全 文 ：HPLC法测定市售三桠苦中吴茱萸春的含量
李硕果1 , 2 ,叶文才1 , 2 ,江仁望1
(1.暨南大学 药学院 中药及天然药物研究所/中药药效物质基础与创新药物研究广东省高校
重点实验室 , 广东 广州 510632;2.中国药科大学 天然药物化学教研室 ,江苏 南京 210036)
摘　要:目的:建立三桠苦中吴茱萸春的含量测定方法 ,为三桠苦药材的质量评价提供科学依据。方法:
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ,以乙腈-水体系洗脱 ,流速为 1.0 m L ·min-1 ,柱温 25℃,检测波长
为 243.5nm。结果:在线性范围 0.04 ～ 0.66μg ,吴茱萸春对照品的标准曲线呈良好的线性关系(r=0.
9998),该方法的平均回收率为 100.1%, RSD为 2.7%。结论:本方法快速 、简便 、重复性好 ,可用于三
桠苦中吴茱萸春的含量测定。
关键词:三桠苦;吴茱萸春;RP-HPLC;含量测定
中图分类号:R284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1673-2197(2011)04-0033-03
收稿日期:2011-02-18
基金项目:广东省自然科学基金团队项目(8351063201000003);教育部新世纪优秀人才(NCET-08-0612);中央高校基本科研
业务费(21609202);广东省高校高层次人才项目(JN2010)
作者简介:李硕果(1984-),女 ,中国药科大学博士研究生 ,研究方向为天然药物化学;江仁望(1973-),男 ,暨南大学教授 ,
博士生导师 ,研究方向为天然药物化学 。
　　三桠苦又名三叉苦 、三丫苦 、三叉虎等 ,主要分布在广
东 、广西 、海南等我国南部省区 ,是岭南地区常用的一味中
草药 ,广泛应用于三九胃泰 、三九感冒灵颗粒 、三金片等多
种中成药中[ 1〗。三桠苦的植物分类曾有争议 ,其原归属于
芸香科吴茱萸属 ,拉丁名为 Evod ia lep ta (S preng.)Merr 。
近年来 ,通过 DNA 亲缘关系研究 ,发现三桠苦与蜜茱萸属
植物亲缘关系较近[ 2〗。Hartley 根据花和果实的特征也建
议将其归属到蜜茱萸属[ 3〗。在 2008年英文版《中国植物志》
第十一卷里 ,正式把三桠苦归属到蜜茱萸属 ,拉丁名改为
Melicope p telei f olia (Champ ion ex Bentham)T.G.Hart l
图 6　最佳条件下 HZ-803树脂的脱色效果
4　讨论
通过静态吸附-解吸和动态吸附-解吸实验 ,确定
HZ-803树脂作为脱色用树脂 ,最佳脱色条件为:上样量为
4BV ,吸附流速为 3BV ·h-1 。乙酸乙酯为解吸剂 ,解吸剂
用量为 1.6BV ,解吸流速 5BV ·h-1 。通过稳定性实验表
明 ,树脂经 15次循环使用 ,吸附率在 70%以上 ,吸附效果稳
定。脱色后冬凌草甲素的回收率为 92.8%,损失较少 ,表明
该树脂对于色素具有较好的选择吸附特性。该工艺保证了
冬凌草甲素的稳定性和回收率 ,有利于进一步纯化处理 。
树脂可再生利用 ,工艺简单 ,操作容易 ,可以进行规模生产 ,
具有工业化的可行性;另外 ,大孔吸附树脂吸附的叶绿素 ,
经洗脱再生得到的叶绿素可以加以利用。
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(责任编辑:宋勇刚)
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ey [ 4] 。我们最近的植物化学研究表明三桠苦富含苯骈吡喃
类化合物及喹啉类生物碱[ 5〗 ,与蜜茱萸属植物的化学成分
相近 。在我们分离到的化合物中 ,吴茱萸春具有较好的抗
炎活性且含量较高[ 6-8〗。鉴于三桠苦应用广泛但其质量标准
研究鲜有报道 ,我们选择吴茱萸春为对照品 ,建立了三桠苦
中吴茱萸春含量的 RP-HPLC测定方法 ,可为三桠苦药材及
相关成方制剂的质量控制提供科学依据。
1　仪器与试药
Agilent-1200型高效液相色谱仪(G1311A 四元泵 ,自
动进样器 , DAD 检测器 , G1316A 紫外检测器),色谱柱:
Cosmosil C18-MS-Ⅱ柱(4.6mm ×250mm , 5μm)。乙腈和甲
醇为色谱纯(Dima公司),水为纯净水(屈臣氏公司),其它
试剂均为分析纯 。
三桠苦药材购自广州市不同药店 ,由暨南大学中药及
天然药物研究所周光雄教授鉴定为芸香科蜜茱萸属植物三
