全 文 ：第 27卷　第 6期
2008年　　11月
环　境　化　学
ENVIRONMENTALCHEMISTRY
Vol.27, No.6
November2008
　 2007年 12月 26日收稿.
　 ＊NSFC/JST国际合作项目(No.50721140017);科技支撑项目(No.2006BAC10B03);杰出青年基金(No.50825801).
　 ＊＊通讯联系人 , E-mail:hyhu@tsinghua.edu.cn.
芦竹抑藻物质的初步分离及抑制铜绿微囊藻的效果＊
洪　喻 1, 2　胡洪营 1＊＊　黄晶晶 1　迫田章义3　下桥雅树3　李锋民 4
(1　清华大学环境科学与工程系 , 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室 , 北京 , 100084;2　北京林业大学环境科学与工程
学院 , 北京 , 100083;3　东京大学生产技术研究所 , 日本东京 , 1068558;4　中国海洋大学环境科学与工程学院 , 青岛 , 266003)
摘　要　采用乙酸乙酯提取芦竹(ArundodonaxLinn.)得到高效抑藻粗提物 , 其对产毒铜绿微囊藻的半效应
抑制浓度(EC
50 , 6d)为 50mg· l-1.粗提物经溶剂萃取分离得到中 /碱性物质及酸性物质.活性分析表明 , 酸
性物质有显著抑制铜绿微囊藻的活性.通过酸性氧化铝柱层析进一步分离酸性物质 , 得到三组弱极性抑藻
物质及一组强极性抑藻物质.培养 3d后 , 四组抑藻物质在 10mg· l-1时的抑藻率分别为 82%, 83%, 100%
以及 70%.
关键词　芦竹 , 铜绿微囊藻 , 萃取.
　　自 20世纪 90年代开始 , 水生植物化感抑藻的研究备受关注 [ 1] .许多水生植物能够产生化感物质
抑制藻类的生长 , 如芦苇(Phragmitiscommunis)[ 2] 、 穗花狐尾藻(Myriophylumspicatum)[ 3] 、凤眼莲
(Eichhorniacrasipes)[ 4] 、 金鱼藻(Ceratophylumdemersum)[ 5]等.挺水植物生物量大 , 其次生代谢物质
更加丰富 , 寻找分泌高抑藻活性的挺水植物 , 通过投放干植物体或者分离其中的抑藻化感物质 , 具有
良好的应用前景.芦竹提取物能够有效的抑制铜绿微囊藻生长[ 6] .
　　本文报道了从芦竹 (ArundodonaxLinn.)中提取化感物质的方法 , 分析了可能的化感物质类型
及对藻细胞生长特性的影响.
1　实验部分
1.1　芦竹抑藻的分离
　　大型挺水植物芦竹采自中国山东省西南部南四湖流域 , 采集时间为 3月中旬 , 植株处于发芽生长
期 , 采集植株地上部分.采集后于 60℃干燥 48h, 备用.实验所用铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)
由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供.实验前采用 BG11培养基 [ 2]预培养铜绿微囊藻 , 使之
处于对数增长期.
　　称取 1.5kg干芦竹植株(粉碎至 50目), 加入 15L乙酸乙酯常温超声波提取 2h.提取结束后 , 用
滤纸滤去提取液中的残渣 , 并通过 0.22μm有机系滤膜除去颗粒物的干扰 , 然后通过旋转蒸发
(100r·min-1 , 65℃)除去溶剂 , 得到浸膏 , 称重 , 于一定量二甲基亚砜(DMSO)中定容.浓缩液在
无菌条件下 , 通过 0.22μm无菌有机系滤膜除去微生物 , 于 4℃冰箱备用.
　　取 2g乙酸乙酯粗提物溶于 200ml乙醚 , 用 180mlNaOH(2mol· l-1)萃取.静置分层得到有机相及
水相;将上层有机相 pH值调至中性 , 用无水硫酸钠脱水 , 然后蒸干称重 , 于一定量 DMSO中定容 ,
得到中 /碱性组分 , 用于抑藻活性测试.下层水相用 300ml乙酸乙酯萃取.静置分层得到水相和有机
相.有机相 pH值调至中性 , 用无水硫酸钠脱水 , 然后蒸干称重 , 于一定量 DMSO中定容 , 得到酸性
组分 , 用于抑藻活性测试 [ 7] .
