全 文 ：薛兴华，司庆永，龚 宁． 外源 Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同工酶的影响［J］． 江苏农业科学，2016，44(4) :229－232．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002－1302． 2016． 04． 064
外源 Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同工酶的影响
薛兴华，司庆永，龚 宁
( 贵州师范大学生命科学学院/贵州省植物生理发育调控重点实验室，贵阳 550001)
摘要:以金线兰组培苗为材料，采用分光光度法和同工酶电泳技术研究了外源 Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同
工酶的影响。结果表明: 不同浓度的Ca2+处理能够使金线兰 SOD、CAT、POD、APX 活性呈现一定的升降变化，其中
SOD酶活呈“M”形的变化趋势，CAT酶活呈先升后降的趋势，APX酶活在较高浓度的 Ca2+处理下较其他酶慢，POD变
化范围较大;同工酶分析发现，不同浓度的Ca2+处理，在一定时间范围内可诱导产生新的 POD和 APX酶带表达，而不
诱导新的 SOD和 CAT酶带的表达。
关键词:金线兰;Ca2+;抗氧化酶;同工酶
中图分类号:S682． 310． 1 文献标志码:A 文章编号:1002－1302(2016)04－0229－04
收稿日期:2015－09－02
基金项目: 贵州省中药材现代产业技术体系建设专项( 编号:
GZCYTX－02) ;贵州省科学技术基金［编号: 黔科合J 字(2008)
2097］。
作者简介:薛兴华 (1991—) ，女，山西运城人，硕士研究生，研究方向
为药用植物资源开发与利用。E－mail:798913863@ qq． com。
通信作者: 龚 宁，教授，从事药用植物资源开发与利用方向。
E－mail:gn2033@ 126． com。
金线兰(Anoectochilus roxburghii (Wall．)Lindl) ，兰科开唇
兰属的一种多年生草本植物，具有极高的药用价值，且株型小
巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是一种观赏价值极高
珍品，具有广阔的开发利用前景。但由于金线兰的自身抗性
较差，对环境要求极高，以至于其资源的开发利用受到限制。
Ca2+不仅是植物必需的营养元素，同时也是细胞信号转导过
程中重要的第二信使，与植物的抗氧化酶系统密切相关，通过
调节相关抗氧化酶活性提高植物对逆境的适应能力［1－2］。关
于金线兰的报道多集中在组培和胁迫相关的生理响应机制研
究［3－7］，而作为重要的信号转导物质，Ca2+对金线兰抗氧化酶
活性及同工酶影响的研究未见报道。因此本试验对金线兰组
培苗进行不同浓度的 Ca2+处理，测定 SOD、POD、APX、CAT的
活性，同时对同工酶进行研究，探讨信号物质 Ca2+对抗氧化酶
的活性及同工酶的影响，为 Ca2+与抗氧化酶系统关系研究提
供一定基础，为金线兰抗逆机理研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料的培养
试验材料金线兰组培苗由贵州师范大学金线兰课题组提
供。将处于增殖期且生长时间一致的金线兰组培苗转接到生
根培养基中，培养 60 d 后，选取长势一致的生根组培苗，备
用。培养条件:光照12 h /d，光照度 2 000 lx，温度(21±2)℃。
1． 2 材料的处理
取已经生根的金线兰组培苗，分别在添加 0． 5、1． 5、
2． 5 mmol /L CaCl2 的 MS培养液中处理 6、12、24、48、72 h，对
照(CK) 为MS培养液处理。
1． 3 测定方法
1． 3． 1 粗酶液的制备 参照王爱国等的方法［8］制备粗酶
液:金线兰成熟鲜叶去掉主脉，准确称取1 g，加入 5 mL 预冷
的酶提取缓冲液，冰浴充分研磨，于低温离心机 12 000 r /min
离心 20 min，上清液即粗酶液，冷藏备用。
1． 3． 2 酶活测定 SOD 活性测定: 参考王爱国等的方法［8］
