全 文 ：　　表 4　仅出现于模型组而未在桂皮醛组出现的蛋白质点
蛋白点序号 分子量(KD) 等电点 相对含量
SSP 2103 28.57 4.84 357.40
SSP 2123 26.72 5.31 3301.25
SSP 2218 34.99 5.19 426.30
SSP 3102 28.88 5.46 226.41
SSP 3105 27.37 5.50 334.25
SSP 3401 41.71 5.44 388.01
SSP 6119 29.52 7.74 885.45
　　表 5　仅出现于桂皮醛组而未在模型组出现的蛋白质点
蛋白点序号 分子量(KD) 等电点 相对含量
SSP 4019 24.74 6.33 204.04
3　讨论
　　随着蛋白质组学技术的广泛运用 , 中药复方现代化的研究
也得到迅速的发展。复方所含化学成分复杂 , 药理作用具有多
靶点多层次的特点。从蛋白质组学角度进行研究可克服不能
从整体进行观察分析的缺点 , 充分利用蛋白质组学技术研究中
药复方的作用规律和原理 ,将能使中药复方得到更广泛的认可
和应用。在本次实验中 , 为了增加样品的溶解性 , 在样品裂解
液的配制中使用了硫脲和大浓度的尿素进行溶解 ,并用丙酮进
行浓缩处理。使用被动重泡胀的方法 , 保证了等电聚焦的完
全。蛋白质斑点在 pH 3-10 的范围内分布较为均匀 ,多次实验
观察分辨率较好 , 可以得到清晰的 2-DE 图谱。但酸性端蛋白
质点略少 ,且碱性端略有脱尾 , 对样品的提取和电泳过程还可
进一步完善[ 7 , 8] 。
　　发热是一个复杂的过程, 有多种酶参与 , 并涉及多条信号传
导通路。其中参与体温调节的关键代谢酶有 p38 MAPK , PLA2 ,
COX-2 , 15-PGDH等。本实验证实桂皮醛具有良好的解热作用,
用蛋白质组学的研究方法发现了多个表达变化差异的蛋白质点 ,
在给予桂皮醛后 ,蛋白质点 2121 、4516、4633 和 5616的相对含量
上调趋于正常 , 蛋白质点 3205 和 6102 的相对含量下调趋于正
常 ,并有若干新出现的蛋白质点。推测这些蛋白点不但是发热状
态特异性蛋白质点 , 也是桂皮醛作用的靶点, 所以还需要进一步
通过质谱分析以及蛋白质数据库查询等方法来鉴定这些差异蛋
白质点 ,判断它们可能的功能 ,期望从中发现与体温调节关键酶
活性改变相关的蛋白质点, 探讨桂皮醛解热的蛋白质组学基础 ,
为其解热机理研究提供更有力的实验依据。
参考文献
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Changes in hypothalamus proteins levels in febrile rat after administration of cinnamic aldehyde
Jiang Nan , Huo Hairu , Li Lanfang , Zhou Jun , Li Canghai , Guo Shuy ing , Jiang T ingliang
(Tang Center for Herbal Medicine Research , Institute of Chinese Materia Medica , China Academy of TCM , Beijing　100700)
　　Objective:To observ e the differentoial expressed protein spots in hypothalamus in yeast induced febrile rats and the yeast induced
febrile rats treated with cinnamic aldehyde.Methods:Using two-dimensional poly acry lamide gel electrophoresis(2-DE)and computer-as-
sisted image analysis to separate and find the spo ts of interests.The febrile g roup gel w as designa ted as reference gel.Results:Cinnamic
aldehyde has antipyretic effect on febrile rats.The ma tching rate of the control group is 91%, the matching ra te of the Tested Group is
86%.A few pro tein spo ts were changed mo re than 30 folds.Conclusion:The spo ts of interests may be identified as the proteins associate
w ith the febrile process , or the potential tar gets of cinnamic aldehyde.