　　采用 Υ=16mm, h=300mm层析柱 , 以 40g酸性氧化铝(100— 200目)干法装柱.取 25mg上样 ,
设置一定梯度的洗脱剂洗脱 , 洗脱体积 20ml, 溶剂及比例(1L/体积):W1石油醚-乙酸乙酯 (100∶0),
W2石油醚 -乙酸乙酯(70∶30), W3石油醚-乙酸乙酯(50∶50), W4石油醚-乙酸乙酯 (30∶70), W5石
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油醚-乙酸乙酯(0∶100), W6乙酸乙酯 -丙酮 (30∶70), W7乙酸乙酯-丙酮 (0∶100), W8丙酮-水
(30∶70), W9丙酮 -水(0∶100), W10水-甲醇(30∶70), W11水 -甲醇(0∶100);蒸干 , 称重 , 并定容
于 DMSO中 , 用于抑藻活性检测.
1.2　抑藻活性检测
　　通过摇瓶实验对芦竹化感物质进行抑藻活性检测.培养混合液总体积 20ml, 其中包括处于对数
生长期的藻种液 、一定量的培养液(121℃灭菌 30min)及芦竹化感物质.芦竹化感物质设置一定浓度
梯度 , 每个浓度设三个平行样.将上述培养混合液置于温度 25℃, 相对湿度 75%, 光照强度 40—
60μmolphotons· m-2·s-1 , 光暗时间比 14h∶10h的人工气候箱中培养.
　　采用显微镜计数法 , 每天在显微镜下用血球计数板进行计数 , 测定藻密度.采用测微物尺和测微
目镜测定藻细胞大小.
　　根据藻密度计算芦竹化感物质对铜绿微囊藻的相对抑制率:
IR(%)= (1-N/N0) ×100
式中 , IR为相对抑制率 , N为加入化感物质的藻密度(个 ·ml-1), N0为对照组藻密度 (个 ·ml-1).
　　EC50的计算采用概率单位法拟合 [ 2] .使用 Origin7.0软件对数据进行处理.剂量效应采用 t检验进
行分析评价.所有实验均至少重复三次.数据由平均值 ±方差表示.显著性分析采用 99%组间差异
置信区间量化的差异表示显著性 , 区间包含零表示不显著 , 反之显著 , 区间距零愈远愈显著.
2　结果与讨论
2.1　芦竹乙酸乙酯提取物对铜绿微囊藻生长特性的影响
　　DelaGreca等人利用乙酸乙酯常温下提取马蹄莲 (Zantedeschiaaetiopica)[ 8] 、 灯心草 (Juncus
acutus)[ 9] 、 浮叶眼子菜(Potamogetonnatans)[ 10]的效率分别为 0.22%, 3.3%和 0.61%, 其中提取灯
心草的时间长达 10d.DAbrosca等人在常温下利用乙酸乙酯提取水葱(Schoenoplectuslacustris)[ 11]的效
率为 0.14%, 提取时间为 8d.由此可见 , 乙酸乙酯提取芦竹干植物体的效率较高 , 结合超声波辅助
提取可在 2h内获得较多浸出物.
　　图 1为投加乙酸乙酯提取物后铜绿微囊藻的生长曲线.由图 1可以看出 , 乙酸乙酯提取物对铜绿
微囊藻生长具有强烈的抑藻效果.高浓度组在培养 2d后抑制率达到将近 100%, 其中藻细胞稀少 ,
后续藻细胞生长无恢复.乙酸乙酯提取物 EC50, 6d值为 50mg· l-1.
