全 文 ：doi:10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2016. 01. 003
滇越金线兰离体快繁及植株再生
*
包晴忠1，王娟2，3，毕玮2，3，陈芳2，3
(1. 西双版纳州林业局，云南 景洪 666100;2. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;
3. 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室;云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201)
摘要:以滇越金线兰野生植株茎段为外植体，分别对其进行诱导、增殖和生根培养基的筛选试验。结果表明，
以 3 /2 MS为基本培养基诱导效果较好;3 /2 MS + 0. 1 mg /L BA + KT 0. 5 mg /L KT + 0. 1 mg /L NAA 能有效增殖，
增殖倍数在 5 倍;在 1 /2 MS + 0. 5 mg /L IBA + 0. 5 mg /L NAA的培养基上生根率达 96. 4 %以上;在透光度 70 %
左右的林下开展了组培苗移栽试验，以腐殖土︰珍珠岩︰沙 = 2 ︰ 1 ︰ 1 配比为组培苗移栽较适宜基质，成活率
达 85. 6 %。
关键词:滇越金线兰;诱导;增殖;生根培养基;茎段;活性炭;透光度;组培苗
中图分类号:S 567. 2 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2016)01 － 0021 － 04
Rapid Propagation and Regeneration of Anoectochilus chapaensis in vitro
BAO Qing-zhong1，WAN Juan2，3，BI Wei2，3，CHEN Fang2，3
(1. Forestry Bureau of Xishangbanna，Jinghong Yunnan 666100，P. R. China;2. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. R. China;
3. Yunnan Laboratory for Conservation of Rare，Endangered ＆ Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;
Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Kunming Yunnan 650201，P. R. China)
Abstract:With the stem segments of wild Anoectochilus chapaensis plants as explants，the experiments on the se-
lection of suitable medium for induction，proliferation and rooting were conducted． The results showed that the suit-
able induction medium was 3 /2MS． When the rooting medium was 3 /2 MS + 0. 1 mg /L BA +0. 5 mg /L KT + 0. 1
mg /L NAA，it could proliferate 5 times，and when the rooting medium was 1 /2 MS + 0. 5 IBA + 0. 5 NAA，the
rooting rate could reach 96. 4 % ． Meanwhile，the tests of tissue cultural plantlets transplanting were developed，
and it demonstrated that the suitable ratio for mixed material transplanted in forest with 70 % transmittance was peat
︰ muck︰ vermiculite = 2 ︰ 1 ︰ 1，and the survival rate could reach to 85. 6 % ．
