全 文 ：红毛七的体外抑菌试验
蔡正军 1, 2 ,但飞君 1, 2 ＊,陈国华 2 ,李海龙 2 ,熊亚平 2 ,周大寨 1　(1.湖北民族学院生物资源保护与利用湖北省重点实验室 ,
湖北恩施 445000;2.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北宜昌 443002)
摘要　[目的 ]研究红毛七乙醇提取物及其 5个萃取部位的体外抑菌活性 ,为红毛七的进一步开发利用提供基础。[方法] 红毛七经乙
醇提取 ,系统溶剂萃取分离得到 5个部位。以注射用头孢曲松钠为对照 ,采用管碟法测定提取物及萃取部位对受试菌的抑菌活性 ,并测
定其相应最小抑菌浓度(MIC)。[结果] 红毛七乙醇提取物及其部位对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(临床株)和枯草芽孢杆菌表
现出较强的抑菌活性 ,其最大抑菌圈直径为 20.03、23.52和 20.77mm,其MIC为 0.312 5～ 0.625 0mg/ml。 [结论 ] 红毛七提取物及其 5
个萃取部位对受试菌种抑制作用不同 ,其乙醇提取物及其乙酸乙酯 、正丁醇部位抑菌活性较强。
关键词　红毛七;抑菌活性;活性部位
中图分类号　S567.23+6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)35-15541-03
StudyoninvitroAntibacterialActivityofCaulophylumrobustumMaxim.
CAIZheng-junetal　(KeyLaboratoryofBiologicResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince, HubeiInstituteforNationalities,
Enshi, Hubei445000)
Abstract　[ Objective] TheaimwastostudyvitroantibacterialactivityofethanolextractanditsextractivefractionsofCaulophylumrobustum
Maxim.andprovidereferencefordevelopmentandutilizationofCaulophylumrobustumMaxim..[ Methods] CaulophylumrobustumMaxim.
wasextractedbyethanol, fivefractionswereobtainedbysystematicsolventsextractionseparation.Ceftriaxonesodiumwasusedascontrol, an-
tibacterialactivityofethanolextractanditsextractivefractionsofCaulophylumrobustumMaxim.weredeterminedbycylinder-platemethod
andtheircorrespondingminimuminhibitionconcentration(MIC)werealsodetermined.[ Results] Ethanolextractanditsextractivefractions
ofCaulophylumrobustumMaxim.showedhighantibacterialactivityagainstStaphylococcusaureus, Staphylococcusaureus(clinicbacterial)and
Bacilussubtilis, thediametersofthebiggestinhibitionzonewas20.03, 23.52 and20.77mm.TheMICofthesewere0.312 5-0.625 0
mg/ml.[ Conclusion] TheextractanditsfiveextractivefractionsofCaulophylumrobustumMaxim.haddiferentantibacterialactivityagaist
testedbacteria.Theethandextractanditsethylacetateandbutanolfractionsshowedhighantibacterialactivity
Keywords　CaulophyllumrobustumMaxim.;Anti-bacterialactivity;Activityfraction
基金项目　湖北省生物资源保护与利用重点实验室开放基金项目
(2007005)。
作者简介　蔡正军(1982-),男 ,江苏盐城人 ,在读硕士 , 从事天然产物
的活性成分研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2008-10-13
　　红毛七为小檗科红毛七属植物类叶牡丹(Caulophylum