图 1　投加芦竹乙酸乙酯提取物后铜绿微囊藻的生长曲线及抑制率曲线(n=3)
Fig.1　ThegrowthandinhibitionratiocurvesofM.aeruginosawiththeadditionoftheextractof
A.donaxwithethylacetat(n=3)
2.2　芦竹乙酸乙酯提取物的萃取分离组分对铜绿微囊藻生长特性的影响
　　根据物质酸碱性的差异 , 将乙酸乙酯提取物通过溶剂萃取分离得到中 /碱性组分及酸性组分.图
　6期 洪喻等:芦竹抑藻物质的初步分离及抑制铜绿微囊藻的效果 753　
2为分别投加两组分后铜绿微囊藻的生长曲线及抑制率曲线.由图 2可以看出 , 两种组分对藻细胞的
生长均有一定抑制作用.中 /碱性组分对藻生长的抑制效果低于酸性组分.酸性组分仅 10mg· l-1时
即对铜绿微囊藻的生长产生显著的抑制作用.
图 2　投加中 /碱性组分及酸性组分后铜绿微囊藻的生长曲线及抑制率曲线(n=3)
(A)乙酸乙脂提取物中碱性组分浓度 , (C)乙酸乙脂提取物酸性组分浓度
(B)乙酸乙脂提取物中碱性组分浓度 , (D)乙酸乙脂提取物酸性组分浓度
Fig.2　ThegrowthcurvesandinhibitionratiocurvesofM.aeruginosawiththeadditionofthe
neutralfractionandacidicfraction
　　Nakai等人从穗花狐尾藻(M.spicatum)浸提液中分离得到了多种酸性抑藻物质 , 包括焦棓酸和没
食子酸和(+)-儿茶素在内的酚酸类物质 [ 12] , 以及正壬酸 、肉豆蔻酸 、 棕榈酸 、硬脂酸和油酸在内的
脂肪酸类物质[ 13] .DelaGreca等人分离浮叶眼子菜(P.natans)乙酸乙酯提取物时发现存在二萜呋喃
类抑藻物质[ 10] .戴树桂等人研究宽叶香蒲 (Typhalatifolia)、 窄叶香蒲 (T.minima)和长苞香蒲
(T.angustata)的花粉混合物时发现 , 乙酸乙酯 、 丙酮以及乙醚提取物对斜生栅藻 (Scenedesmus
obliquus)、小球藻(Chlorelasp.)有良好的抑制效果 , 以乙酸乙酯提取物效果最佳 , 其抑藻效果与硫
酸铜相当 , 化感物质为棕榈酸 、胆固醇和油酸酯等[ 14] .因此 , 酸性组分中潜在的各种酚酸类 、 脂肪
酸类 、 酯类和萜类等物质具有抑藻潜力.本文发现芦竹乙酸乙酯提取物中 , 仅酸性组分抑藻效果强
烈 , 此研究结果与上述报道基本一致.
　　从酸性组分各浓度梯度抑藻效果的差异可以看出 , 10mg· l-1及 150mg· l-1时 , 其抑藻效果均低
于 50mg·l-1 , 因此 , 推断酸性组分中除存在抑藻物质外 , 仍可能存在其它促进藻生长的物质 , 其中
的抑藻物质仍需进一步分离纯化.
2.3　酸性组分的酸性氧化铝柱层析组分对铜绿微囊藻生长特性的影响
　　酸性组分经酸性氧化铝柱层析得到 11个组分 , 各组分均以 10mg· l-1的浓度用于抑藻活性检测.
图 3为投加酸性氧化铝柱层析分离组分后铜绿微囊藻的生长及抑制率曲线.由图 3可以看出 , 组分 4
对藻生长基本无影响 , 组分 6, 8, 10和 11对藻细胞生长具有一定的促进作用 , 仅组分 1— 3, 5, 7
和 9有一定抑藻活性 , 其中组分 1— 3及组分 9的抑藻率分别为 82%, 83%, 100%以及 70%.由酸性
氧化铝柱层析结果推断 , 芦竹的酸性组分中同时存在极性较弱以及极性较强的抑藻化感物质 , 其中组
分 2和组分 3在 10mg· l-1的浓度下对藻细胞的抑制即可达到 100%.上述四个强抑藻组分中的化感
物质仍有待进一步的分析鉴定 , 以确定物质结构及活性.