稍作修改，先加入 150 μL 粗酶液，然后依次加入 2． 7 mL
14． 5 mmol /L 的 L －甲硫氨酸，0． 1 mL 3 mmol /L EDTA，
0． 1 mL 2． 25 mmol /L NBT和 0． 1 mL 60 μmol /L 核黄素。混
匀后倒入比色杯，在 3 000 lx 下光照 10 min，反应后立即避
光，将反应液颠倒几次混匀后立即测 D560 nm值，以不加粗酶液
而加酶提取液为最大光还原管，以 PBS 液代替 NBT 作为空
白，以能抑制 NBT光化还原 50%为 1 个酶活力单位 U，酶活
力按下式计算，单位为:U /g。
计算公式:
反应抑制率 =
(对照D560 nm－对照空白 D560 nm)－(样品D560 nm－样品空白 D560 nm)
(对照D560 nm－对照空白 D560 nm)
×100%;
酶活力(U /g)= 反应抑制率50% ×3 mL反应混合液中加入的样量。
POD 活性测定采用愈创木酚法［9］。3 mL 反应混合液
(500 mL 50 mmol /L PBS pH 值 7． 8 + 0． 28 mL 愈创木酚 +
0． 19 mL 30%H2O2) 中加入50 μL 酶液，迅速摇匀立即测
D470 nm，每 30 s读数 1 次，以 1 min D470 nm升高 0． 1 的 D 值为 1
个酶活力单位 U，单位为 U /(min·g)。
APX活性测定参照 Dalton等的方法［10］，略作改进。3 mL
反应混合液(50 mmol /L PBS pH 值 7． 0+0． 1 mmol /L EDTA－
Na2 +0． 5 mmol /LAsA，10 mmol /L H2O2) 加入100 μL 粗酶液
启动反应，连续记录 D290 nm，10 s 读数 1 次，以 1 min D290 nm降
低 0． 1 的 D值为 1 个酶活力单位 U，单位为U /(min·g)。
CAT活性测定参照程鲁京等的钼酸铵显色法［11］，略作改
进。所有药品在室温下恒温，然后在空白管(B2) 加1 mL
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65 μmol /L H2O2 基质液，空白管(B3) 中加入1 mL 60 mmol /L
PBS缓冲液(pH值为 7． 4) ，空白管(B1) 中加1 mL 65 μmol /L
H2O2基质液，样品管(U) 中加0． 2 mL 粗酶液和 1 mL
65 μmol /L H2O2 基质液，37 ℃水浴保温 1 min 后加入 1 mL
32． 4 mmol /L 钼酸铵溶液，混匀后在 B2 管和 B3 管分别加入
0． 2 mL 60 mmol /L钠－钾磷酸盐缓冲液(pH值 7． 4) ;在B1 管
加入 0． 2 mL粗酶液。5 min后于 405 nm 处以蒸馏水调零比
色，记录吸光度(D)。酶活力以清除 H2O2的 mg数表示，按下
式计算，单位为 mg /(min·g)。
酶活力［mg /(min·g) ］=
DB1 －DU
DB2 －DB3
× 65×1×340． 2×0． 2×1 000。
1． 3． 3 同工酶分析 分离胶浓度为 7． 5%，浓缩胶浓度为
2． 5%，pH 值为 8． 3 的 Tris － Gly 电极缓冲液。上样量为
40 μL。电泳开始时，电流设为 10 mA，当指示剂溴酚蓝进入
分离胶后，调电流至 15 mA。电泳时间视酶分子量而定，一般
至指示剂距凝胶前沿 1 cm为停止时间。
1． 3． 3． 1 加样 浓缩胶聚合完成后，缓慢拔出样品梳，注入
预冷已稀释 10 倍的电极缓冲液。用微量进样器吸取 40 μL
处理后的酶液(10 μL 酶液、20 μL 40%的蔗糖溶液、10 μL
2%的溴酚蓝指示剂) ，依次加入加样槽中。
1． 3． 3． 2 酶活性染色 SOD 活性染色: 参照文献［12］的方
法，略作改进。电泳结束后，将胶浸泡于染色液 2． 45 mmol /L
NBT中，避光浸泡 20 min，并不时摇动，蒸馏水漂洗，再放入
0． 036 mol /L(pH 值 7． 8) 磷酸缓冲液( 含0． 028 mol /L