桠苦 Melicope p telei f olia 。对照品吴茱萸春 ,由作者分离
纯化 ,经光谱分析并对照文献鉴定为吴茱萸春 [5〗 ,经 DAD
检测器检测 ,采用面积归一化法计算其纯度大于 99%。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
Cosmosil C18-MS-Ⅱ色谱柱(4.6mm ×250mm , 5μm),
柱温 25℃,流速为 1.0mL ·min-1 ,检测波长为 243.5nm ,进
样量 20μL ,流动相为乙腈-水(45∶55)。供试品中的吴茱
萸春与其它成分达到了有效分离 ,分离度大于 1.5。对照品
及供试品的色谱见图 1图 、图 2。
图 1　吴茱萸春对照品的 HPLC色谱及紫外光谱
图 2　供试品的 HPLC色谱
2.2　对照品溶液的制备
精密称取吴茱萸春对照品 8.19mg ,置于 10mL 容量瓶
中 ,加入甲醇溶液溶解并定容至刻度 ,制成 0.819 mg ·
mL-1的对照品储备液。
2.3　供试品溶液的制备
取本品粉末过 60目筛 ,精密称取 4.0g ,置于 100mL三
角瓶中 ,精密加入甲醇溶液 100mL ,精密称定重量 ,超声提
取 60min(100W , 40kHz),温度 50℃。放置至室温后 ,精密
称定重量 ,以纯甲醇溶液补足减失的重量 。滤过 ,精密吸取
续滤液 50.0mL ,减压浓缩至干。以甲醇溶液将样品完全转
移至 10mL容量瓶中 ,加甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,经微孔滤膜
(0.45μm)过滤 ,即得供试液 。
2.4　线性关系考察
精密量取上述对照品溶液适量 ,加甲醇逐级稀释 ,分别
得到浓度为 32.80 、16.40 、8.19、4.10 、2.05 μg ·mL -1的溶
液 ,按照 2.1项的色谱条件进样 20μL ,测定色谱峰面积。以
峰面积(Y)为纵坐标 ,对照品浓度(X)为横坐标 ,进行线性
回归 ,得对照品的回归方程 Y = 246.79X +229.84 , r =
0.9998。在 0.04 ～ 0.66μg范围内线性良好。
2.5　精密度试验
精密量取已经制备好的吴茱萸春对照品溶液一定体
积 ,用甲醇稀释 ,得浓度为 12.18μg·mL-1的溶液 ,按照 2.1
项的色谱条件重复进样 6次 ,测定色谱峰面积 ,计算 RSD为
0.2%。
2.6　重复性试验
称取同批样品 6份 ,每份约 4.0g ,精密称定 ,按 2.3 项
的方法制备 ,在上述色谱条件下进行分析 ,测定吴茱萸春峰
面积 ,计算三桠苦中吴茱萸春的平均含量 0.311mg · g -1 ,
其 RSD为 1.2%。
2.7　稳定性试验
精密吸取供试液 20μL ,分别于 0 、4、8 、14、18 、24min 进
样 ,记录吴茱萸春色谱峰面积 ,计算 RSD为 1.5%。
2.8　回收率试验
取本品粉末过 60目筛 ,称取 6份 ,每份约 2.0g ,精密称
定 。分别精密加入 0.819mg·mL-1的对照品溶液0.75mL ,
按供试品溶液制备方法操作 ,精密吸取 20μL ,注入 HPLC
色谱仪 ,照上述色谱条件测定 ,记录吴茱萸春的峰面积 ,以
外标法计算含量 ,吴茱萸春的平均回收率为 100.1%,计算
RSD为 2.7%。结果见表 1 。
表 1　吴茱萸春的回收率
取样量
/ g
样品中
量/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/ %
平均
值/ %
RSD
/ %
1.981 0.616 0.614 1.221 98.5
1.968 0.612 0.614 1.218 98.7
2.019 0.628 0.614 1.231 98.2
2.032 0.632 0.614 1.254 105.4
1.952 0.607 0.614 1.226 100.8
2.042 0.635 0.614 1.243 99.0
100.1 2.7
2.9　样品分析
将从广州市不同区收集的 6 个药材样本分别按供试品
溶液制备项下方法处理 ,分别精密吸取对照品溶液和供试
品溶液各 20μL ,注入液相色谱仪 ,按上述色谱方法进行测
定 ,平行操作 3次 ,外标法计算含量。所得结果见表 2 , 6 份
药材的色谱见图 3。
3　讨论
3.1　供试品制备方法的考察
根据极性大小不同 ,实验中分别采用甲醇 、丙酮和乙酸
乙酯超声提取 ,超声时间采用 30min 、60min和 80min 进行
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了考察 ,发现用甲醇为溶剂 ,超声 60min提取最完全 。