robustumMaxim.)的根及根茎 ,又名葳严仙 、红毛三七 、海椒
七 、鸡骨升麻 、红毛细辛 、搜山猫等。该属植物全世界约 2
种 ,在我国仅一种 ,分布于东北及陕西 、甘肃 、安徽 、浙江 、湖
北 、四川 、西藏等地 [ 1-2] 。红毛七为传统 “七药 ”之一 ,也为长
江三峡库区民间广为使用的民间中草药 [ 3] ,其性温 、味苦辛 ,
具有理气止痛 、祛风活血 、抗菌 、散瘀等功效 ,用于治疗跌打
损伤 、风湿疼痛 、胃腹疼痛 、月经不调等病症 [ 4-7] 。而其同属
植物兰籽类叶牡丹(Caulophylumthalictroides)在东北美地区
也有相似的用途 ,其化学成分主要为生物碱 、挥发油 、甾醇 、
三萜皂苷等 [ 8-9] 。谭苹等研究表明 ,红毛七水提液抑制金黄
色葡萄球菌和白色葡萄球菌作用与对照组黄连相当 [ 10] 。笔
者在上述文献的基础上 ,对红毛七体外抗菌试验(管碟
法 [ 11])进行了研究 ,发现红毛七粗提物及不同萃取部位具有
较好的抗菌活性 ,为进一步活性追踪其化学成分提供了依据
和导向 ,进而为三峡库区药材红毛七开发利用提供基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　仪器。 N-1001型旋转蒸发器(日本 EYELA), YXQ-
LSⅡ全自动立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司),
HPX-9052MBE数显电热培养箱(上海博讯实业有限公司),
AL204电子天平(METTLWRTOLEDO), SW-CJ-1F型超净工
作台(苏州净化设备有限公司)等。
1.1.2　药材 。 2007年 7月采于湖北长阳土家族自治区 ,经
三峡大学汪鋆植教授鉴定为小檗科红毛七属植物红毛七
的根。
1.1.3　试剂 。注射用头孢曲松钠(中渃药业(石家庄)有限
公司), 95%乙醇(武汉化工厂 ,化学纯),石油醚 、三氯甲烷 、
乙酸乙酯 、丙酮 、正丁醇等(天津博迪化学试剂 ,分析纯)。
1.1.4　培养基。牛肉膏蛋白胨培养基(北京双旋微生物培
养基制品厂),琼脂粉(上海惠兴生化试剂有限公司)。
1.1.5　菌种。临床菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和绿脓杆菌(Pseudomonas
aeruginosa)由湖北省宜昌市中心医院从临床分离所得耐药
菌株;标准菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)、大
肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)
和枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)由湖北省宜昌市三峡大学
化生学院微生物实验中心提供。
1.2　试验方法
1.2.1　抗菌剂制备。将干燥的红毛七根 3.6 kg粉碎 ,过 20
目筛 , 95%乙醇回流提取 ,减压浓缩得总浸膏 1 347.8 g。总
浸膏用适量水溶解 ,依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇
萃取。各萃取液及水相减压浓缩回收溶剂 ,得不同极性部位
浸膏 ,即石油醚部位 50.3g、氯仿部位 59.8 g、乙酸乙酯部位
33.2 g、正丁醇部位 489.4 g、水部位 350.2 g。精密称取所得
各部位浸膏 100mg,配制成 10 ml得 10mg/ml药液;对照药:
注射用头孢曲松钠配制成 1mg/ml,备用。
1.2.2　固体培养基的制备。称取营养琼脂置于三角烧瓶
中 ,用去离子水溶解 , 121 ℃高压灭菌 15 min,待冷却至 60 ℃
后取出 ,备用 。
1.2.3　菌悬液的制备。取 7支试管 ,分别加入等量生理盐
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2008, 36(35):15541-15543 责任编辑　李占东　责任校对　吴晓燕
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.35.158
水至试管的 1/3处 ,紫外灭菌 20 min,无菌棉签蘸取新鲜菌
种少量(4 ～ 5个菌落)于生理盐水中充分搅动使细菌分散均
匀 。校正菌液浓度与标准比浊管相同 ,即达 015号麦氏比浊
管浊度 ,所有步骤均在无菌条件下完成。
1.2.4　抑菌活性的测定。采用管碟法 ,吸取菌悬液 0.2 ml
均匀涂布于平板(内径 90 mm)表面 ,等距离放入 4个灭菌的
牛津杯(10.0 mm×8.0mm×6.0mm),逐一加入抗菌剂 200
μl,以 1mg/ml的注射用头孢曲松钠作阳性对照。 37 ℃恒温
培养 24 h,观察抑菌情况 ,游标卡尺测量抑菌圈直径 ,各菌重
复试验 6次 ,采用软件 SPSS进行均值分析 ,评价抑菌活性。
