全 文 ：书文章编号:1000-5404(2012)20-2097-04 论著
白鲜皮生物碱抗内毒素活性的研究
杨 东1，张 瑛2，郑新川3，刘 鑫3，鲁永玲3，郑 江3 (410003 长沙，解放军第 163 医院:检验科1，急诊科2;400038
重庆，第三军医大学西南医院综合实验研究中心3)
［摘要］ 目的 从中药白鲜皮中分离抗内毒素 /脂多糖(endotoxin / lipopolysaccharide，LPS)的有效成分，对分离得到
的成分进行定性鉴别和体内外抗 LPS活性的研究。方法 采用大孔吸附树脂、离子交换、聚酰胺和硅胶柱层析等方法从
白鲜皮水煎液中分离有效成分，并以试管法进行定性鉴别;在体外，以动态浊度法检测该成分对 LPS 的中和作用;ELISA
法检测其对 LPS刺激 RAW264． 7 细胞释放肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及白细胞介素-6 (IL-6)的影响;在体内，观察该成分
对热灭活大肠埃希菌攻击小鼠的保护实验。结果 从白鲜皮中分离得到具有抗 LPS作用的生物碱类成分 BXP-A。体外实
验结果显示，BXP-A (0． 5 ～1． 0 mg /L)可抑制 LPS (0． 2 μg /L)介导的鲎试剂的凝结反应(P ＜0. 05) ;BXP-A(100 ～200 mg /L)
可显著抑制 LPS(100 μg /L)诱导 RAW264． 7 细胞释放 TNF-α及 IL-6(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ;BXP-A(40 mg /kg)可提高注射
热灭活大肠埃希菌(1． 3 × 1011CFU /kg)攻击小鼠存活率约 40%。结论 BXP-A在体外能较好地中和 LPS并抑制其诱导的
炎症细胞因子释放，对热灭活大肠埃希菌攻击所致脓毒症模型小鼠具有保护作用。
［关键词］ 白鲜皮;内毒素;细胞因子;脓毒症
［中图法分类号］ R282． 71;R392． 11;R996 ［文献标志码］ A
［基金项目］ 国家重点基础研究发展计划(973 计划，2005CB522600)
［通信作者］ 郑 江，电话:(023)68754435，E-mail:zhengj99219@ gmail． com
Anti-lipopolysaccharide activity of alkaloid components from Densefruit pittany root-
bark
Yang Dong1，Zhang Ying2，Zheng Xinchuan3，Liu Xin3，Lu Yongling3，Zheng Jiang3(1 Department of Clinical Laboratory，
2Department of Emergency，No． 163 Hospital of PLA，Changsha，Hunan Province，410003;3General Experimental Research Center，
Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，400038，China)
［Abstract］ Objective To isolate and identify the anti-lipopolysaccharide (LPS)components from
Densefruit pittany root-bark and investigate its potential anti-LPS activities in vitro and in vivo． Methods The
components were isolated by macroporous adsorptive resins，ion exchange，polyamide and silica gel column
chromatography from the aqueous extract of Densefruit pittany root-bark，and identified by tube test． The neu-
tralization of LPS was assayed by Limulus Amebocyte Lysate (LAL)test． The inhibition of tumor necrosis fac-
tor-alpha (TNF-α)and interleukin-6 (IL-6)release from RAW264． 7 cells induced by LPS was assessed by
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)． The protective effect was observed in mice challenged by lethal
