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野生湖北百合不定芽诱导及再生植株的建立



全 文 :黑龙江农业科学2016(9):11~14
Heilongjiang Agricultural Sciences
野生湖北百合不定芽诱导及再生植株的建立
蒋 瑶1,陈文波1,周朝伟1,陈其兵2
(1.凯里学院 环境与生命科学学院,贵州 凯里556011;2.四川农业大学 风景园林学院,四川
成都611130)
摘要:为了加强野生湖北百合资源保存与利用,选用黔东南州野生湖北百合为材料,鳞茎及茎段为外植体,探
讨不同浓度激素配比对其不定芽诱导、增殖及生根的影响。结果表明:诱导不定芽的最佳培养基为 MS+
1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA,但茎段诱导不定芽高于鳞片,出芽率分别为66.67%和59.63%,单块
外植体出芽个数分别为2和1,且茎段污染率比鳞片的污染率低。茎段诱导最佳增殖培养基为 MS+
0.1mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA,增殖率为83.33%,平均增殖系数为2.11,其生长状况良好,为最佳增
殖培养基。茎段诱导最佳生根培养基为1/2MS+0.3mg·L-1 NAA,诱导生根率高达93.33%,平均生根数为
3.18。
关键词:湖北百合;鳞片;茎段;组织培养
中图分类号:S682.2;Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1002-2767(2016)09-0011-04 DOI:10.11942/j.issn1002-2767.2016.09.0011
收稿日期:2016-07-28
基金项目:贵州省科技厅资助项目(黔科合J字[2014]2153
号);凯里学院博士启动基金资助项目(BS201332)
第一作者简介:蒋瑶(1982-),女,四川省罗江县人,博士,副
教授,从事植物生物技术研究。E-mail:jiangyao0221@
163.com。
   湖北百合 (Liliumhenryi Baker)为百合
科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物,
是黔东南特有的野生植物资源之一,同时也是园
艺上重要的育种材料。原产于中国湖北、贵州等
地,生长于山坡、石缝,海拔700~1 000m。
湖北百合鳞茎近球形,鳞片矩圆形,茎紫色,
高1~2m,叶为矩圆状披针状,可作为药用植
物[1],也可食用,尤其是花极具观赏价值[2]。但也
出现常规的分球、分株芽、鳞片扦插、鳞片包埋等
过度的无性繁殖导致品种退化,如病害严重、产量
降低、品质下降等[3]。近年来,有关湖北百合研究
主要集中在对其资源调查与评价[4]、遗传多样性
研究[5]、抗病基因鉴定[6]、染色体细胞学[7]研究等
方面,鲜见有关茎段组织培养的报道。
因此,利用组织培养技术,以黔东南州野生湖
北百合鳞片和茎段为外植体,探讨不同激素浓度
配比对其影响,以期为当地湖北百合的组培体系
建立积累相关的资料,从而有效解决其退化现象,
为种质资源保存提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 外植体 野生湖北百合采自凯里学院艺
术楼后山,选择生长健壮、无病虫害的湖北百合植
株的鳞茎和幼嫩的茎段,避光保湿带回实验室
备用。
1.1.2 试剂 70%乙醇(AR,重庆川东化工),
0.1% HgCl2,6-BA,NAA,MS培养基,试剂均为
分析纯(AR),其产地为天津科密欧(乙醇除外)。
1.1.3 仪器与设备 立式压力蒸汽灭菌锅(XQ-
LS-75sⅡ,上海博讯)、电热鼓风干燥箱(101型,
北京科伟)、净化工作台(JH-1,北京科伟、电热蒸
馏 水 器 (YN-ZD-2,上 海 博 讯 )、电 子 天
平(BSA124S,赛多利斯)等。
1.2 方法
1.2.1 外植体的消毒 选取鳞片的中外层,将其
泥土洗净,在流水条件下冲洗1h,采用75%乙醇
消毒30s,无菌水处理2~3次,再采用0.1%
HgCl2消毒10min,无菌水处理3~5次。茎段用
75%乙醇消毒20s,无菌水洗3次,0.1%HgCl2
消毒8min,用无菌水洗3~5次,备用。
1.2.2 不定芽的诱导培养 将消毒后的野生湖
北百合鳞片切成0.5cm×0.5cm的小块,且周围
都形成创口面;将其茎段切成1cm左右,接种到
4种不同的 MS培养基:(1)MS+1.0mg·L-1 6-
BA+0.5mg·L-1 NAA;(2)MS+2.0mg·L-1 6-
BA+1.0mg·L-1 NAA;(3)MS+0.1mg·L-16-
BA+1.0mg·L-1 NAA;(4)MS+1.0mg·L-1 6-
BA+1.0mg·L-1 NAA,加入蔗糖30g·L-1,琼脂
粉7g·L-1,pH5.8。暗培养3d后,再进行光照培
养,其光照强度2 000lx,培养温度为(25±1)℃,