1.2.5　最低抑菌浓度(MIC)的测定。以无菌水为空白对照 ,
采用平板二倍稀释法测定各样品对不同细菌的 MIC。按 2
倍比稀释法配成浓度梯度的抗菌剂:5、2.5、1.25、0.625、
0.312 5、 0.156 25、0.078 125 mg/ml。分别吸取各浓度的抗
菌剂 2ml,与 15ml无菌培养基(低于 45 ℃)充分混匀 ,并冷
却制成含抗菌剂平板。编号 ,吸取供试菌悬液 0.1ml均匀涂
布于平板 , 37℃恒温培养 24h,观察各菌生长情况 ,以完全无
菌生长的平板所对应的抗菌剂浓度作为最低抑菌浓度 ,各菌
重复试验 3次。
1.3　数据处理 　采用 SPSS13.0 forWindows(One-Way
ANOVA)软件对多次抗菌测试结果进行均值分析 ,试验数据
以 x±S表示。
2　结果与分析
2.1　红毛七提取物及不同部位抑菌效果　由表 1可知 ,红
毛七提取物及其各萃取部位对不同受试菌株具有一定的抗
菌活性 ,但不同成分对各菌的抗菌活性有所不同。红毛七乙
醇提取物及其部位对金黄色葡萄球菌 、金黄色葡萄球菌(临
床株)和枯草芽孢杆菌表现出较强的抑菌活性 ,其最大抑菌
圈直径分别为 20.03、23.52与 20.77 mm。甚至对对照药不
起作用的致病性临床株绿脓杆菌也具有较强的抑菌活性 ,其
乙酸乙酯和正丁醇萃取部分的抑菌圈直径分别为 15.65和
14.49 mm。
另外 ,红毛七各乙醇提取物及其乙酸乙酯 、正丁醇部位
对不同受试菌都具有一定的抑菌活性 ,表明红毛七具有较为
广谱的抑菌活性 ,其中抑菌活性成分集中于中等极性的乙酸
表 1　红毛七提取物及不同萃取部位抑菌效果(抑菌圈直径)
Table1　AntibacterialefectofdifferentextractionfractionandC.robustumextracts mm
菌种
Strain
注射用头孢曲松钠
Ceftriaxone
forinjection
乙醇提取物
Ethanol
extract
石油醚部位
Petroleum
etherfraction
氯仿部位
Chloroform
fraction
乙酸乙酯部位
Ethylacetate
fraction
正丁醇部位
Butanol
fraction
水部位
Water
fraction
金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 21.16±0.84 20.03±0.49 16.37±0.59 13.87±0.64 14.67±0.35 18.89±0.67 -
大肠杆菌 Escherichiacoli 23.37±0.53 13.12±0.49 - 15.11±1.15 17.23±0.91 12.47±0.86 -
绿脓杆菌 Pseudomonasaeruginosa 24.65±0.81 16.32±0.86 - - 15.58±0.94 17.43±0.24 -
枯草芽孢杆菌 Bacilussubtilis 20.40±1.02 16.76±0.47 - 22.56±0.91 12.42±1.13 23.52±0.31 -
金黄色葡萄球菌(临床株)Staphylococcus 25.66±0.23 20.77±0.35 15.63±0.13 17.73±0.15 15.27±0.27 16.73±0.51 15.61±0.94
aureus(clinicalisolates)
大肠杆菌(临床株)Escherichiacoli 30.84±1.16 14.10±0.66 13.21±0.56 - 13.15±0.13 15.68±0.52 -
(clinicalisolates)
绿脓杆菌(临床株)Pseudomonas - 10.21±1.25 - - 15.65±0.32 14.49±1.53 -
aeruginosa(clinicalisolates)
乙酯部位和较大极性的正丁醇部位 。
2.2　红毛七提取物及不同萃取部位的最小抑菌浓度(MIC)
　由表 2可知 ,空白组各菌长势旺盛 ,乙醇提取物对金黄色
葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(临床株)的 MIC均为 0.625 0
mg/ml;氯仿部位对枯草芽孢杆菌和临床株金黄色葡萄球菌
的 MIC均为 0.625 0 mg/ml;乙酸乙酯部位对大肠杆菌抑制
较强 ,其 MIC为 0.625 0mg/ml;正丁醇部位对枯草芽孢杆菌
的 MIC最小 ,为 0.312 5mg/ml,其次是对金黄色葡萄球菌的
MIC为 0.625 mg/ml;其余各样品对不同菌的 MIC值均大于
1mg/ml。
表 2　红毛七提取物及不同萃取部位的最小抑菌浓度
Table2　MICofdiferentextractionfractionandC.robustumextracts mg/ml
菌种
Strain
乙醇提取物
Ethanol
extract
石油醚部位
Petroleum
etherfraction
氯仿部位
Chloroform
fraction
乙酸乙酯部位