TMEDA，28 μmol /L 核黄素) ，避光浸泡15 min，并不时摇动，
蒸馏 水 漂 洗，放 入 0． 05 mol /L PBS ( 含0． 1 mmol /L
Na2 －EDTA) (pH 值 7． 8) ，4 × 8 W 日光灯下照光 20 ～
30 min，直至出现无色谱带，蒸馏水漂洗 2 ～ 3 次，拍照。
POD活性染色: 参照Ｒahnamal 等的方法［13］，稍作改动。
染色液:0． 1 g联苯胺、5 mL无水乙醇、10 mL 1． 5 mol /L 乙酸
钠、10 mL 1． 5 mmol /L 乙酸、75 mL 的蒸馏水溶解并过滤待
用。胶片用蒸馏水冲洗 3 次后，在染液中加入 0． 14 mL 30%
H2O2，迅速摇匀后将胶片放入，待酶带完全出现后( 约
20 min) ，用自来水冲洗2 ～ 3 次，拍照。
APX活性染色:采用抗坏血酸———联苯胺染色法。染色
液成分为:AsA 70． 4 mg、联苯胺溶液(2 g 联苯胺溶于 18 mL
温热冰醋酸中，再加入蒸馏水 72 mL)20 mL、1． 2% H2O2 溶液
20 mL、蒸馏水 60 mL。蒸馏水润洗胶片 2 次，再加入 40 ～
50 mL 的染色液，直到清晰的 APX 带显现为止，将染色液倒
掉，并用自来水冲洗几次，照相。
CAT活性染色: 参照Woodbury 等的方法［14］，电泳结束
后，用蒸馏水清洗胶片，0． 05% H2O2 溶液浸泡 20 min 后用蒸
馏水冲洗几次，再加入染色液( 含有0． 5%的氯化铁，0． 5%的
铁氰化钾) ，直到显带为止，照相，整个过程注意避光。
2 结果与分析
2． 1 外源 Ca2+对金线兰抗氧化酶活性的影响
2． 1． 1 Ca2+对金线兰 SOD 活性的影响 3 种浓度的 Ca2+处
理对金线兰 SOD酶活性的影响见图 1，可以看出 SOD 酶活性
呈现“M”形的变化趋势，即先升高后降低再升高，最后趋于稳
定。其中，1． 5 mmol /L 和 2． 5 mmol /L Ca2+处理下 SOD 酶活
性都在 24 h达到最大值，而 0． 5 mmol /L Ca2+处理下在 48 h
时达到最高值。由此可知，外源钙处理能提高 SOD酶活性。
2． 1． 2 Ca2+对金线兰 POD 活性的影响 3 种浓度的 Ca2+处
理下金线兰 POD 酶活性的变化情况见图 2，0． 5 mmol /L 和
1． 5 mmol /L Ca2+处理下，POD酶活性变化呈现先升高后下降
再升高的趋势，在 2． 5 mmol /L Ca2+处理下，呈现先下降后升
高的趋势，可能是高浓度的 Ca2+抑制了 POD 活性，一段时间
适应后出现上升的变化。可知，Ca2+处理对 POD 酶活性影响
较为明显。
2． 1． 3 Ca2+对金线兰 APX 活性的影响 3 种浓度的 Ca2+处
理下金线兰 APX 酶活性变化情况见图 3，可以看出
0． 5 mmol /L Ca2+处理下 APX 酶活性呈现先升高后下降的变
化趋势，变化不明显;1． 5 mmol /L 和 2． 5 mmol /L Ca2+处理下，
在 12 h内 APX酶活性变化不明显，而处理时间在 24 ～ 72 h
时，变化较显著，呈现先下降后升高的趋势，可能是金线兰
APX需要一定时间来适应较高浓度 Ca2+的变化并作出相应
的生理响应。
2． 1． 4 Ca2+对金线兰 CAT 活性的影响 3 种浓度 Ca2+处理
下金线兰 CAT 酶活性变化情况见图 4，0． 5 mmol /L 和
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1． 5 mmol /L Ca2+处理下 CAT 酶活性先升高后下降最后趋于
稳定，且活性不同程度高于对照，2． 5 mmol /L Ca2+处理下，在
12 h内 CAT酶活性变化较小，12 h 以后变化较显著，呈现先
上升后下降的趋势。说明在适宜的浓度范围内，Ca2+处理能
有效提高 CAT酶活性。
综上所述，SOD、POD酶活性都产生了较大的升降变化，
且随着处理时间的延长趋于稳定，说明植物对外界的影响有
一个紊乱调整过程;APX 酶活性，在较高浓度的 Ca2+处理下
响应较其他酶慢;CAT 活性不同程度高于对照，适当 Ca2+处