11
     黑 龙 江 农 业 科 学 9期
培养湿度为(80±2)%,观察不同激素浓度组合对
不定芽的诱导情况,并计算污染率、诱导率。
1.2.3 不定芽的增殖培养 不定芽转入4种不
同的增殖培养基:(1)MS+1.0mg·L-1 6-BA+
0.5mg·L-1 NAA;(2)MS+1.0mg·L-1 6-BA+
0.2mg·L-1 NAA;(3)MS+2.0mg·L-1 6-BA+
1.0mg·L-1 NAA;(4)MS+0.1mg·L-1 6-BA+
1.0mg·L-1 NAA,加入蔗糖30g·L-1,琼脂粉
7g·L-1,pH 5.8。观察其不定芽增殖情况,培养
30d后,并计算增殖率和增殖系数。
1.2.4 生根培养 将增殖所得健壮的不定芽接种
于5种不同的生根培养基:(1)1/2MS+0.2mg·L-1
NAA;(2)1/2MS+0.6mg·L-1 NAA;(3)1/2MS+
0.2mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA;(4)1/2MS+
0.3mg·L-1 NAA;(5)MS+0.2mg·L-1 NAA,加
入活性炭1.0mg·L-1,蔗糖30g·L-1,琼脂粉
7g·L-1,pH 5.8。转接7d后开始观察其生根情
况,在培养30d后统计生根数,在此过程中对其
进行拍照,计算其生根率。
1.2.5 数据统计及分析 利用SPSS19.0进行
相关统计分析,每个处理重复3次,每个重复测定
3次。
污染率(%)=
污染的外植体数
接种外植体总数×100;
芽诱导率(%)=
诱导出不定芽的外植体数
成活接种外植体总数 ×100;
增殖率(%)=
新诱导不定芽数
成活接种不定芽数×100;
增殖系数=
增殖后不定芽数
增殖前不定芽数

生根率(%)=
生根幼苗数量
接种幼苗数量×100
2 结果与分析
2.1 不同外植体对野生湖北百合形成不定芽的
影响
  分别取鳞茎的中下端和茎段的上端,按照形
态学的上下端将不同的外植体分别接入诱导不定
芽的培养基中。培养一段时间后发现,鳞片和茎
段均能诱导出不定芽,但鳞片诱导的不定芽长势
一般,且不定芽相对较小(见图1A),茎段诱导的
不定芽长势良好,不定芽较为粗壮且基部出现膨
大的现象(见图1B)。
由表1可看出,不同培养基对野生湖北百合
诱导不定芽的污染率存在差异,且污染率≤40%,
选用茎段的污染率为16.67%~25.00%,鳞茎的
图1 不同外植体诱导不定芽比较
Fig.1 Adventitious buds induction of the different explants
污染率为20%~40%,且处理3污染率最低,由
此说明,同一培养基条件下,茎段均比鳞茎诱导的
污染率低,可能地上部分所带病原菌比地下部分
少,且采摘较为方便。处理1至处理4通过鳞茎
或茎段诱导均能产出不定芽,但诱导效果却不同,
依次为处理1>处理3>处理4>处理2,鳞茎诱
导除处理1和处理3外,其余处理间达到5%水
平差异,而茎段诱导处理间均达到5%差异显著
水平,说明6-BA<2.0mg·L-1,NAA≤1.0mg·L-1
有利于不定芽的诱导。处理1诱导不定芽效果最
佳,且鳞茎和茎段诱导出芽率分别为59.57%和
66.67%。野生湖北百合鳞茎和茎段在 MS+
1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA培养基上的
诱导效果最好,为最佳诱导培养基。在同一诱导
不定芽培养基和培养条件下,不同外植体诱导不
定芽的能力不同,同种外植体在不同培养基中的
芽诱导能力也不同,不同培养基对湖北百合不同
外植体诱导不定芽的效果不同。
2.2 不同培养基对野生湖北百合不定芽增殖的
影响
  将初代培养得到的不定芽切成单芽转入增殖
培养基中诱导小鳞茎,不同类型的不定芽生长状
况有所不同,鳞茎诱导的不定芽增殖相对较慢,分
化不定芽的数量较少,芽细弱翠绿色(见图2A),
茎段诱导的不定芽增殖相对较快,芽增殖的数量
相对较多,芽粗壮绿色(见图2B)。
图2 野生湖北百合茎段诱导不定芽增殖情况
Fig.2 The proliferation of adventitious buds
induction from the stem of wild Liliumhenryi Baker
由表2可知,处理1至处理4均能使不定芽
进行增殖,平均增殖率不低于62.5%,平均增殖
系数高于1.5,各处理不定芽增殖率在62.50%~
83.33%,其中处理3增殖效果差,6-BA浓度高达
21
9期   蒋 瑶等:野生湖北百合不定芽诱导及再生植株的建立
2mg·L-1,抑制不定芽的增殖;处理4增殖效果最
好,增殖率高达83.33%,且增殖系数为2.11,茎
段诱导不定芽增殖率处理1和处理4差异不显
著,与处理2和3差异显著且达到1%水平;增殖
系数处理2和4无差异显著性,但与处理1和3
存在差异显著性且达到1%。说明高浓度的
NAA,低浓度的6-BA更有利于不定芽的增殖,综
合考虑,湖北百合在 MS+0.1mg·L-1 6-BA+
