全 文 ：中药新药与临床药理 圆园14年 7月第 25卷第 4期
滇越金线兰中 2个丁酸衍生物对 HepG2细胞胰岛素抵抗改善作用的实验研究
赵 林 1，朱 恩 2，蔡金艳 2（1. 广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006；2. 广东药学院药科
学院，广东 广州 510006）
摘要：目的 建立 HepG2细胞胰岛素抵抗模型，并用于评价滇越金线兰中 2个丁酸衍生物对胰岛素敏感性的
改善作用。方法 采用高糖高浓度胰岛素诱导 HepG2细胞建立肝细胞胰岛素抵抗模型，研究滇越金线兰 2个
丁酸衍生物对胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖摄取和细胞活力的影响。结果 胰岛素浓度为 10-7 mol·L-1时细胞的
葡萄糖摄取量最小，为合适的模型复制浓度。与模型组比较，2 个丁酸衍生物都能显著增加胰岛素抵抗的
HepG2细胞对葡萄糖的吸收，葡萄糖摄取量分别增加了 76.7 豫和 77.8 豫，半数有效浓度（EC50）分别为 9.372和
10.854 滋mol·L-1，对胰岛素抵抗的 HepG2细胞的葡萄糖摄取呈现较好的促进作用。结论 2个丁酸衍生物对胰
岛素具有增敏活性，能有效促进胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的摄取和利用。
关键词：滇越金线兰；丁酸衍生物；HepG2细胞；胰岛素抵抗；葡萄糖摄取
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2014）04-0393-04
doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2014.04.002
Effect of Two Butanoic Acid Derivatives from Anoectochilus chapaensis on Ameliorating Insulin
Resistance in HepG2 Cells
ZHAO Lin1，ZHU En2，CAI Jinyan2（1. School of Life Science and Bio-pharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical
University，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2. School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，
Guangzhou 510006 Guangdong，China）
Abstract：Objective To establish an insulin-resistance model of HepG2 cells and to investigate the effect of two nat-
ural butanoic acid derivatives from Anoectochilus chapaensis on insulin resistance. Methods HepG2 cells were cul-
tured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM） supplemented with high glucose and high-concentra-
tion insulin to optimize the conditions for the establishment of insulin-resistance cell model. Glucose consumption in the
cells was determined by glucose oxidase method. The effects of the tested samples at different concentrations on the vi-
tality of the insulin resistant cells were evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）staining. Results Insulin resis-
tance cell model was induced successfully when the insulin concentration was at 10-7 mol·L-1. Compared with the model
group， the glucose uptake was significantly increased by 76.7 ％ and 77.8 ％，and the EC50 was 9.372 and 10.854
滋mol·L-1 in groups treated with metformin and the butanoic acid derivatives（P < 0.01）， respectively. Conclusion
The two natural butanoic acid derivatives from Anoectochilus chapaensis may be good potential candidates focusing on
