全 文 ：中国医药导报 2016 年 10月第 13卷第 30期
CHINA MEDICAL HERALD Vol. 13 No. 30 October 2016
·论 著·
黄草乌（Aconitum vilmorinianum Kom.）是毛茛科
（Ranunculaceae）多年生草本植物，俗称大草乌、昆明
乌头，主要分布在云南中部、四川会理及贵州西部，生
长于海拔 2100~2500 m 间山地灌丛中。黄草乌在云南
素有“大补药”之称，是云南白药的主要原料之一，可
治跌打损伤、风湿等症[1-2]。黄草乌野生资源丰富，且易
栽培，已有人工种植基地。 黄草乌根部富含二萜生物
碱成分[3-4]，该类成分具有复杂的化学结构和显著的药
理活性[5-7]。
植物内生真菌（endophyte fungi）是非常重要的微
生物资源， 几乎所有植物组织内都存在内生真菌，其
发酵产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性 [8-9]。
自 Strierle 等[10]发现红豆杉的内生真菌紫衫霉可产紫
杉醇后，引发了利用内生真菌来替代原植物的研究热
潮。很多植物中都发现了能够产和宿主相同结构的活
性次生代谢产物的内生真菌，如白喉乌头根部的内生
真菌芽枝状枝孢 （Cladosporium cladosporioides）可产
乌头碱[11]。 为保护黄草乌野生植物资源，缓解我国中
药资源日益减少与需求量不断增加之间的矛盾，本研
究对黄草乌根部的内生真菌进行了分离与鉴定，为黄
草乌的中药资源保护和开发利用提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄草乌新鲜健康植株于 2015 年 10 月采集于云
南省昆明市盘龙区，由昆明医科大学杨淑达副教授鉴
定，标本（2015-yc-1）保存于云南大学化学科学与工
程学院。葡萄糖、琼脂粉、NaClO购于上海泰坦科技股
份有限公司（上海），青霉素及卡那霉素购于阿拉丁
（北京），酒精购于天津化学试剂有限公司（天津）。
1.2 内生真菌的分离与培养
1.2.1 分离培养基 PDA 培养基：去皮马铃薯 200 g 煮
沸 30 min，加入葡萄糖 20 g，琼脂粉 12 g，纱布过滤，
滤液定容至 1000 mL，pH自然，121°C灭菌 30 min。
1.2.2 分离与培养 黄草乌的根用自来水冲洗干净，截
成 6~8 cm 长条， 晾干水分后于 5% NaClO 溶液漂洗
60 s，无菌水冲洗三次，然后于 75%酒精漂洗 60 s，最
黄草乌根部内生真菌的分离与鉴定
尹田鹏 1，2 俞 静 1 王家鹏 1 蔡 乐 1▲ 丁中涛 1
1.云南大学化学科学与工程学院，云南昆明 650091；
2.遵义医学院珠海校区珠海市中药基础及应用研究重点实验室，广东珠海 519041
[摘要] 目的 从黄草乌的根部分离鉴定内生真菌。 方法 利用 PDA 培养基进行黄草乌根部内生真菌的分离与纯
化， 根据菌落的形态特征并结合真菌的 ITS 序列进行菌株鉴定。 结果 从黄草乌根部共分离到内生真菌 52 株，
鉴定为 20 属 34 种，绝大部分属于子囊菌门，其中镰刀菌属和青霉菌属为优势属。 结论 黄草乌根部的内生真菌
具有多样性，可作为潜在的资源供药物筛选。
[关键词] 黄草乌；内生真菌；镰刀菌属；青霉属
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0009-04
Isolation and identification of endophytic fungi from the roots of Aconi-
tum vilmorinianum
YIN Tianpeng1，2 YU Jing1 WANG Jiapeng1 CAI Le1▲ DING Zhongtao1
1.School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Yunnan Province, Kunming 650091, China;
2.Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research in Traditional Chinese Medicine, Zunyi Medical Uni-
versity Zhuhai Campus, Guangdong Province, Zhuhai 519041, China
[Abstract] Objective To isolate and identify the entophytic fungal in the roots of Aconitum vilmorinianum. Methods
PDA medium was used to isolate and purify the endophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum. The purified
strains were identified by morphology together with ITS sequence. Results Fifty-two strains of endophytic fungi were
isolated and identified belonging to 34 species, 20 genera. Most of the isolated fungi are belong to the Ascomycota.
Fusarium and Penicillium are the dominant families. Conclusion The entophytic fungi in the roots of Aconitum vil-
morinianum are diverse, which can serve as potential resource for drug screening.