dose of heat-killed Escherichia coli． Results The alkaloids components with anti-LPS activity，BXP-A，were
isolated and identified from Densefruit pittany root-bark． In vitro，BXP-A (0． 5 to 1． 0 mg /L)inhibited the co-
agulation of LAL induced by LPS (0． 2 μg /L) (P ＜ 0. 05) ，and it (100 to 200 mg /L)significantly suppressed
the release of TNF-α and IL-6 induced by LPS (100 μg /L)in RAW264． 7 cells(P ＜ 0. 05 or 0． 01)． In vivo，
BXP-A (40 mg /kg)improved the survival rate of mice challenged by lethal dose of heat-killed Escherichia coli
(1． 3 × 1011 CFU /kg)． Conclusion BXP-A neutralizes LPS and inhibits the overproduction of cytokines in
cells，and has protective effect against sepsis in a heat-killed Escherichia coli-induced mouse model of sepsis．
［Key words］ Densefruit pittany root-bark;lipopolysaccharide;cytokines;sepsis
Supported by the National Basic Research Program (973 Program，2005CB522600)． Corresponding author:Zheng Jiang，Tel:86-23-68754435，E-mail:
zhengj99219@ gmail． com
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J Third Mil Med Univ
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DOI:10.16016/j.1000-5404.2012.20.004
脓毒症是由感染因素所导致的全身性炎性反应综
合征，是临床创伤、烧伤和感染性疾病患者的常见并发
症，进一步发展可导致脓毒症性休克和多器官功能障
碍综合征，病死率高达 50% ～ 60%［1］。内毒素 /脂多
糖(endotoxin / lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌
细胞外膜的主要成分，其被 LPS 结合蛋白(LPS-bind-
ing protein，LBP)结合并捕获，活化单核-吞噬细胞系
统，引起 TNF-α等炎症介质释放，介导全身性炎症反
应综合征(systemic inflammatory response syndrome，
SIRS) ，即脓毒症等疾病的发生。LPS是脓毒症最主要
的致病因子［2］，故寻求能拮抗 LPS 的物质对脓毒症的
防治具有重要意义。
本课题组在前期工作中运用生物传感器技术，以
LPS的活性中心 lipidA 为靶点，从 114 种传统中草药
中筛选出大黄、地骨皮、栀子、白鲜皮等多种与 lipidA
具有较高亲和力的中药［2 － 4］。本研究采用大孔吸附树
脂、离子交换、聚酰胺和硅胶柱层析等分离方法从白鲜
皮水煎液中分离出能较好拮抗 LPS 活性的组分，分析
其活性，并为下一步阐明白鲜皮抗 LPS 作用的物质基
础奠定实验基础。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂和仪器
鲎试剂为广州湛江安度斯生物工程公司产品;LPS(O111∶ B4，
美国 Sigma公司，批号:024K4077) ;MTT (美国 Sigma 公司，批
号:N2128) ;细胞培养基(Gibco DMEM，美国 Invitrogen 公司，
批号:129007) ;小鼠 TNF-α 和 IL-6 检测试剂盒购自深圳晶美
公司(R＆D公司) ，灵敏度分别为 15、60 pg /ml;AB-8 大孔吸附
树脂(净品级)、D001 离子交换树脂、聚酰胺树脂和硅胶树脂均
为天津海光化工有限公司产品;清洁级昆明系小白鼠 20 只，体
质量 18 ～ 22 g，雌雄各半，由第三军医大学实验动物中心提供;