Key words:Anoectochilus chapaensis ;induction;rooting medium;stem segment;activated carbon;transmit-
tance;tissue cultural plantlet
滇越金线兰 (Anoectochilus chapaensis)是兰科
开唇兰属多年生珍稀中草药，植株粗壮 (茎粗 0. 25
～0. 8 cm)，叶片宽大 (长 2 ～ 5 cm，宽 2. 5 ～ 3. 5
cm)，叶片较厚，单株重平均 2. 5 g以上。金色叶脉
清晰，叶面红褐色，4 000 Lx 光照强度下呈紫红色，
基部鞘状抱茎［1 ～ 2］;具有清热凉血、祛风利湿、固
肾平肝等功效，近年发现对调节血糖、血脂、血压
及尿酸有较好的作用，用于治疗糖尿病、肾炎、急
慢性肝病等有显著疗效。最近研究发现，从滇越金
线兰中分离鉴定了 2 个糖苷化的丁酸衍生物，用胰
岛素抵抗细胞模型进一步证实，这 2 个丁酸糖苷化
的活性化合物对胰岛素有良好的增敏作用，促进葡
第 45 卷 第 1 期
2016 年 2 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 45 No. 1
Feb. 2016
* 收稿日期:2015 － 04 － 12
基金项目:国家林业局公益性项目 201104060。
第一作者简介:包晴忠 (1964 －)，男，高级工程师，主要从事野生植物保护研究。E-mail:356764757@ qq. com
通讯作者简介:陈芳 (1965 －)，女，正高级工程师，主要从事林木组培研究。E-mail:chenfang658@ 126. com
萄糖的吸收，有望作为治疗Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的
候选化合物加以研究与开发利用［3 ～ 5］。由于其较好
的药用和观赏价值，野生资源日渐稀少;种子没有
胚乳，发芽需有特定真菌，且发芽率在自然条件下
只有千分之一［6］。为保护和开发这一宝贵资源，本
研究在文山采集野生滇越金线兰进行离体组织培养，
建立其无性快繁体系，培育优质种苗，为保护、开
发和合理利用资源提供技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
野生滇越金线兰材料于 2012 年 9 月采自云南
文山富宁县田蓬乡大坝子山，以其带节茎段为外植
体进行试验。
1. 2 试验方法
(1)材料处理 外植体剪去叶片和叶柄，中
性洗洁精稀释 10 倍，用软毛刷轻轻刷洗干净，流
水冲洗 10 min，剪成 1 ～ 2 cm长的带节茎段，在超
净工作台上，先用次氯酸钠消毒 20 s，用无菌水冲
洗 1 次，再用 0. 1 %的 HgCl2灭菌 10 － 15 min，用
无菌水冲洗 3 ～ 4 次后，用无菌滤纸吸干水分，切
去茎段基部，接入诱导培养基中。
(2)诱导基本培养基筛选 选用 3 /2 MS、
White、Knudson C进行试验 (表 1)，添加 BA 0. 1
mg /L + KT 0. 5 mg /L + NAA 0. 1 mg /L，每种培养
基接种 30 个茎段，重复 3 次，30 天后统计诱导培
养结果。
表 1 不同基本培养基芽诱导结果
Tab. 1 Bud induction on different basic mediums
基本培
养基
接种外植
体数 /个
萌芽数
/个
芽萌动
时间 /d
诱导率
/%
芽生长
状况
White 90 60 25 66. 7 中等
3 /2MS 90 75 20 83. 3 粗壮
Knudson C 90 44 28 48. 9 偏小
表 2 不同激素配比对滇越金线兰增殖的影响
Tab. 2 Effects of different combinations of plant growth regulators on the proliferation of Anoectochilus chapaensis
处理 培养基及激素组合 /mg·L －1 外植体数 /个 新增殖芽数 /个 增殖系数 芽增殖及生长状态
1 3 /2 MS + 0. 1 BA + 0. 1 NAA 500 1 250 2. 5 芽萌动快，粗大
2 3 /2 MS + 0. 5 BA + 0. 5 NAA 500 1 400 2. 8 芽萌动快，芽粗细中等