Ethylacetate
fraction
正丁醇部位
Butanol
fraction
水部位
Water
fraction
金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 0.625 1.25 2.5 1.25 0.625 -
大肠杆菌Escherichiacoli 2.5 - 1.25 0.625 2.5 -
绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa 1.25 - - 1.25 1.25 -
枯草芽孢杆菌 Bacilussubtilis 1.25 - 0.625 2.5 0.312 5 -
金黄色葡萄球菌(临床株)Staphylococcusaureus 0.625 1.25 0.625 1.25 1.25 1.25
(clinicalisolates)
大肠杆菌(临床株)Escherichiacoli(clinicalisolates) 2.5 2.5 - 1.25 1.25 -
绿脓杆菌(临床株)Pseudomonasaeruginosa(clinicalisolates) 2.5 - - 2.5 2.5 -
3　结论与讨论
(1)红毛七提取物及萃取部位对供试菌的抑菌活性因菌
种不同而存在差异 ,在测定浓度 0.078 125 ～ 10 mg/ml范围
内 ,金黄色葡萄球菌 、金黄色葡萄球菌(临床株)和枯草芽孢
15542 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
杆菌 3种供试菌比大肠杆菌 、绿脓杆菌 、大肠杆菌(临床株)
和绿脓杆菌(临床株)4种供试菌对红毛七成分更敏感 。由
于金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒和医院内感染的
一种重要病原菌 ,且是最易产生耐药性的致病菌之一 ,红毛
七活性成分对金黄色葡萄球菌较强的抑菌作用预示着开发
红毛七活性成分作为植物源抗菌剂的可能性。
(2)该试验结果表明 ,红毛七乙醇提取物及其乙酸乙酯 、
正丁醇部位对受试菌都具有较强的抑制活性 ,表明红毛七乙
醇提取物及其乙酸乙酯 、正丁醇部位的抗菌谱较广 ,并且中
等极性的乙酸乙酯部位和较大极性的正丁醇部位为红毛七
的抗菌活性主要部位。笔者将对红毛七乙酸乙酯和正丁醇
萃取部位的活性成分做进一步的研究 ,再进行抗菌活性的评
价 ,最终分离出具有抗菌活性的单体成分。同时 ,该试验为
抗菌药物的筛选 、抗菌谱的测定 、药价测定 、提取过程的追踪
等提供了可供参考的数据资料 ,为中药红毛七的进一步开发
利用提供一些基础资料。
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(上接第 15538页)
表 3　浸膏得率和绿原酸含量方差分析
　　Table3　Varianceanalysisofextractyieldandchlorogenicacid
content
项目
Item
方差来源
Variance
source
离差平方和
Sumofsquares
ofdeviations
方差
Variance
F值
Fvalue
P值
Pvalue
浸膏得率 A 51.011 25.506 173.51 <0.01
Extractyield B 8.375 4.188 28.49 >0.01
C 0.293 0.147 1.00
D 289.209 144.604 983.70 <0.01
UV A 2.742 1.371 2.99 >0.10
B 5.502 2.751 6.01 >0.10
C 0.915 0.458 1.00
D 12.274 6.137 13.40 <0.10
HPLC A 0.942 0.471 3.99 >0.10
B 0.235 0.118 1.00
C 0.445 0.222 1.88 >0.10
D 3.900 1.950 16.52 <0.10
　注:自由度均为 2。
　Note:Degreeoffreedomis2.
不同 ,这是因为在水提过程中 ,一般情况下随着温度的升高 ,
水溶性物质的溶解度增大 ,故以浸膏得率为指标的最佳提取
温度较高;而绿原酸受温度影响较大 ,温度过高会导致绿原
酸的分解 ,故以绿原酸为指标的最佳提取温度不宜过高。
3.2　绿原酸检测方法的确定　该试验利用紫外分光光度法
(UV)与高效液相法(HPLC)测定绿原酸含量 ,结果表明紫外
分光光度法较高效液相法测定的绿原酸含量高 ,偏差较大 ,
但趋势基本相同 ,其原因可能是由于紫外检测时 ,所有在 328
nm波长处有吸收的物质都会被检测出来 ,而 HPLC分离度
好 ,检测灵敏 ,故绿原酸的检测应采用高效液相法为佳。
该方法操作简便 ,条件容易控制 ,工艺稳定性好 ,检测方
法灵敏 、可靠 ,适合工业化生产 ,为灰毡毛忍冬药材的质量控
制规范化 、标准化提供了依据。
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