中药材白鲜皮饮片采购自重庆市渝中区药材批发市场(产地:
四川) ，由重庆工学院天然药物研究院傅善权主任技师鉴定为
芸香科白鲜属植物白鲜(dictamnus dasycarps turcz)的根皮。
SDS-99 细菌 LPS测定系统为湛江正杰科学仪器有限公司
生产;生物传感器及其疏水样品池为美国 Thermo 公司产品;
R205 型旋转蒸发仪为瑞士 BUCHI 公司产品;MODULYO 低温
冷冻干燥机为美国 SAVANT公司产品;CO2培养箱为美国 Ther-
mo公司产品;Model550 酶联分析仪为美国 Bio-Rad公司产品。
1． 2 提取与分离
取白鲜皮 4 kg，用 8 L蒸馏水浸泡 1 h，90 ～100 ℃煎 40 min，
8 000 r /min 离心 30min 取上清，上 AB-8 大孔吸附树脂，上样
后，依次用蒸馏水、20%、30%和 50%乙醇洗脱。将各洗脱相进
行生物传感器检测。取亲和力最高的洗脱相上 D001 离子交换
树脂，依次用水和 20%乙醇洗脱;取亲和力最高的洗脱相上聚
酰胺层析柱，依次用水和 50%乙醇进行洗脱;取亲和力最高的
洗脱相干法上样进行硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯、甲醇∶乙酸
乙酯(1∶ 1 ～ 9∶ 1)、丙酮∶水(4∶ 5)依次洗脱。收集亲和力最高的
洗脱相，并用试管法(茚三酮、α-萘酚、乙酸酐-浓硫酸、盐酸-镁
粉、三氯化铁、碘化铋钾、碘-碘化钾法、试管薄层显色等)进行
定性鉴别。
1． 3 白鲜皮活性组分 BXP-A对 LPS中和能力的检测
BXP-A 以无热源检查用水溶解成 0． 5、1． 0 mg /L，分别取
100 μl与 LPS(0． 2 μg /L)100 μl混合，37 ℃孵育 30 min 后，采
用动态浊度法鲎试验检测孵育后的 LPS值，观察 BXP-A对 LPS
的中和能力，每个浓度作 3 复管，结果以 EU/ml表示。
1． 4 白鲜皮活性组分 BXP-A 对 LPS 诱导的小鼠
RAW264． 7 细胞释放 TNF-α和 IL-6 的影响
新分离细胞数为 1 × 106 /ml 的 RAW264． 7 细胞悬液，按
0. 25 ml /孔加入 96 孔板，置 37 ℃ 5%CO2培养 2 h贴壁;每孔加
入终浓度分别为 50、100、200 mg /L 的 BXP-A 组分，继续培养
1 h，加入 LPS(终浓度为 100 μg /L) ，其中设只加 LPS不加 BXP-
A为阳性对照组，同时设不加 BXP-A 和 LPS 为空白对照组，每
组为 3复孔，继续培养4 h，取上清用 ELISA法检测 TNF-α和 IL-6。
1． 5 白鲜皮活性组分 BXP-A对 RAW264． 7 细胞活力
的影响
将培养的 RAW264． 7 细胞分为对照组和 BXP-A 处理组，
每组设 4 复孔，对照组未加药物，BXP-A 处理组加入不同浓度
的 BXP-A (终浓度分别为 50、100、200、400 mg /L) ，37 ℃、5%
CO2环境下培养 24 h。1 000 r /min 离心 10 min，吸弃细胞培养
上清，每孔加 180 μl 细胞培养液和 MTT 20 μl (5 mg /ml) ，
37 ℃、5%CO2环境下培养 4 h。1 000 r /min 再次离心 10 min，
吸弃细胞培养上清，每孔加 150 μl 二甲基亚砜(DMSO) ，振荡
10 min 促使结晶充分溶解，490 nm 波长检测各孔的光密度值
［D(490) ］。
1． 6 白鲜皮活性组分 BXP-A 对热灭活大肠埃希菌
ATCC35218 注射小鼠的保护作用
取清洁级昆明小白鼠 20 只，采用配对比较法随机分为热
灭活大肠埃希菌对照组、白鲜皮活性组分 BXP-A 组，每组动物
10只。动物称量后，热灭活大肠埃希菌对照组尾静脉注射热灭
活大肠埃希菌(1． 3 × 1011 CFU /kg)及生理盐水(10 ml /kg) ;白
鲜皮活性组分 BXP-A组于热灭活大肠埃希菌注射 5 min 后尾
静脉注射 BXP-A，剂量为 40 mg /kg。注射完毕，各组小鼠分笼
饲养，给等量、充足的饲料和水。观察各组小鼠在注射后 168 h
内的一般情况(精神状态、食欲、活动度和对刺激的反应)、死亡
率及具体死亡时间。
1． 7 统计学分析
实验结果以 珋x ± s表示，采用 SPSS 13． 0 统计软件进行单因
素方差分析。
2 结果
2． 1 白鲜皮活性组分 BXP-A与 LPS亲和力的测定及
定性鉴别结果
在分离过程中，将所得各组分干燥后以 PBS配成 2 g /L，在
生物传感觉器上测定与 LPS的亲和力，结果显示大孔吸附树脂
50%乙醇洗脱相亲和力最高，选择作为继续分离研究的对象。
该部位经 D001 离子交换树脂分离后检测，20%乙醇洗脱相亲