Key words　cinnamic aldehyde;pro teome;tw o-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2-DE);febrile
铁筷子多糖对荷瘤机体细胞因子产生的影响及其抑瘤作用的电镜观察
刘　昕　王振军　王晶宇
(兰州医学院病理生理教研室　兰州　730000)
　　提　要　目的:探讨铁筷子多糖(TKZDT)的抗瘤作用及机制。方法:建立小鼠肉瘤 180(S180)动物模型 , 观察用药后肿瘤生长
状况及其对 TNF-α、IFN-γ、IL-3 等细胞因子的影响 , 并在电镜下观察肿瘤组织超微结构的变化。 结果:适当剂量铁筷子多糖有明显
13中药药理与临床 2003;19(6)
为甘肃省中青年科技基金资助项目 ,编号:YS-011-A23-017
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2003.06.007
抑制鼠肉瘤 180 生长的作用 ,最大抑瘤率可达 50.95%。铁筷子多糖可逆转 TNF-α和 IFN-γ明显减少 , 并有效提升 IL-3 水平。电
镜下实验组肿瘤细胞有细胞核周间隙缩窄 ,染色体块状聚集 、浓染 , 线粒体肿大 、形成空泡 、线粒体嵴溶解等表现。结论:铁筷子多
糖具有抑制肿瘤 S180生长的作用 , 此作用与影响细胞因子的水平有关。
　　关键词　铁筷子多糖;细胞因子;肿瘤
　　铁筷子(Hellborus thibeanus Franch.)用其根茎治疗泌尿系
感染如膀胱炎 、尿道炎等及疮疖肿痛。国外曾报道铁筷子中嚏
根草甙及甙元能抑制人上皮癌 KB 细胞的生长[ 1] 。近年来 , 越
来越多的研究表明许多植物多糖都具有抗瘤效应 ,我们发现从
铁筷子根茎中提取出多糖成分对肿瘤细胞生长有确切的抑瘤
效应[ 2 , 3] , 实验初步提示该作用与其调节机体的免疫功能有一
定关系。本文报告对荷瘤动物体内数种细胞因子的影响 , 并在
电镜下比较了局部肿瘤组织中细胞超微结构的改变。
1　材料
1.1　试验药物　铁筷子采自甘肃甘南地区 , 经兰州医学院药
用植物教研室赵汝能教授鉴定 , 由药物化学教研室提取出多糖
成分 ,为易溶于水的棕褐色粉末 , 配制成 20%、10%、5%不同浓
度溶液 4℃保存备用。复方天仙胶囊:吉林通化白云山药业股
份有限公司生产 ,配制成 10%溶液 4℃保存备用。
1.2　动物　雄性昆明种小鼠 , 体重 18 ～ 22g , 由兰州医学院动
物中心提供。
1.3　肿瘤细胞株及病毒　小鼠肉瘤 S180由兰州医学院血液病
研究所提供;小鼠成纤维细胞瘤株 L929购自华西医科大学免疫
室;滤泡状口炎病毒 VSV 购自中国预防医学科学院病毒所毒种
中心。
1.4　主要试剂　RPMI1640 培养基:GIBCO 公司产品 , 使用时
配制成含 10%新生小牛血清的完全培养液。新生小牛血清:杭
州四季青生物工程公司。刀豆蛋白 A(ConA):Sigma 公司。 四
甲基偶氮唑蓝(MTT):上海华舜生物工程公司。 十二烷基硫酸
钠(SDS)上海生工生物有限公司。放线菌素 D(AcD):Amresco
公司。胰蛋白酶:上海化学试剂公司。
1.5　方法　小鼠随机分为 5 组 , 灌胃生理盐水或试验药物 0.