improving the state of insulin resistance，and promoting the intake and utilization of glucose by the insulin-resistance
HepG2 cells.
Keywords：Anoectochilus chapaensis；Butanoic acid derivatives；HepG2 cells；Insulin resistance；Glucose uptake
收稿日期：2013-12-05
作者简介：赵林，男，博士，研究方向：中药免疫药理。Email：biozhl@126.com。通讯作者：蔡金艳，副教授，研究方向：从事天然药物活性成
分和创新药物研究。Email：caijy928@163.com。
基金项目：广东省医学科研基金项目（B2011150）；国家自然科学基金项目（81001628）；广东省自然科学基金项目（S2013010014771）。
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栽则葬凿蚤贼蚤燥灶葬造 悦澡蚤灶藻泽藻 阅则怎早 砸藻泽藻葬则糟澡 驭 悦造蚤灶蚤糟葬造 孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠，圆园14 July，灾燥造援 圆5 晕燥援 4
糖尿病是由于胰岛素在体内的绝对或相对不足
而引起糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱的疾病，主要分
为胰岛素依赖型糖尿病（T1DM）和非胰岛素依赖型糖
尿病（T2DM），其中 T2DM约占 90 %以上[1]，以胰岛素
抵抗（insulin resistance，IR）为主要特征。因此，提
高胰岛素敏感性、减轻胰岛素抵抗是治疗和预防
T2DM和延缓糖尿病发展的关键。建立胰岛素抵抗细
胞模型可以在细胞及分子水平深入分析其发生机制，
体外筛选防治胰岛素抵抗药物。本研究采用的
HepG2细胞源于人的肝胚胎瘤细胞，是一种表型与
肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，在高水平胰岛
素条件下，细胞表面胰岛素受体的数目下降，下降
程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈现正相关[2]。
因此，HepG2 细胞可作为胰岛素抵抗的理想细胞模
型，已被广泛用在细胞水平筛选改善胰岛素敏感性
的活性化合物。
滇越金线兰为兰科开唇兰属植物（Anoectochilus
Chapeansis Gagnep）的干燥全草，有清凉解毒、滋阴
降火、消炎止痛之功效[3]。本课题组通过对野生滇越
金线兰的化学成分研究[4]，鉴定了两个糖苷化的丁酸
衍生物，分别为 kinsenoside，3（R）-O-β-D-吡喃葡萄
糖基 -丁酸（γ）内酯（Ⅰ）和 4-O-β-D-吡喃葡萄糖
基 - 丁酸甲酯（Ⅱ）。前期曾对胰岛素抵抗的关键酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 1B（PTP1B）体外抑制活性筛选[5]，
结果显示两化合物对 PTP1B有不同程度的抑制作用，
尤其 kinsenoside 对 PTP1B 有非常显著的抑制作用，
活性强于阳性对照药。而 PTP1B 已公认为是治疗 2
型糖尿病胰岛素抵抗一个重要的潜在靶点[6]，通过抑
制 PTP1B可增加胰岛素和瘦蛋白的活性。本研究建
立 HepG2细胞胰岛素抵抗模型，进一步探讨滇越金
线兰中 2个丁酸衍生物是否能改善细胞对胰岛素的
敏感性，促进细胞对葡萄糖的摄取。
1 材料与方法
1.1 受试样品 丁酸衍生物Ⅰ（kinsenoside，3（R）-O
-β-D-吡喃葡萄糖基 -丁酸（γ）内酯）和丁酸衍生物
Ⅱ（4-O- β-D-吡喃葡萄糖基 -丁酸甲酯），以滇越
金线兰药材分离纯化制得，纯度在 98 ％以上。
1.2 细胞及试剂 HepG2细胞由中山大学法学院研究
所提供；结晶牛胰岛素（批号：1-5500），噻唑蓝
（MTT，批号：M2128），美国 Sigma公司；含酚红高糖
培养基（DMEM，葡萄糖含量为 25 mmol·L-1），美国
Hyclone公司，批号：NYB0805；0.25 ％胰蛋白酶，美
国 Gibco公司，批号：1255886；葡萄糖测定试剂盒，
中深百控生物科技有限公司，批号：201307133101；二
甲双胍（metformin），北京双鹤药业。
1.3 仪器 MK3 型全自动酶标仪，芬兰雷勃公司；
CO2 培养箱（Thermo model3111）、离心机（Thermo
CR3i），美国 Thermo 公司；倒置显微镜（Leica
DFC420），德国 Leica公司。
1.4 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立
1.4.1 HepG2细胞培养 HepG2细胞复苏后用含 10 ％
灭活 FBS的 DMEM培养液转入 25 mL培养瓶中，在
5 ％CO2、37 ℃条件下培养。待细胞长满后，倾去培
养基，用 0.25 ％胰蛋白酶消化，每 3天按 1∶3比例
传代 1次，待细胞从复苏适应 2 周后，在对数生长
期用于试验。
1.4.2 胰岛素溶液的配制 精密称取胰岛素适量，溶