[Key words] Aconitum vilmorinianum; Entophytic fungal; Fusarium; Penicillium
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81460648）。
▲通讯作者
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CHINA MEDICAL HERALD Vol. 13 No. 30 October 2016
后无菌水冲洗三次则表面消毒处理完毕。无菌状态下
将根切成 2 mm3小块，置于分离平板培养基（28±1）°C
静止培养，培养基需预先加入青霉素（100 mg/L）和卡
那霉素（100 mg/L）以抑制细菌生长。 3~7 d 后培养基
中可见菌落形成， 挑取组织周围的菌落转接入 PDA
斜面。 采用平板梯度稀释法纯化分得的内生真菌，根
据其主要菌落形态特征（菌落大小、颜色、表面特征和
质地）和菌体个体形态特征（菌丝、子实体和孢子形
态），按微生物分类的不同将同一类群进行归类。最后
将已纯化和归类的菌株分别转入 PDA 斜面，在（28±
1）°C下培养。
1.3 内生真菌的鉴定
采用插片培养方法对分离的内生真菌进行显微
形态特征的观察、鉴定，在显微镜下观察子实体特征，
结合培养特性，将菌株鉴定到属。 然后依据不同属的
分类标准，参照文献的方法进行种的鉴定[12]。
1.4 分子生物学信息分析
在 PDA 平板上恒温培养内生真菌 5 d 后在无菌
条件下用刀片刮取菌丝至 1.5 mL 离心管收集菌丝
体。 在研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，立即
装入 1.5 mL 离心管中，用真菌 DNA 提取试剂盒提取
基因组 DNA，置于-20°C冰箱中保存备用。 提取基因
组 DNA 后，用引物 ITS4 进行扩增，扩增产物交由昆
明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果进行
Blast比对。
2 结果
从黄草乌的根部共分离得到 52 株内生真菌，经
形态学和 ITS 分子测定鉴定为 20 属 34 种见表 1。
从表 1 中可以看出， 分离得到的黄草乌的根部内生
真菌绝大部分分布在子囊菌门 （Ascomycota）（44 株
29 种）。 子囊菌门的菌株在纲、目、科、属等分类水平
上具有丰富的多样性，分离鉴定的真菌包括子囊菌门
的 4 纲、7 目、9 科、16 属， 其中地丝霉属（Geomyces）
和漆斑菌属（Myrothecium）在科的水平上未分类[13]。属
于接合菌门的菌株仅有 4 株 2 种，都为接合菌纲毛霉
菌目毛霉菌科毛霉菌属。另外有 4株 3种的真菌属于
担子菌门， 分布于担子菌门的 1 纲、2 目、3 科、3 属
中。 在纲的分类水平上，粪壳菌纲有 24 株，占分离
AV1001
AV1003
AV1012
AV1013
AV1021
AV1015
AV1077
AV1029
AV1051
AV1036
AV1041
AV1031
AV1057
AV1048
AV1035
AV1027
AV1033
AV1057
AV1059
AV1019
AV1017
AV1039
AV1040
AV1020
AV1034
AV1035
AV1042
AV1010
AV1043
AV1037
AV1046
AV1027
AV1047
AV1053
Mucor racemosus f.sp. racemosus
Mucor hiemalis
Fusarium solani
F. avenaceum
F. oxysporum f.sp. ciceris
F. tricinctum
Volutella rosea
Ilyonectria radicicola
Acremonium nepalense
Acremonium furcatum
Myrothecium inundatum
Ophiognomonia apiospora
Nigrospora oryzae
Plectosphaerella cucumerina
Verticillium zaregamsianum
Aspergillus sydowii
Aspergillus tubingensis
Aspergillus versicolor
Penicillium chrysogenum
Penicillium cordubense
Penicillium griseofulvum
Penicillium variabile
Penicillium virgatum
Penicillium commune
Penicillium oxalicum
Penicillium swiecickii
Penicillium verrucosum
Alternaria alternate
Pyrenochaeta inflorescentiae
Cladosporium cladosporioides
Geomyces pannorum
Coprinopsis atramentaria
Physisporinus vitreus
Pycnoporus coccineus
LN809049
HQ845045
LC034159
KJ188670
KR364596
KT779291
KM231769
DQ093767
EU326201