3 3 /2 MS + 1. 0 BA + 1. 0 NAA 500 2 400 4. 8 芽萌动稍慢，芽多，细
4 3 /2 MS + 0. 1 BA + 0. 5 KT + 0. 1NAA 500 2 550 5. 1 芽萌动快，偏粗，生长旺盛
5 3 /2 MS + 0. 5 BA + 0. 5 KT + 0. 5NAA 500 3 550 7. 1 芽多，纤细
6 3 /2 MS + 1. 0 BA + 0. 5 KT + 1. 0NAA 500 4 250 8. 5 芽多，纤细
7 3 /2 MS + 0. 1 KT + 0. 1 NAA 500 1 400 2. 8 芽粗细中等
8 3 /2 MS + 0. 5 KT + 0. 5 NAA 500 1 950 3. 9 芽偏细
9 3 /2 MS + 1. 0 KT + 1. 0 NAA 500 2 150 4. 3 芽偏细
表 3 不同培养基上滇越金线兰生根效果
Tab. 3 Effects of different auxins on the rooting of Anoectochilus chapaensis
处理 培养基及激素组合 /mg·L －1 接种数 /个 生根数 /个 生根率 /% 根生长状况
1 1 /2 MS + 0. 1 NAA 500 180 36. 0 约 30 d生根，根少，细
2 1 /2 MS + 0. 5 NAA 500 260 52. 0 约 30 d生根，根细疏
3 1 /2 MS + 1. 0 NAA 500 280 56. 0 约 25 d生根，有根毛
4 1 /2 MS + 0. 5 IBA + 0. 5 NAA 500 482 96. 4 约 15 d生根，根粗壮，密被根毛
5 1 /2 MS + 1. 0 IBA + 0. 5 NAA 500 451 90. 0 约 15 d生根，根毛多
6 1 /2 MS + 1. 5 IBA + 0. 5 NAA 500 433 86. 6 约 15 d生根，根部分粗畸形
7 1 /2 MS + 0. 1 IBA 500 198 39. 6 约 30 d生根，根细
8 1 /2 MS + 0. 5 IBA 500 325 65. 0 约 25 d生根，有根毛
9 1 /2 MS + 1. 0 IBA 500 314 62. 8 约 20 d生根，密被根毛
(3)增殖培养基筛选 以 3 /2 MS 为基本培养
基，添加 BA、KT、NAA 3 种激素不同浓度及配比
进行试验，共设计了 9 组培养基 (表 2)。
(4)生根培养基筛选 当增殖苗生长到 3 ～ 4
22 西 部 林 业 科 学 2016 年
cm，2 ～ 3 节时，即可切断进行生根诱导培养，生
根培养基设计见表 3。
以上培养基加 6. 0 g /L 的琼脂，25 g /L 的蔗
糖，pH 5. 8，在增殖和生根培养基中均添加 0. 5 %
的活性碳，培养温度 22 ～ 25 ℃，光照强度 3 000
Lx，光照时间 8 h /d。增殖及生根培养基的每个处
理接种 50 瓶，每瓶接种 10 芽，50 天后统计结果
(表 2 和表 3)。
(5)移栽试验 移栽滇越金线兰根肉质，根
系不发达，无须根，每节一般仅生长 1 条根，每苗
2 ～ 3 条根，根据以上特点选择以下 3 种基质进行
试验:①腐质土︰珍珠岩︰蛭石 = 1 ︰ 1 ︰ 1;②
泥土︰珍珠岩 = 3 ︰ 1;③腐质土︰珍珠岩︰沙 =
2 ︰ 1 ︰ 1。移栽设在常绿阔叶林下，郁闭度约
70 %，林间做床，移栽基质用多菌灵 500 倍稀释
喷洒消毒，把经炼苗处理的试管生根苗揭开封口膜
放置 3 － 5 天，取出小苗用清水洗净，移栽到备好
的托盘中，每种基质移栽 500 株小苗，定根水淋透
后，视天气及基质情况，适时浇水，60 天后统计
移栽成活情况。
1. 3 结果观察及统计
诱导、增殖及生根培养均在接种 30 － 50 天后，
观察芽及出根情况，芽及根长到 0. 5 cm 以上的进
行计数，与接入总数进行百分比计算，分别计算诱
导、增殖及生根率。
2 结果与分析
2. 1 诱导培养基筛选
通过试验，发现滇越金线兰外植体在添加 BA
0. 1 mg /L + KT 0. 5 mg /L + NAA 0. 1 mg /L 的 3 /2
MS、White、Knudson C这 3 种基本培养基中培养，
均诱导产生不定芽，诱导率在 48 %以上，诱导培