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和力高，故以该洗脱相继续分离。经聚酰胺层析柱分离后检
测，50%乙醇洗脱相亲和力最高，故将该部位上硅胶柱层析进
行分离，分离得到的各成分中以丙酮∶水(4∶ 5)洗脱相(BXP-A)
亲和力最高。定性鉴别显示该成分茚三酮反应(氨基酸、多肽、
蛋白质)阴性，α-萘酚反应(多糖)阴性，乙酸酐-浓硫酸反应(皂
苷)阴性，盐酸-镁粉反应(黄酮)阴性，三氯化铁反应(酚类)阴
性，碘化铋钾反应阳性，碘-碘化钾试管反应阳性、薄层显色鉴
别阳性(硅胶薄层板，正丁醇∶冰醋酸:水 = 4∶ 1∶ 5为展开剂，喷
以改良碘化铋钾显橘红色斑点) ，这 3 种生物碱鉴别方法均示
阳性，故确定分离得到的 BXP-A为生物碱成分。
2． 2 白鲜皮活性组分 BXP-A对 LPS中和能力的检测
结果
BXP-A在 0． 5 ～ 1． 0 mg /L范围内，对 LPS(0． 2 μg /L)介导
的鲎试剂的凝结反应具有抑制作用，其中用药浓度为 1． 0 mg /L
时，加 LPS 的 BXP-A 处理组与阳性对照组有差异显著(P ＜
0. 05，表 1)。
表 1 BXP-A对 LPS介导鲎试剂凝结反应的抑制作用 (珋x ± s)
组别 LPS检测值(EU /ml) LPS检出率(%)
阳性对照组 0． 534 6 ± 0． 026 4 100． 0 ± 4． 9
BXP-A处理组
0． 5 mg /L 0． 430 2 ± 0． 074 7 81． 1 ± 13． 8
1． 0 mg /L 0． 381 9 ± 0． 030 7 71． 4 ± 5． 7a
a:P ＜ 0. 05，与阳性对照组比较
2． 3 白鲜皮活性组分 BXP-A 对 LPS 介导 RAW264． 7
细胞释放 TNF-α和 IL-6 的影响
BXP-A在 100 ～ 200 mg/L 范围内，对 LPS 介导的 RAW264． 7
细胞释放 TNF-α和 IL-6 均呈抑制作用，加 LPS 的 BXP-A 处理
组与阳性对照组有显著性差异，并呈一定的量效关应(P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01，表 2)。
表 2 BXP-A对 LPS介导的 RAW264． 7 细胞释放 TNF-α和 IL-6 的
抑制作用 (pg /ml，珋x ± s)
组别 TNF-α IL-6
空白对照组 171． 39 ± 14． 57 150． 69 ± 14． 93
阳性对照组 3 589． 28 ± 123． 24 2 458． 67 ± 66． 91
BXP-A处理组
50 mg /L 3 662． 99 ± 205． 56 2 450． 27 ± 100． 71
100 mg /L 3 444． 02 ± 298． 08a 2 161． 96 ± 140． 03b
200 mg /L 2 725． 32 ± 246． 88b 1 717． 36 ± 170． 79b
a:P ＜ 0. 05，b:P ＜ 0. 01，与阳性对照组比较
2． 4 白鲜皮活性组分 BXP-A对 RAW264． 7 细胞活力
的影响
BXP-A在浓度≤400 mg /L时，对 RAW264． 7 细胞活力无明
显影响(P ＞0. 05) ，即在药效剂量(100 ～ 200 mg /L)下 BXP-A不
影响细胞活力(表 3)。
2． 5 白鲜皮活性组分 BXP-A对注射热灭活大肠埃希
菌 ATCC35218 小鼠的保护作用
注射热灭活大肠埃希菌(1． 3 ×1010 CFU/ml)的小鼠在 24 h
内全部死亡，而给予 40 mg /kg 的 BXP-A，168 h 内存活率提高
至 40%，显示较热灭活大肠埃希菌对照组存活率明显提高，存
在较好的保护作用(图 1)。
表 3 BXP-A对 RAW264． 7 细胞活力的影响 (珋x ± s)
组别 D(490)
对照组 1． 192 7 ± 0． 089 7
BXP-A处理组
50 mg /L 1． 202 0 ± 0． 055 0
100 mg /L 1． 217 0 ± 0． 036 7
200 mg /L 1． 160 8 ± 0． 045 8
400 mg /L 1． 180 5 ± 0． 019 5
100
80
60
40
20
0 24 48 72 96 120 144 168
存
活
率（
%
）
时间（t/h）
热灭活大肠埃菌对照组
白鲜皮活性组分 BXP鄄A组
图 1 白鲜皮活性组分 BXP-A对注射热灭活大肠埃希菌
ATCC35218 小鼠的保护作用
3 讨论
细菌的多个病原体相关分子模式(pathogen-asso-
ciated molecular patterns，PAMPs)都可参与脓毒症的
发生，目前已知的 PAMPs主要有 LPS、肽聚糖(PGN)、
细菌基因组 DNA(CpG DNA)、磷壁酸(LTA)、鞭毛蛋
白、脂蛋白、酵母多糖以及病毒 DNA 和 RNA 等，其中