理能够明显提高金线兰 CAT 的活性且维持较高活性。其中
1． 5 mmol /L 和 2． 5 mmol /L Ca2+处理对酶活的影响较大，
0． 5 mmol /L Ca2+处理的作用较小，其中 1． 5 mmol /L Ca2+处理
24 h时金线兰抗氧化酶活性达到最高值，2． 5 mmol /L Ca2+处
理 48 h次之。
2． 2 外源 Ca2+对金线兰抗氧化酶同工酶的影响
2． 2． 1 Ca2+对金线兰 SOD 同工酶谱的影响 金线兰经过 3
种浓度的 Ca2+处理后，组培苗 SOD同工酶分析结果见图 5，随
着处理浓度和时间不同，酶带呈现一定的强弱差异，但各处
理和对照相比，都是共有 5 条带，处理后并未产生新的酶带，
即没有 SOD同工酶产生。
2． 2． 2 Ca2+对金线兰 POD 同工酶谱的影响 金线兰经过 3
种浓度的 Ca2+处理后，组培苗 POD 同工酶分析结果见图 6，
处理浓度和时间的不同，酶带呈现一定的强弱差异。其中，
0． 5 mmol /L Ca2+处理 12 h和 48 h时有新的酶带产生，12 h时
出现 1 条 Ｒf 为 0． 137 的酶带，48 h 时出现 2 条 Ｒf 分别为 0．
137 和 0． 199 的酶带;1． 5 mmol /L 和 2． 5 mmol /L Ca2+处理后
并未产生新的酶带，没有 POD同工酶产生。
2． 2． 3 Ca2+对金线兰 APX 同工酶谱的影响 金线兰经过 3
种浓度的 Ca2+处理后，组培苗 APX 同工酶分析结果见图 7，
处理浓度和时间不同，酶带呈现一定的强弱差异。其中
0． 5 mmol /L Ca2+处理 12 h时有 1 条 Ｒf 为 0． 156 的酶带产生，
1． 5 mmol /L和 2． 5 mmol /L Ca2+处理 48 h 时有 1 条 Ｒf 为 0．
156 的酶带产生。
2． 2． 4 Ca2+对金线兰 CAT 同工酶谱的影响 金线兰经过 3
种浓度的 Ca2+处理后，组培苗 CAT同工酶分析结果见图 8，处
理浓度和时间的不同，酶带呈现一定的强弱差异，但 CAT 同
工酶带始终只有 2 条，各处理与对照的条带基本一致，即 Ca2+
处理对金线兰的 CAT同工酶的表达没有明显影响。
3 讨论
关于植物抗性机理的研究已有大量报道，但由于金线兰
分布范围较窄，人们多关注于金线兰的药效、组培、人工栽培
等的研究［15－17］，对于其抗性研究较少。本试验就 Ca2+对金线
兰抗氧化酶活性及同工酶的影响进行研究，探讨信号物质
Ca2+对金线兰抗氧化酶的活性及表达的影响。
Ca2+作为第二信使，在植物的信号传递中起重要作用。
关于植物逆境胁迫下钙信使和抗氧化酶系统关联的研究报道
有很多［18－22］，表明外源钙处理对植株 SOD、CAT、POD、APX酶
活都有一个紊乱调整过程，有助于缓解胁迫的危害，这与本
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试验结果类似。
低浓度 Ca2+处理时，POD同工酶有新增酶带，高浓度时没
有新增酶带，但谷俊涛等、翁笑艳等的研究结果表明 Ca2+浓度
越大，POD同工酶组分越复杂［1－2］，本试验结果与之有差异;同
工酶电泳发现不同浓度 Ca2+处理下未产生新 SOD 同工酶和
CAT同工酶，这与王长义等的研究结果［23］不同，可能不同植物
对 Ca2+的响应和调节能力存在差异，这有待进一步探讨。
本试验结果显示，外源 Ca2+可以影响金线兰抗氧化酶活
性，对 APX和 POD的同工酶表达有调控作用，参与了金线兰
消除体内自由基的过程，推测 Ca2+能够使金线兰某些特定抗
氧化酶同工酶表达，从而能够激活相应保护机制，减少和缓解
逆境对自身的伤害。
结合抗氧化酶活性与同工酶谱的分析，可以推测低浓度
的 Ca2+短时间(6 h) 处理对同工酶的诱导作用较为明显，而较
高浓度的 Ca2+(1． 5 ～ 2． 5 mmol /L) 长时间(24 ～ 48 h) 处理对
酶活性变化作用较大。此外同工酶的产生与酶活性变化没有
明显的相关性，Ca2+不只是通过诱导新同工酶产生调节酶的
活性，同时可能存在其他调节途径。
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