养时间在 20 － 28 天之间。但不同基本培养基其诱
导结果和后续生长情况存在一定差异，其中 3 /2 MS
培养基诱导时间最短 (20 天)，诱导率 (83. 3 %)
最高，诱导出的侧芽生长健壮，叶色紫褐，金色叶
脉明显;White培养基的诱导结果次之;Knudson C
培养基的诱导结果较差，虽然 Knudson C 对其他兰
科植物诱导效果较好［7］，但对滇越金线兰不太适
宜。结果表明，茎段作为外植体诱导建立无菌快繁
体系以 3 /2 MS培养基为宜。
2. 2 增殖培养
植物激素是启动组培芽增殖最灵敏的 “钥
匙”，添加不同激素和浓度的筛选试验，继代 3
次，其增殖和生长情况见表 2。由表 2 可知，仅添
加 BA 或 KT 和 NAA 配比的培养基的增殖系数较
低，但苗健壮，随其浓度的增加，芽增殖系数逐渐
提高，可达 6 ～ 10 倍，但苗纤细;而 BA 和生长素
NAA组合的培养基，比用 KT 与 NAA 的培养基的
增殖及苗长势较好些，处理 4，即 0. 1 mg /L BA +
0. 5 mg /L KT + 0. 1 mg /L NAA 培养基配比效果最
优，芽增殖达 5 倍，芽 20 天萌动，形成毛状须根，
叶片呈红褐色，金黄色叶脉明显;滇越金线兰继代
周期约为 70 天左右，应及时转接，培养时间过长，
芽太长，生长空间不够，营养耗尽，影响长势，继
代后需较长时间恢复，影响整个繁育体系的扩增。
2. 3 生根培养
生长素 IBA及 NAA能有效促进植物组织生根，
以 1 /2 MS 为基本培养基添加不同浓度和配比的
IBA及 NAA进行生根筛选试验。
9 种培养基均能诱导滇越金线兰生根 (表 3)，
根萌发时间在 15 － 30 天，单一生长素对根的诱导
培养效果不理想，生根率在 36 % ～65 %;NAA与
IBA的配比效果较好，其最佳浓度及配比为处理
4，即 1 /2 MS + 0. 5 mg /L NAA + 0. 5 mg /L IBA 诱
导时间最短 (15 天)，生根率达 96. 4 %，基部 3
～ 4 节均生根，植株健壮，根每节 1 条根，偶见 2
条根，密被根毛，具有典型的兰科植物气生肉质根
系特征。
表 4 不同移栽基质下滇越金线兰生长效果
Tab. 4 Effects of different culture substrates on the growth of Anoectochilus chapaensis
移栽基质 移栽数 /株 成活数 /株 成活率 /% 生长状况
1 腐质土︰ 1 珍珠岩︰ 1 蛭石 500 366 73. 2 中等
3 泥土︰ 1 珍珠岩 500 256 51. 2 植株生长缓慢，部分根出现腐烂
2 腐质土︰ 1 珍珠岩︰ 1 沙 500 428 85. 6 植株增重 1 倍以上，健壮
2. 4 炼苗移栽
本试验采用了 3 种移栽基质进行滇越金线兰组
培苗的移栽试验 (表 4)，结果表明，在腐殖土︰珍
珠岩︰沙 = 2 ︰ 1 ︰ 1 配比的基质，移栽成活率达
32第 1 期 包晴忠等:滇越金线兰离体快繁及植株再生
85. 6 %，植株生长健壮，叶片宽大，增重明显;而
在其他 2种基质中移栽成活率在 51. 2 % ～ 73. 2 %，
植株增重不明显，叶片偏小，特别是泥土和珍珠岩
配比的基质，由于通透性较差，根容易腐烂。
3 讨论
滇越金线兰喜在阴凉、湿润地方生长，茎干粗
壮，叶片宽大，单株生物量平均 2. 5 g 以上。适宜
的人工栽培条件下密植有利于提高其单位面积产
量，但野生植株体在野外阴湿地区生长，携带大量
细菌、真菌等微生物，以致在组培初代培养时，污
染率偏高。本试验采用次氯酸钠和 HgCl22 次灭菌
处理外植体，能有效地降低污染率，提高诱导率，
无菌体系一旦建立，即可转入增殖培养基中继代培
养，可快速建立无菌繁育体系。
本试验发现，滇越金线兰对细胞分裂素比较敏
感，添加的 0. 5 mg /L BA，即可诱导丛生不定芽，
细胞分裂素添加过多，会刺激金线兰基部茎萌蘖大
量芽，通过调节激素，诱导腋芽萌发侧芽，切割侧
芽，诱导萌发下一级侧芽，从而快速有效地建立起
快繁体系，但激素添加过多，丛芽太细，种植后单
株产量太低，植株抗逆性差，易得病，应适当控制
激素的添加比例，保持适当合理的增殖率。
滇越金线兰很容易生根，添加吲哚丁酸或萘乙
酸即可生根，但两者适当比例配比，生根率会得到
极大提高;移栽时选疏松、透气、富含有机质的腐
质土，能有效地提高其成活率及单位面积生长量。
参考文献:
［1］中国科学院中国植物志编委． 中国植物志(第 17
卷)［M］．北京:科学出版社，2006:224 － 225．
［2］张铁，万京，沐建华．文山地区金线莲种质资源初步
调查［J］．文山师范高等专科学校学报，2005，18(1):26 －
28．
［3］赵林，朱恩，蔡金艳．滇越金线兰中 2 个丁酸衍生物
对 HepG2 细胞胰岛素抵抗改善作用的实验研究［J］．中药新
药与临床药理，2014，25(7):393 － 396．
［4］蔡金艳，王义娜，朱恩，等． 滇越金线兰对高脂饮食
联合 STZ诱导的大鼠血糖、血脂和肾功能的影响［J］． 中药
新药与临床药理，2012，28(2):116 － 119．
［5］王义娜，蔡金艳，赵林，等． 滇越金线兰化学成分研
究［J］．中药材，2012，35(6):911 － 913．
［6］蔡文燕，肖华山，范秀珍．金线莲研究进展［J］．亚热
带植物科学，2003，32(3):68 － 72．
［7］刘庆昌，吴国良．植物细胞组织培养［M］． 北京:中
国农业大学出版社，2002:
檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭
240．
［上接第 20 页］
［21］王晗，王永，纪燕玲，等． 分离自黑茶的散囊菌属真
菌中的 NRPS基因的检测和分布［J］．微生物学通报，2013，
40(3):464 － 475．
［22］朱鹏，郑立，林晶，等． 抗菌和细胞毒活性海洋细菌
的筛选及其次生代谢基因证据［J］． 微生物学报，2007，47
(2):228 － 234．
［23］陆胜利，祁超． 海洋放线菌 S． areniocola CNS-205
腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化［J］．华中师范大学学
报(自然科学版)，2014，48(6):876 － 884．
［24］彭玉娇，李敬龙，林学政． 极地抗植物病原真菌活
性菌株 PKS和 NRPS基因的克隆与分析［J］．海洋科学进展，
2014，32(3):396 － 404．
［25］王毅，周旭，许宰铣，等． 长松萝中一个聚酮合酶基
因簇的克隆和鉴定［J］．微生物学报，2014，54(7):770 － 777．
［26］薛庆中． DNA 和蛋白质序列数据分析工具［M］．
北京:科学出版社，2010:75 － 106．
［27］靳菊情，石娟，葛萍，等． 长松萝多糖对小鼠免疫功
能的影响［J］．中国药学杂志，2003，38(6):431 － 432．
［28］拉喜那木吉拉，包海鹰，图力古尔． 松萝属地衣类
化学成分及药理活性研究进展［J］．中国中药杂志，2013，38
(4):539 － 545．
［29］叶嘉，张浩，张宁． 不同海拔高度黄梅衣属地衣松
萝酸含量的测定［J］． 湖北农业科学，2014，53(6):1415 －
1417．
［30］Torsten S，Henning D M，Marahiel M A． The specifici-
ty-conferring code of adenylation domains in nonribosomal pep-
tide synthetases［J］． Chemistry ＆ Biology，1999，6:493 － 505．
［31］Barbara B． U，Philippe E． R，Dario C． Draft genome
sequence of the grapevine dieback fungus Eutypalata UCR-EL1
［J］． GenomeAnnounce，2013，1(3):e00228 － 13．
［32］Valarmathi R，Hariharan GN，VenkataramanG，et al．
Characterization of a non-reducing polyketide synthasegene from
lichen Dirinaria applanata［J］． Phytochemistry，2009，70(6):
721 － 729．
［33］许灵波，申屠旭萍，陈宵峰，等． 银杏内生真菌 No．
1028 的培养条件及其代谢产物对作物真菌病害的抑制作用
［J］．菌物研究，2006，4(2):25 － 29．
［34］朱鹏．珍珠膜海绵共附生微生物 PKS与 NRPS的筛
选与模块结构研究［D］．杭州:浙江大学，2008．
42 西 部 林 业 科 学 2016 年