表 2　6个样本中吴茱萸春的含量测定结果 (n=3)
序号 样品编号 平均值/m g·g -1
1 20100021 0.55
2 20100022 0.66
3 20100023 0.34
4 20100024 1.14
5 20100025 0.31
6 20100026 0.43
图 3　6个样本的 HPLC色谱
3.2　色谱条件的选择
检测波长的选择:本实验取吴茱萸春对照品适量 ,用甲
醇制成每 1 mL约含 10μg样品的溶液 ,在 190 ～ 400nm 波长
范围内进行扫描 ,在 244 nm 处出现最大吸收 ,故确定特征
吸收波长 244nm 为检测波长 。本实验还选取不同比例的流
动相(甲醇-水 、乙腈-水)和不同的流速(1mL ·min-1 、
0.8mL ·min-1),以峰的对称因子为指标 ,结果表明在乙腈
-水(45∶55),流速 1 mL ·min-1 ,柱温 25℃条件下峰的对
称因子为 1 ,对称性最好。
本文采用超声提取的方法制备三桠苦供试液 ,以作者分
离纯化的吴茱萸春为对照品建立了三桠苦中吴茱萸春含量
的RP-HPLC测定方法 ,该方法快速 、简便 、重复性好 ,可用于
三桠苦中吴茱萸春的含量测定。同时测定了 6批三桠苦药
材中吴茱萸春的含量 ,其含量范围为 0.31 ～ 1.14 mg · g-1 ,
说明不同批次药材含量差别较大 ,因此制定三桠苦药材中吴
茱萸春的含量测定方法 ,以控制该药材质量很有必要 。
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(责任编辑:宋勇刚)
Determination of Evolitrine in Melicope pteleifolia by RP-HPLC
Shou Guo li
1 , 2 ,Wen Caiye1 , 2 , Ren Wang jiang1
(1.Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Consti tuents of T raditional Chinese
Medicine and New Drug s Research , Insti tute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products ,
Jinan Unive rsity ,Guangzhou 510632 ,China;2.Department of Phy to chemist ry ,
China Pharmaceutical U niversi ty ,N anjing 210009 ,China)
Abstract:Objective:To establish a method for the quantitative determination of evolitrine in Melicope pteleifolia.Methods:The
chromatographic analysis w as car ried out on a C18 column using the acetonitrile-w ater as the mobile phase.The flow rate w as 1 mL/
min.The detection w aveleng th was set at 244 nm and the co lumn temperature w as set at 25℃.Results:The linear range of
evo litrine w as between 0.04 ～ 0.66μg.The average recovery w as 100.1%(RSD=2.7%),and stability and reproducibility were suit-
able.Conclusion:The method w as proven to be quick , simple and reproducible.It is quite suitable to be used for the determination
of evo litrine in Melicope pteleifolia.
Key Words:Melicope Pteleifo lia;Evolitrine;RP-HPLC;Content Determination
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