1.0mg·L-1 NAA培养基上为适宜的不定芽增殖
培养基。
表1 不同外植体对野生湖北百合诱导不定芽的影响
Table 1 The effect of the different explants on adventitious buds induction from wild
Liliumhenryi Baker
处理
Treatments
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1)
污染率/%
The rate of contamination
不定芽诱导率/%
The induction rate of adventitious buds
鳞茎Bulb 茎段Stem 鳞茎Bulb 茎段Stem
1  1.0  0.5  33.80bcBC  25.00aA  59.57aA  66.67aA
2  2.0  1.0  34.29bB  22.22aAB  47.83cC  42.86dB
3  0.1  1.0  20.00dD  16.67bB  58.33aAB  63.33bA
4  1.0  1.0  40.00aA  25.00aA  55.56bB  48.15cC
  同列数据后不同大、小写字母表示1%、5%水平差异显著。下同。
Different capital letters and lowercases after column data mean significant difference at 0.01and 0.05level.The same below.
表2 不同激素对野生湖北百合茎段诱导不定芽增殖的影响
Table 2 The effect of different hormone on proliferation of adventitious buds induction
from stem of wild Liliumhenryi Baker
处理
Treatments
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1)
增殖率/%
The rate of proliferation
增殖系数
The coefficient of proliferation
1  1.0  0.5  80.56aA  1.60bB
2  1.0  0.2  66.67bB  1.95aA
3  2.0  1.0  62.50cBC  1.53bB
4  0.1  1.0  83.33aA  2.11aA
2.3 不同培养基对野生湖北百合生根培养的
影响
  将分成单株的小苗转入含有活性炭的5种生
根培养基中,转接30d后观察生根情况,从正面
可看出长势良好(见图3A),瓶底可以看出根数量
较多,根系较为发达(见图3B)。
由表3表明,当基本培养基为1/2MS,添加
图3 野生湖北百合生根培养
Fig.3 The rooting ofwild Lilium henryi Baker
表3 不同培养基对野生湖北百合生根培养的影响
Table 3 The effect of the different cultures on rooting of wild Liliumhenryi Baker
处理序号
Code
培养基
Culture
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1)
生根率/%
The rooting percentage
生根数
The number of rooting
1  1/2MS  0.0  0.5  88.89bA  2.38bB
2  1/2MS  0.0  0.2  79.17dC  1.68cC
3  1/2MS  0.2  1.0  77.78dC  2.14bB
4  1/2MS  0.0  0.3  93.33aA  3.18aA
5 MS  0.0  0.2  83.33cB  2.08bBC
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     黑 龙 江 农 业 科 学 9期
NAA浓度为0.3mg·L-1,生根率高达93.33%,
单株生根数达到3以上,生根效果最好,当 NAA
浓度高达1.0mg·L-1,生根率为77.78%,与处理
2差异不显著,其它生根率不同处理间达到5%差
异显著性,生根数处理1、处理3、处理5差异不显
著,与其它处理间均达到5%水平差异显著性。
由此看出,1/2MS+0.3mg·L-1 NAA为最佳生
根培养基。1/2MS培养基对生根培养有一定的
促进作用,添加低浓度的 NAA对生根有促进作
用,高浓度的NAA对生根有抑制作用。
3 结论与讨论
湖北百合不定芽诱导选用的外植体多为鳞片
和花器官,但本试验采用鳞片和茎段为材料,对其
不定芽的诱导、增殖和生根进行研究,而茎段取材
方便、消毒容易,且易切割,可满足生产上种苗的
需要,也为其组织培养研究奠定技术基础,并完善
了湖北百合组培体系。不定芽诱导所采用的激素
多为6-BA和 NAA,6-BA主要是促进细胞的分