2ml/ d·鼠。
1.5.1　抑瘤作用　S180瘤株复苏并经小鼠腹腔传代 3 次后 , 取
对数增长的瘤细胞用生理盐水按 1∶4 稀释 , 右腋下注射接种
0.2ml/只。瘤细胞生长 2 周后 , 剥离局部肿块称重 , 计算抑瘤
率。
1.5.2　电镜标本制作　切取约 0.3ⅸ0.3cm 大小的肿瘤组织
作 4%戊二醛和 1%锇酸双固定 , 梯度乙醇脱水 ,环氧树脂包埋 ,
梯度加热聚合 , LKB-Ⅴ型超薄切片机切片 , 行铀铅双染色后在
透射电镜下观察。
1.5.3　细胞因子的检测　实验 2 周后 , 无菌条件下眼球取血收
集血清 , 同时取脾常规方法制成单脾细胞悬液 , 收集上清液 , 作
以下测定:
　　TNF-α活性检测　采用结晶紫法[ 4] , 将 L929细胞 0.1ml(3
ⅸ104 个/ ml)接种于 96 孔培养板中培养 24h 形成细胞单层 , 加
入小鼠血清及放线菌素 D(2μg/ ml)继续培养 24h , 用结晶紫染
色后清洗细胞 ,加入 SDS 以溶解染色细胞 , 酶标分析仪测定 OD
600nm 值。
　　IFN -γ活性检测　采用微量病变抑制法[ 5] ,先将上述脾细
胞悬液作 2 倍递次稀释 ,由高至低浓度顺序加入 40 孔细胞培养
板中 50μl/孔(细胞对照孔和病毒对照孔加入等量 RPMI1640 培
养液), 再加入 6ⅸ105/ ml浓度的 L929细胞 50μl/孔 , 待培养 24h
形成细胞单层后弃去全部液体 , 加入 250TCID50/ ml浓度攻击
病毒 VSV 100μl/孔(细胞对照孔加入等量培养液), 继续培养至
病毒对照孔的 CPE 达到++++为止(约 36h)。弃去病毒液 ,
用结晶紫染液中染色 ,脱色液脱色 ,酶联分析仪检测 OD540nm值。
　　IL-3活性检测　采用骨髓干细胞增殖法 , M TT 比色法测
定[ 6] 。无菌取动物股骨并收集骨髓细胞 ,用 RPMI1640 制成细
胞数为 1.5ⅸ105/ml的骨髓细胞悬液。将上述悬液和脾细胞培
养上清液各 100μl 加入 96 孔板中 , 同时设培养液对照孔 , 在
CO2 孵箱中培养 72h 后 , 每孔中加入 5%MT T 溶液 10μl , 继续
培养 4h ,用 SDS 终止培养。酶联分析仪检测 540nm 波长处 OD
值。
2　结果
2.1　对 S180的抑瘤作用　肿瘤对照组局部肿块生长最快 , 70%
左右肿块表皮有破溃 、出血 , 大部分动物有胸水形成和淋巴结
转移。多糖 1.0g/ kg·d 组肿瘤生长速度与阳性对照组相仿 , 动
物一般生存状况较好 ,如精神 、食欲 、活动等均明显优于肿瘤对
照组 ,且形成胸水和淋巴结转移程度轻。 多糖 2.0g/kg·d 、0.