解于羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲溶液（136
mmol·L-1氯化钠，4.7 mmol·L-1氯化钾，1.25 mmol·L-1
硫酸镁，1.2 mmol·L-1 氯化钙，0.2 ％牛血清蛋白，
20 mmol·L-1 HEPES，pH 5.4），超声、涡旋使其溶
解，定容。用时稀释成所需的浓度。
1.4.3 HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的建立 参考文
献[8-11]方法并加以改进。将处于对数生长期的细胞消
化后，以每孔 3000 个细胞接种于 96 孔培养板中，
继续培养。待细胞贴壁长至 80 ％后，分为空白对照
组和不同浓度的胰岛素处理组，每组设 6 个复孔；
各组加入含 1 ％FBS饥饿 12 h，使细胞同步化；空
白对照组加入不含胰岛素的培养液 （含 1 ％FBS），
模型组加入新配制的胰岛素浓度分别为 10-5，5×
10-6， 10-6， 5×10-7， 10-7， 5×10-8， 10-8， 5×10-9，
10-9，5×10-10，10-10，5×10-11 mol·L-1的培养液（含 1
％FBS），37 ℃、5 ％CO2培养箱中孵育 24 h，用葡
萄糖测定试剂盒[12]检测培养液上清中的葡萄糖含量，
通过数据曲线分析确定细胞生长的最佳复制模型浓
度和最佳生长浓度。
1.4.4 12 h模型稳定性考察 按照 1.4.3项下建立模型，
24 h后弃去上清液，空白对照组和模型组都加入含最
佳生长胰岛素浓度的培养基（含 1％FBS）孵育 12 h，葡
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中药新药与临床药理 圆园14年 7月第 25卷第 4期
萄糖测定试剂盒检测培养液上清液中的葡萄糖含量，
观察在 12 h内模型是否稳定维持胰岛素抵抗特性。
1.5 样品对胰岛素抵抗 HepG2细胞葡萄糖摄取和细
胞活力的影响 将处于对数生长期的细胞消化后，
以每孔 3000个细胞接种于 96 孔培养板中，继续培
养。待细胞贴壁长至 80 ％后，用含 1 ％FBS 的
DMEM高糖培养基饥饿细胞 12 h后，分为空白对照
组，模型组，不同浓度的丁酸衍生物组（每组设 4个
复孔）和二甲双胍阳性对照组。空白对照组加入含胰
岛素浓度 10-9 mol·L-1的培养基（含 1 ％FBS），模型
组和丁酸衍生物组加入含胰岛素浓度为 10-7 mol·L-1
的培养基（含 1 ％FBS）孵育 24 h后，吸取培养液。
丁酸衍生物组及二甲双胍阳性对照组分别加入
100，70，50，30，20，10 mol·L-1 的丁酸衍生物和
二甲双胍，胰岛素浓度为 10-9 mol·L-1的培养基（含 1％
FBS）。培养 12 h后检测培养液中的葡萄糖含量和细
胞活力。
1.6 统计学处理方法 采用 SPSS17.0 统计软件，计
量资料用均数±标准差（x依 s）表示，多组间比较采用
单因素方差分析，两两比较用 LSD检验。P 约 0.05为
差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度的胰岛素对 HepG2细胞胰岛素抵抗的
影响 与空白对照组比较，胰岛素处理浓度在 0~10-9
mol·L-1范围，葡萄糖的摄取量逐渐增加，到浓度为
10-9 mol·L-1时葡萄糖的摄取量较空白对照组增加了
49.5 ％；但是随着胰岛素浓度的继续增加，细胞对
葡萄糖的摄取逐渐减少。胰岛素浓度 10-7 mol·L-1的
培养基中葡萄糖摄取量较 10-9 mol·L-1时减少 23.8％，
差异有统计学意义（P = 0.002）。提示细胞生长的最
佳胰岛素浓度为 10-9 mol·L-1，而诱发 HepG2细胞产
生胰岛素抵抗模型的胰岛素最佳浓度为 10-7 mol·L-1，
见表 1。
2.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型 12 h内的稳定性研
究 见表 1。在胰岛素浓度较低时，细胞对葡萄糖的
摄取量随着胰岛素浓度的增加而增加；但到一定浓
度（5×10-9 mol·L-1）时，细胞对葡萄糖的摄取随着
胰岛素浓度的增加而开始减少；当达到最佳建模浓
度（10-7 mol·L-1）时，葡萄糖的摄取量接近最低值，
说明随着胰岛素浓度继续增加，细胞对胰岛素的敏
感性反而降低。该结果与 2.1项下的变化规律基本一
致，说明 HepG2细胞胰岛素抵抗模型复制成功，并
且在 12 h的实验期间能稳定维持胰岛素抵抗特性。
2.3 样品对 HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取
和细胞活力的影响 见表 2。模型组对葡萄糖的摄取
量较空白对照组明显减少。丁酸衍生物样品和阳性药
处理组都能增加葡萄糖的摄取量，与模型组比较差异
有统计学意义（P 约 0.01）。样品 I的浓度达到30 滋mol·L-1
时细胞对葡萄糖的摄取比模型组增加了 76.7％，在一定
的浓度范围内呈现良好的剂量依赖性。计算得样品 I
对葡萄糖摄取的半数有效浓度（EC50）为 9.372 滋mol·L-1。
样品 II浓度小于 50 滋mol·L-1时，葡萄糖的摄取量逐
渐增加，最高时葡萄糖摄取量较模型组增加了 77.8％。
但当样品浓度进一步增加时，葡萄糖的摄取量反而降
低。样品 II的 EC50为 10.854 滋mol·L-1。