裂与扩大,使细胞数目增多,同时促进芽的分化,
抑制衰老。适量6-BA 促进不定芽的分化和生
长,但超过一定浓度时,促进效果减弱。在培养过
程中,发现6-BA在湖北百合组培的各个环节中
都有一定的影响,低浓度诱导效果不佳,较高的浓
度可促进组织分化和生长,但浓度过高则会抑制
生长,6-BA对湖北百合不定芽诱导过程的最佳浓
度都为1.0mg·L-1;NAA促进细胞伸长和生长,
促进植物产生愈伤组织,适合生根。
NAA对小鳞茎增殖效果明显,随着其浓度
的不断增大其增殖系数不断升高,但超过一定浓
度时趋于不变,因此,要根据材料选择添加适当的
浓度,根据前人研究结果,NAA 浓度一般在
0.2~1.5mg·L-1,NAA对湖北百合的小鳞茎增
殖的最佳浓度为1.0mg·L-1;鳞茎增殖系数随6-
BA浓度的增加而减小,说明在0.1~1.0mg·L-1的
6-BA有利于促进小鳞茎的增殖。
1/2MS培养基更适宜生根,MS反而会抑制
根的生长。因材料和生长时期的不同,功效有所
差异。NAA对湖北百合的生根有促进作用,本
试验 设 计 了 3 个 浓 度 梯 度 0.2、0.3 和
0.5mg·L-1,结果显示,小鳞茎的生根数随 NAA
浓度的升高而增多,但达到一定浓度则对生根起
抑制作用,由此看来,0.3mg·L-1 NAA为促进生
根效果最佳的浓度。
试验表明,适合湖北百合鳞茎和茎段不定芽
诱导的最佳培养基为 MS+1.0mg·L-1 6-BA+
0.5mg·L-1 NAA,但不同外植体对不定芽诱导能
力不同,茎段诱导不定芽成功率高于鳞片,出芽率
分别为66.67%和59.63%,且出芽个数分别为2
和1,茎段诱导污染率低于鳞片诱导污染率,茎段
诱导不定芽最适增殖培养基为 MS+0.1mg·L-1
6-BA+1.0mg·L-1 NAA,最适生根培养基为1/2
MS+0.3mg·L-1 NAA。
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Study on Adventitious Buds Induction and Plant
Regeneration of Wild Liliumhenryi
JIANG Yao1,CHEN Wen-bo1,ZHOU Chao-wei 1,CHEN Qi-bing2
(1.Colege of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili,Guizhou 556011;2.Col-
lege of Landscape Architecture,Sichuan Agriculture University,Chengdu,Sichuan 611130)
Abstract:In order to strengthen the preservation and utilization of wild lilyresources in Hubei province,using
bulb and stem of wild Liliumhenryias explant,the effect of different hormone combination on adventitious buds
induction,bud proliferation and rooting were studied.The results showed that the optimal medium for adventi-
tious buds induction was MS+1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA.The induction rate of stem was higher
than bulbs.The rate of induction was 66.67%and 59.63%.The bud from single explant was 2and 1,the rate
of contamination from stem was lower than bulb.The best proliferation medium was MS +0.1mg·L-1
6-BA+1.0mg·L-1 NAA.The rate of proliferation was 83.33%,the average of coefficient of proliferation was
2.11and the growth was the better.The medium for rooting was 1/2MS+0.3mg·L-1 NAA.The rate of roo-
ting was as high as 93.33%,the average number of rooting was 3.18.
Keywords:Liliumhenryi;bulb;stem;tissue culture
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