5g/ kg·d 剂量组虽亦有一定程度的抑瘤作用 , 但效果不及中剂
量组 ,见表 1。
　　表 1　对 S180的抑瘤率
组别 剂量(g/ kg)
鼠数
(只)
总瘤重
(g)
平均瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
肿瘤对照　 8 12.2 1.535
复方天仙　 7 5.6 0.70#＊ 54.22
铁筷子多糖 2.0 8 8.7 1.09#＊ 28.97
铁筷子多糖 1.0 8 6.0 0.75#＊ 50.95
铁筷子多糖 0.5 8 9.6 1.20#＊ 21.52
　　与肿瘤对照组相比 ＊P<0.05 , ＊＊ P<0.01(下同)
2.2　对肿瘤细胞超微结构的影响　肿瘤组细胞形态大小不一 ,
细胞内结构较致密 ,细胞器形态清晰可辨 , 线粒体数量较多 , 呈
圆形或卵圆形 ,线粒体嵴基本完整 , 细胞核核周间隙较宽 , 核中
染色体解旋均匀分布在核中 , 有核仁边集现象。多糖组肿瘤细
胞内细胞器多碎裂 ,线粒体数量明显减少 , 嵴架溶解 , 有的已呈
空泡 ,细胞核核周间隙缩窄 , 染色质分散呈块状 , 密集浓染 ,多数
边集在核膜处。
2.3　对细胞因子的影响　结果显示在肿瘤生长期间 ,荷瘤机体
内 TNF-α含量明显低于正常水平 , 而 TKZDT 各组 TNF-α含量
接近正常或超过正常水平 ,见表 2。
　　表 2　TKZDT 对 T NF-α、r-IFN 、I L-3产生的影响( x ±s)
组别 剂量(g/kg)
鼠数
(只) TNF-α
γ-IFN
(OD)
IL-3
(OD)
正常对照　 10 67.00±14.92＊＊ 0.44±0.06＊＊ 0.36±0.024
肿瘤对照　 10 26.63±12.29 0.24±0.09 0.32±0.038
复方天仙　 10 69.25±21.43＊＊ 0.36±0.05＊＊ 0.51±0.033
铁筷子多糖 2.0 10 59.95±14.85＊＊ 0.33±0.04＊＊ 0.37±0.059
铁筷子多糖 1.0 10 74.37±28.37＊＊ 0.40±0.05＊＊ 0.60±0.087
铁筷子多糖 0.5 10 64.14±21.43＊＊ 0.34±0.06＊＊ 0.37±0.029
14 中药药理与临床 2003;19(6)
2.3.2　对 IFN-γ产生的影响　荷瘤动物体内 IFN-γ水平明显
降低 , TKZDT 各组和复方天仙胶囊均不同程度促进荷瘤鼠脾
淋巴细胞产生 IFN-γ。肿瘤生长对 IL-3 含量基本无影响 ,如表
2 所示 , 肿瘤对照组与正常对照组之相比 P>0.05。但 1.0g/
kg.d TKZDT 和复方天仙胶囊使荷瘤机体 IL-3 的含量明显增
加。
3　讨论
　　不少多糖都具有免疫调节作用 ,它们通过促进机体免疫功
能而起到抑制或限制肿瘤生长的效应[ 7 ～ 9] ,因而被称为抗肿瘤
多糖。另外 , 细胞因子是机体抗肿瘤的重要组成部分 , 它们与
细胞表面特异性受体结合 ,将信号传递给细胞核引起蛋白质合
成类型的改变 ,进而引起细胞行为的改变 , 如细胞的生长增殖
抑制 、杀伤肿瘤细胞的能力增强等。本文在前期工作的基础
上[ 9]作了进一步的研究 , 结果显示 ,在适当的剂量下(小鼠为 1.
