。
1． 2． 3 电泳
1． 2． 3． 1 加样 浓缩胶聚合之后，小心拔出梳子，用滤纸条
吸干梳孔中的水分，并注入预冷已稀释 10 倍的电极缓冲液。
从冰箱冷冻室中取出样品，4 ℃下解冻，待样品解冻后，用微
量进样器吸取 80． 0 μL酶液，小心注入梳孔底部，同时记录样
品号和相应的样品槽号，加入 1 滴 0． 1%的溴酚蓝指示剂。
将电泳槽小心移入 4 ℃冰箱中电泳。电泳条件:120 min前电
泳电压 100 B，120 min后电泳电压 200 B，电泳时间 22 h。
1． 2． 3． 2 过氧化物同工酶染色 胶电泳完毕并经双蒸水冲
洗 3 次后，在染液(0． 1 g 联苯胺，5． 0 mL 无水乙醇，10． 0 mL
1． 5 mol /L 乙酸钠，10． 0 mL 1． 5 mol /L乙酸)中加入 6 ～ 10 滴
30% 的 H2O2，迅速摇匀后倒在凝胶上，并将染色盒置于水平
摇床上，室温下轻微摇动。待橙黄色酶带完全出现(约
15 min)后，倒出染色液，自来水冲洗，数码相机拍照后放入
7%乙酸中保存。
2 结果与分析
2． 1 干旱胁迫对金线兰组培苗叶片过氧化物酶(POD)的
影响
由图 1 可知，干旱胁迫下不同处理叶片 POD 活性总体上
呈现“M”形的变化规律，处理 1 在处理后 2 d，达到第 1 个峰
值，达 152． 94 U /(min·g)，胁迫 3 ～ 4 d 逐步降低，胁迫 5 ～
6 d再次升高，到胁迫 6 d达第 2 个峰值。处理 2、处理 3、处理
4 的第 1 个峰值在胁迫 3 d 出现。胁迫 3 ～ 5 d 逐步降低，胁
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迫 5 d达最低，胁迫 6 d 又迅速升高，达第 2 个峰值，胁迫 7 d
再次下降。各处理第 1 次的峰值大于第 2 次的峰值，第 1 次
峰值的大小顺序依次为:处理 2［298． 098 U /(min·g)］＞处理
4［232. 888 U /(min·g)］＞处理 3［195． 584 U /(min·g) ］＞处
理 1［152． 941 U /(min· g) ］。可见，金线兰对不同浓度的
PEG6000 干旱胁迫处理影响存在很大差异，其中 20% 的
PEG6000 处理，POD活性上升最高，因而选取这一浓度处理
用于后续同工酶分析。
2． 2 组培苗过氧化物同工酶分析
组培苗 POD同工酶电泳结果见图 2。从图 2 可见过氧化
物同工酶谱带共 11 条。随着干旱胁迫时间的延长，酶带表现
一定的变化。胁迫 1 ～ 2 d，在“ －”区产生 4 条新的酶带，表
明在干旱胁迫下，金线兰试管苗迅速诱导 POD 新酶带产生以
适应胁迫环境。胁迫 3 d，酶带条数减少到 5 条，与此同时
POD活性也降到最低。胁迫 4 d 起，在“ +”区产生 2 条新的
酶带，表明在干旱胁迫过程中，金线兰可能通过 2 种响应途径
产生 POD同工酶。
3 结论
水分是植物的重要组成部分，是植物赖以生存的必要条
件之一，无论是长期干旱还是短时间的水分亏缺都可能对植
物的生长发育产生不同程度的影响。近年来，国内外学者对
植物抗旱机理作了大量研究，取得了较好的研究成果，但是金
线兰分布范围较窄，长期以来人们多关注于金线兰的药效研
究，对于其抗旱性研究较少。周黎等以 3 种不同来源的金线
兰组培苗(种子苗、根状茎苗、地上茎苗)为试验材料，研究金
线兰组培苗渗透调节物质在土壤干旱胁迫下的变化规律［9］，
但是他们仅仅研究了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游离脯
氨酸受干旱胁迫后的变化情况，未提及 POD 在干逆胁迫条件
下的变化情况。POD是重要的抗旱相关酶，对金线兰干旱胁
迫下 POD活性及同工酶带的变化进行研究具有重要的意义。
本研究结果表明，在持续干旱胁迫下，金线兰 POD 同工
酶的电泳条带发生变化，即在干旱胁迫处理 1 ～ 2 d，金线兰
POD同工酶的酶带数量逐渐增加，胁迫 2 d 酶带数量达到最
大。胁迫 3 d酶带数量急剧减少到最少，胁迫 4 ～ 6 d 的酶带
数量有所回升，这个变化与金线兰 POD 活性的变化基本一
致。可能的原因是，在干旱胁迫的过程中，由于金线兰 POD
同工酶的部分酶带前体的活化，产生了新的酶带，这可能是在
干旱胁迫下，金线兰 POD 酶带在胁迫 1 ～ 2 d 有所增加的原
因。随着胁迫时间的延长，酶发生了降解或部分降解，导致部
分酶带消失或变浅，这可能就是干旱胁迫 4 d POD 同工酶酶
带减少至最少的原因。而后 3 d POD 酶带有所增加，这可能
是金线兰在受到较长时间的干旱胁迫后启动了新的 POD 的
机制。由于 POD较易失活，金线兰 POD 同工酶酶带的变化
也可能完全是由相关基因的关闭和开启造成的，即在干旱胁
迫的初期，金线兰迅速打开应急机制增加 POD 含量，随着胁
迫的持续，金线兰增加 POD 含量的应急机制逐渐失效，导致
胁迫 3 d POD酶带减少至最少，胁迫 5 ～ 7 d金线兰 POD酶带
的增加，可能是由于金线兰启动了抵抗干旱胁迫的长效机制。
然而金线兰在干旱胁迫条件下 POD 活性及酶带的变化究竟
是由哪种机制调控的，需要进一步分子生物学的研究，以深入
了解干旱胁迫下金线兰 POD相关基因表达的变化情况。
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