LPS是介导脓毒症的主要病原分子［5 － 7］。LPS 作为细
菌重要的 PAMPs，被 LBP捕获后传递给巨噬细胞和单
核细胞膜表面的膜受体 CD14，并以 LPS-CD14 复合物
形式与免疫细胞上的跨膜受体 TLR4 结合，从而将胞
外刺激信号导入胞内，通过启动一系列信号转导级联
事件激活细胞质中的核转录因子(NF-κB) ，活化的
NF-κB 从细胞质移入细胞核结合于转录起始位点，诱
生 TNF-α、IL-1β和 IL-6 等多种细胞因子，引发后续的
生物学效应，引发脓毒症。由于 LPS 的胞内信号转导
极为复杂，LPS诱发的细胞活化及细胞因子级联效应
一旦启动将不易控制。因此，寻求能拮抗 LPS，阻断
LPS的活性中心 lipid A 与其受体的结合是防治脓毒
症的关键。
目前脓毒症的防治研究主要涉及糖皮质激素、丙
酮酸乙酯［8］、他汀类药物［9］等，但都有副作用大或作
用不明显、应用受限等缺点。各种细胞因子的抗体及
其受体拮抗剂，如 TNF-α 抗体、IL-1 抗体、IL-6 抗体以
及 NO拮抗剂，在动物实验研究中对脓毒症所致的脏
器损伤都有一定的保护作用。重组人活化蛋白 C
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(rhAPC)是唯一由美国 FDA 批准，并以商品名“Xig-
ris”投入市场作为重度脓毒症治疗的辅助药物，作用
机理主要为通过负反馈抑制凝血酶原转变为凝血酶来
调控凝血过程，但由于 Xigris有严重的副作用，其治疗
效果一直备受争议，并最终于 2011 年 10 月，由于在
PROWESS-SHOCK实验中并没有显示出 Xigris 与安慰
剂组相比显著提高患者生存率，礼来公司决定终止 Xi-
gris后期所有临床试验，并在全球范围内退市［10］。因
此，寻求能够治疗脓毒症的新药变得十分迫切。
现有研究报道，白鲜皮主要含有生物碱类、柠檬苦
素类、香豆素和黄酮类、甾体类、倍半萜和倍半萜甙类
及多糖化合物等成分，具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫力、
解热等药理作用［11］，但尚少有报道其生物碱类具有抗
LPS的活性。本研究发现，从白鲜皮中提取的生物碱
类成分具有结合并中和 LPS、抑制其诱导的炎症细胞
因子释放的作用，并且在热灭活大肠埃希菌攻击所致
脓毒症模型小鼠上初步证实其具有保护效应，经鉴别
定性为生物碱类成分，但 BXP-A 非单一成分，可能是
一类生物碱的混合物，拟下一步将对其进行进一步分
离，纯化出单体，为深入研究白鲜皮的药理活性，阐明
其药效作用物质基础，特别是以此为基础开发能够拮
抗 LPS、治疗脓毒症的药物奠定实验基础。
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(收稿:2012-07-19;修回:2012-08-11)
(编辑 张 维
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)
个案与短篇 文章编号:1000-5404(2012)20-2100-01
2 例针灸重度晕针的救治体会
吴杰凤 (400038 重庆，第三军医大学西南医院康复理疗科)
［关键词］ 针灸;晕针;人中
［中图法分类号］ R246 ［文献标志码］ B
［通信作者］ 吴杰凤，电话:(023)68765864
晕针是针灸临床治疗的常见不良反应，晕针处理不当造成
患者致残或死亡的报道不少。晕针的防治尤为重要，正确的预
防，迅速、有效处治，可大大减少对患者的伤害［1］。晕针症状分
轻度、重度。轻度:患者面色苍白、头晕、心慌、耳鸣、出冷汗、恶
心、精神疲倦;重度:除以上症状外，患者还出现脉细弱、血压下
降、四肢厥冷、意识丧失、惊厥昏迷、大小便失禁、唇甲青紫、脉
微欲绝、呼吸心跳停止。本人从事针灸治疗工作 26 年，治疗病
患几十万人次，所见轻度晕针 48 例，重度晕针只有 2 例，处理
及时、正确，未对患者造成任何伤害，特将 2 例重度晕针的救治
体会报告如下。
1 临床资料
例 1:杨某，男性，56 岁，右侧脑梗死后遗左侧肢体偏瘫痪，
左侧中枢性面瘫 1 个月余，查体:神志清楚、语言清晰、上肢肌
力Ⅰ级、下肢肌力Ⅲ级，患者坐位，取头皮针:顶颞前斜线上、
中、下部，共打 4 针并接 D6850-A 电针仪，留针 30 min，治疗 4
次，患者感觉一切正常，症状有所改善。第 5 次治疗，打上头皮
针后由进修医师接电针仪，由于其对机器性能了解不够，电流
突然变大，患者立感不适，出冷汗、面色苍白、坐立不稳，随后立
即拔针，让患者就地平卧，患者已人事不省、大小便失禁、血压
下降、脉细弱，立即指掐人中、合谷、内关，30 s 后患者逐渐清
醒，2 min后一切恢复正常。
(下转 2114 页)
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