754　 环　　境　　化　　学 27卷
　　对已报道的具有抑藻活性的水生植物的种类和数量进行分析 , 发现抑藻水生植物中浮水以及沉水
植物约占 68%, 而挺水植物仅占 32%左右.虽然挺水植物的研究相对较少 , 但是已有的研究表明 ,
从挺水植物中发现的 β -细心醚(石菖蒲 Acorusgramineus)[ 15] 、四氢芘(灯心草 J.efusus)[ 16] 、 新木质素
类(马蹄莲 Z.aetiopica)[ 8] 、 EMA(芦苇 P.communis)[ 4]等化感物质均具有强烈的抑藻活性 , 在已发现
的抑藻化感物质中属于活性较强的一类.因此 , 挺水植物具有发现强抑藻化感物质的极大潜力.芦竹
与其他挺水植物相比具有更大生物量 、更强的环境适应性和更好耐受性 , 芦竹水浸提液可显著抑制产
毒铜绿微囊藻的生长 , 而对羊角月牙藻 、 斜生栅藻 、蛋白核小球藻无明显的抑制作用[ 6] .本文研究发
现 , 芦竹提取物酸性组分中包含多组高效抑藻物质 , 这些抑藻物质属于芦竹自身合成的化学物质 , 其
性质符合易降解 、效应浓度低等特点 , 因此 , 它们有成为良好的生物源控藻剂的应用潜力.
图 3　酸性组分组合酸性氧化铝柱层析的组分对铜绿微囊藻生长的影响(n=3)
(投加浓度 10mg· l-1 , 3d)
Fig.3　ThegrowthandinhibitionratiocurvesofM.aeruginosawiththeadditionoftheacidic-alumina
chromographyfractionsoftheacidicfraction(n=3)
3　结论
　　(1)芦竹乙酸乙酯提取物对铜绿微囊藻有显著的抑制效果 , 其半效应浓度 (EC50, 6d)值为
50mg·l-1.
　　(2)通过溶剂萃取法将乙酸乙酯提取物分离为中 /碱性物质及酸性物质 , 发现仅酸性物质在
10mg·l-1有强烈的抑藻活性.酸性物质经过酸性氧化铝层析柱分离得到四组高效抑藻组分 , 其抑藻
率分别为 82%, 83%, 100%以及 70%.另外 , 芦竹酸性组分中同时含有弱极性及强极性抑藻物质.
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PRELIMINARYISOLATIONOFINHIBITORYALLELOCHEMICALS
INTHEMACROPHYTES, ARUNDODONAXLINN.ANDEFFECTS
ONCYANOBACTERIUMMICROCYSTISAERUGINOSA
HONGYu1, 2　　HUHong-ying1　　HUANGJin-jin1　　SAKODAAkiyoshi3
SAGEHASHIMasaki3　　LIFeng-min4
(1　EnvironmentalSimulationandPolutionControlStateKeyJointLaboratory, DepartmentofEnvironmentalScience
andEngineering, TsinghuaUniversity, Beijing, 100084, China;
2　ColegeofEnvironmentalSicenceandEngineering, BeijingForestryUniversity, Beijing, 10003, China;
3　InstituteofIndustrialScience, UniversityofTokyo, Tokyo, 1068558, Japan;
4　InstituteofEnvironmentalScienceandEngineering, OceanUniversityofChina, Qingdao, 266003, China)
ABSTRACT
　　ThehighlyefectiveinhibitoryalelochemicalsofArundodonaxLinn.wereextractedbyethylacetate, of
which50% efectiveconcentration(EC50, 6d)ontoxicalgaMicrocystisaeruginosawas50mg·l-1.Bysolvent
extraction, theextractwasfractionizedintoneutralandacidicfractions.Onlytheacidicfractionhadstrong
inhibitoryactivityonM.aeruginosa.Furtherpurificationoftheacidicfractionwithacidic-aluminacolumn
chromographyrevealedthatthefractioncontainedthreelow-polarityandonehigh-polaritysub-fractions, of
whichtheinhibitionratiowas82%, 83%, 100% and70%, respectively.ArundodonaxLinn., Microcystis
aeruginosa, extraction.
　　Keywords:ArundodonaxLinn., Microcystisaeruginosa, extraction.