0g/ kg.d), 铁筷子多糖可有效逆转荷瘤机体因肿瘤生长而出现
的 TNF-α及 IFN-γ等的低水平状态 , 同时多糖治疗组成瘤时间
出现的晚 ,胸水形成少 , 向周边组织浸润程度轻 , 肿瘤中有较多
变性坏死病灶 ,细胞核固缩碎裂 , 标识细胞生长活跃的核分裂
相少见 ,表明该药物的确通过提高荷瘤机体内细胞因子的产生
达到了抑制肿瘤生长的目的。
　　IL-3 是由活化 T 细胞产生的造血因子 , 具有广泛的造血刺
激作用。而肿瘤患者在经放 、化疗后面临的一个重要问题 , 便
是因免疫功能和造血功能受到显著抑制而发生的致死性感染 ,
因而提升患瘤机体的 IL-3 水平无疑在减少病人死亡率上有其
独到的应用价值。我们从实验结果得知 , 铁筷子多糖在中剂量
(1.0g/kg.d)时有较好的促进脾细胞生成 IL-3 的作用 , 此作用
略强于复方天仙胶囊 , 这在缓解肿瘤患者因放 、化疗而引起的
骨髓抑制可能有一定的作用。
参考文献
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姜黄挥发油抗肿瘤作用机制研究
石雪蓉　顾　健1　谭　睿1
(成都铁路医院药剂科　成都　610081 , 1 成都中医药大学　成都　610075)
　　提　要　目的:探讨姜黄挥发油抗肿瘤作用。方法:运用体外培养细胞 MTT 法观察姜黄挥发油对肿瘤细胞的抑制作用及对
BALB/C 小鼠脾细胞增殖的影响。结果:姜黄挥发油能抑制人急性早幼粒白血病细胞株 HL-60 和肝胚细胞癌 HepG2 细胞株的增
殖 ,并能促进 BALB/ C 小鼠脾细胞的增殖。结论:姜黄挥发油对肿瘤有明显抑制作用 ,且能增强免疫功能。
　　关键词　姜黄挥发油;HL-60;HepG2;脾细胞
　　姜黄(Curcuma longa L.)主含挥发油和姜黄素类成分 ,对姜
黄素类成分已有许多药理研究 , 本研究旨在通过体外试验探讨
姜黄挥发油抗肿瘤作用及其机制。
1　材料与方法
1.1　试验药物　姜黄药材购于成都市五块石药材市场 , 经成
都市药品检验所检验鉴定符合《中国药典》 2000 版姜黄项下规
定。其挥发油采用水蒸气蒸馏法制得。每 1ml 相当于原药材
80g 。过滤除菌 , 4℃冰箱保存备用 ,临用前培养液稀释至所需浓
度。
1.2　试剂　MTT 、刀豆素 A(ConA)、脂多糖(LPS)为 Sigma 公
司产品;RPMI-1640 为 Gibacobrl产品;蛋白酶为 GIBCO公司产
品。
1.3　肿瘤细胞株　人急性早幼粒白血病细胞株 H L-60 、肝胚细
胞癌 HepG2细胞株均由香港城市大学提供 , 培养在 1640 培养
液(含 100ml/ L小牛血清 、100μg/ml青霉素 , 100μg/ml链霉素)
中 ,置于 37℃50ml/ L CO 2 的培养箱中 , 隔日换液 , 待细胞进入
对数生长期后用药物处理。
1.4　动物　BALB/ C 小鼠 6～ 8 周龄 , 体重 18～ 22g , 中山医科
大学动物中心提供 ,动物合格证号:2000B024。
1.5　方法
1.5.1　对肿瘤细胞增殖的影响　常规培养细胞 , 进入对数生长
期后贴壁细胞弃去上清 ,磷酸盐缓冲液冲洗 2 遍 , 0.25%的胰蛋
白酶消化细胞(悬浮生长的细胞直接收集 , 磷酸盐缓冲液洗 2
遍 , RPM I 1640 培养基调整细胞浓度 1×105个细胞/ ml , 接种于
96 孔培养板 , 每孔 1×104 个细胞/ 100μl , 分别加入阳性对照
DDP 200μg/ml或阴性对照 Hank s 液和不同浓度姜黄的挥发油
提取液(浓度分别为 2500μg/ml , 250μg/ ml , 25μg/ ml , 2.5μg/ml ,
0.25μg/ ml)10μl , 空白组为 RPMI 1640 培养基。每组均设 4 个
复孔。CO2 培养箱中 37℃培养 72h , 培养结束前 4h 各培养孔加
MTT(5mg/ml)10μl ,培养结束后 , 弃去培养上清(悬浮细胞需离
心后弃去上清)每孔加入 10%DMSO 100μl振荡 15min , 酶标仪
15中药药理与临床 2003;19(6)