JQ647429
KJ767119
NR120075
AB975292
KJ573078
JN188008
KR063145
KR296900
KR703618
KR296886
KJ191427
KR703615
HM469398
JF439503
KU203773
KU504312
AJ608946
KP890402
KP739875
GU586851
KU182497
AJ549922
FJ478115
JN182920
KR673511
100
100
100
100
100
99
100
99
100
100
99
99
100
100
100
100
100
99
100
100
99
100
100
99
99
100
100
100
99
100
99
100
99
99
1
3
2
4
3
3
1
1
1
2
1
1
2
2
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
编号 种名 NCBI登录号 相似度 数量（株）
表 1 黄草乌根部内生真菌分离鉴定的相关信息
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中国医药导报 2016 年 10月第 13卷第 30期
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接合菌门
子囊菌门
担子菌门
接合菌纲
粪壳菌纲
散囊菌纲
座囊菌纲
锤舌菌纲
担子菌纲
毛霉菌目
肉座菌目
间座壳目
假毛球壳目
Glomerellales
散囊菌目
格孢腔菌目
煤炱目
未定
伞菌目
多孔菌目
毛霉菌科
丛赤壳科
生赤壳科
未定
日规壳科
假毛球壳科
Plectosphaerellaceae
发菌科
暗球腔菌科
小球腔菌科
Davidiellaceae
未定
鬼伞科
革菌科
多孔菌科
毛霉菌属 Mucor
镰刀菌属 Fusarium
周刺座霉属 Volutella
土赤壳属 Ilyonectria
枝顶孢属 Acremonium
漆斑菌属 Myrothecium
蛇孢日规壳属 Ophiognomonia
黑孢属 Nigrospora
Plectosphaerella
轮枝孢属 Verticillium
曲霉属 Aspergillus
青霉菌属 Penicillium
链格孢属 Alternaria
棘壳孢属 Pyrenochaeta
枝孢属 Cladosporium
地丝霉属 Geomyces
鬼伞属 Coprinopsis
亚卧孔菌属 Physisporinus
密孔菌属 Pycnoporus
4
12
1
1
3
1
1
2
2
1
4
11
1
1
2
1
1
2
1
门 纲 目 科 属 数量
表 2 黄草乌根部内生真菌类群组成
总数的 46.2%，包括 10 属 13 种。其次为散囊菌纲，有
15株，包括 2 属 12 种。 在目的分类水平上，优势目为
肉座菌目，具有 18 株 9 种的内生真菌，其次为散囊菌
目，有 15株 12 种。 丛赤壳科和发菌科为黄草乌的优
势菌群，分别有 14株 6 种和 15株 12 种。从属的层面
上看，镰刀菌属共分离得到 12 株 4 种，是黄草乌内生
真菌的优势属种；其次是青霉菌属，有 11 株 9 种，曲
霉属有 4株 3 种见表 2。
3 讨论
李治滢等 [14]曾报道从黄草乌的根和茎中分到
12 个属的内生真菌， 主要有镰刀菌属、 毛壳菌属
（Chaetomium）、黑孢属和青霉属等。 本研究对黄草乌
根部内生真菌菌群的分析，从中鉴定了 19 属 34 种的
内生真菌， 其中有 14 属的真菌首次从黄草乌中分离
得到。
本研究所得黄草乌根部的内生真菌类群普遍被
认为腐生性较强，但是所采集的样本全部来自健康植
株，宿主未表现受到伤害或感染病害的症状，应该不
会给腐生性真菌提供生长基质。因此认为这些真菌是
内生的或至少是部分内生且不引起植物病害，它们符
合植物内生真菌的有关定义 [15-16]。 本研究还发现镰刀
菌属是黄草乌根部内生真菌的优势属种，在本实验中
分离得到的 4种镰刀菌属的真菌：腐皮镰刀菌（Fusar-
ium solani）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、三隔
镰刀菌 （Fusarium tricinctum） 尖孢镰刀菌（Fusarium
oxysporum f. ciceris）均被报道能引起植物病害[17-18]，可
以认为是潜伏的致病菌。本研究中亦从黄草乌中分离
得到芽枝状枝孢，该菌曾被报道可产生二萜生物碱类
化合物乌头碱，本研究所分离得到的芽枝状枝孢是否
能在一定的培养条件下产生二萜生物碱则有待进一
步研究。
结合文献报道及本研究的结果，表明乌头属植物
中的内生真菌具有丰富的多样性 [19-20]。 内生真菌的次
生代谢产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性，
乌头属植物内生真菌可作为潜在资源供药物筛选。对
黄草乌内生真菌的活性代谢成分进行系统而深入的
研究，有利于保护植物资源、开发新型药物，我们将在
今后的工作中有针对性地进行菌株的活性筛选和成
分分离。
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（下转第 48页）
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