与模型组比较，样品 I 和 II分别在浓度小于 50
滋mol·L-1和 30 滋mol·L-1时，细胞 A490变化较小，不
影响细胞的生长；但是当样品浓度较高时，细胞生
长受到显著影响，细胞的数量急剧减少，从而导致
葡萄糖摄取量的减少。
3 讨论
HepG2细胞株是国内外应用较广泛的研究胰岛素
抵抗机制的细胞模型[12-14]。本试验结果表明，用胰岛
表 1 不同浓度胰岛素处理组细胞的葡萄糖摄取量（x 依 s，
n=6）
Table 1 Effect of different concentrations of insulin on glucose
uptake of HepG2 cells
10-5
5×10-6
10-6
5×10-7
10-7
5×10-8
10-8
5×10-9
10-9
5×10-10
10-10
5×10-11
0
造模后
4.136±0.481**
3.815±0.334**
3.817±0.356**
3.666±0.374**
3.244±0.381**
3.912±0.337**
3.921±0.585**
3.935±0.264**
4.260±0.177**
4.046±0.165**
3.968±0.374**
3.645±0.361**
2.848±0.360
稳定性考察 12 h后
3.029±0.574*
2.827±0.187*
2.835±0.321*
2.865±0.659*
3.286±0.178*
3.851±0.474
4.389±0.517
4.359±0.325
5.254±0.211**
4.942±0.748**
4.808±0.215**
4.192±0.191
3.723±0.399
葡萄糖摄取量 /mmol·L-1胰岛素浓度
/mol·L-1
注：与空白对照组比较， *P < 0.05， **P < 0.01。
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表 2 样品对 HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取和细胞活力的影响（x依 s，n=4）
Table 2 Comparison of glucose uptake and vitality of the insulin resistant HepG2 cells in different groups
空白对照组
模型组
给药组 100
70
50
30
20
10
I
2.774±0.370
2.356±0.414
3.579±0.358**
3.372±0.191**
3.986±0.145**
4.160±0.618**
4.031±0.319**
3.525±0.543**
II
2.774±0.370
2.356±0.414
3.227±0.431**
3.201±0.686**
4.188±0.455**
4.022±0.568**
4.030±0.267**
3.518±0.297**
二甲双胍
4.395±0.288
3.686±0.225
4.500±0.290**
4.816±0.545**
4.217±0.270**
4.550±0.511**
3.991±0.560**
4.193±0.167**
I
0.803±0.064
1.242±0.058
0.976±0.074
0.953±0.057
1.265±0.013
1.191±0.061
1.242±0.064
1.260±0.059
II
0.803±0.064
1.232±0.058
1.013±0.056
1.056±0.075
1.059±0.091
1.167±0.090
1.170±0.081
1.220±0.066
二甲双胍
1.222±0.376
2.185±0.376
1.812±0.499
1.672±0.539
1.750±0.487
1.972±0.394
1.909±0.686
1.737±0.215
葡萄糖摄取量 /mmol·L-1 MTT结果（A490）
组别 浓度 /滋mol·L-1
注：与模型组比较， **P < 0.01。
素处理 HepG2细胞，在浓度为 10-9 mol·L-1时葡萄糖
的摄取最大，在 10-7 mol·L-1时葡萄糖的摄取最少，表
明 HepG2细胞产生胰岛素抵抗的最佳胰岛素浓度为
10-7 mol·L-1，细胞最适生长胰岛素浓度为 10-9 mol·L-1。
通过 12 h稳定性试验考察，验证了该模型在 12 h内
能维持对胰岛素抵抗的特性，表明胰岛素抵抗细胞
模型复制成功。
滇越金线兰中 2 个丁酸衍生物对细胞的实验结
果表明，样品 I 和 II 都能显著增加胰岛素抵抗的
HepG2细胞对葡萄糖的吸收，葡萄糖摄取量分别增加了
76.7％和 77.8％，EC50分别为 9.372和10.854 滋mol·L-1。
但是在较高浓度时，2样品均对处于胰岛素抵抗状态
的细胞活力有一定的影响。本研究在前期体外
PTP1B活性抑制试验筛选的基础[5]上，采用胰岛素抵
抗细胞模型进一步证实了滇越金线兰 2 个丁酸糖苷
化的活性化合物对胰岛素有良好的增敏作用，促进
葡萄糖的吸收，有望作为潜在的治疗 2 型糖尿病胰
岛素抵抗的候选化合物加以研究与开发。
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（编辑：梁进权）
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