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HPLC法同时测定野木瓜中齐墩果酸与熊果酸的研究
唐维媛 1, 2 , 张义明＊ 1, 2, 3 , 董永刚4
(1.贵州大学昆虫研究所 , 贵阳　550025;2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室 , 贵阳　550003;
3.贵州工业职业技术学院 , 贵阳　550008;4.贵州大学化学工程学院 , 贵阳　550003)
　　摘　要:采用 HPLC法 , 同时测定贵州特产野木瓜中差向异构体———齐墩果酸 、 熊果酸含量。实验表明
在色谱柱为 Shim-packVP-ODS柱 (250nm×4.6mm, 5μm);流动相为乙腈 -1.1%乙酸水 (94:6);流速
为 0.5mL/min;检测波长 205nm;柱温为室温;进样量 20μl时 , 两物质特征峰分离良好 , 检测结果准确 , 测
得野木瓜中齐墩果酸平均含量为 0.1138%, 熊果酸平均含量为 0.4400%。
关键词:HPLC;野木瓜;差向异构体;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:TS207.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2010)04-0196-05
Determinationofoleanolicandursolicinchaenomeles
cathayensis(Hemsl.)schneidatthesametimebyHPLC
TANGWei-yuan1, 2 , ZHANGYi-ming＊ 1, 2, 3 , DONGYong-gang4
(1.InstituteofEntomology, GuizhouUniversity, Guiyang550025, China;2.Guizhou
ProvincialKeyLabofFermentationTechnologyandBiologicalPharmacy, Guiyang550003, China;
3.GuizhouInstituteofIndustrialTechnology, Guiyang550008, China;
4.ChemicalEngineeringSchoolofGuizhouUniversity, Guiyang550003, China)
Abstract:HPLCareusedtodeterminetheepimercontentofoleanolicandursolicinChaenomelescathayensis
(Hemsl.)Schneidatthesametime.Thestudyindicatethattheefectsofseparationanddeterminationwillbewel
whenthedeterminationparametersareasfolows:analyticcolumn:Shim-packVP-ODScolumn(250nm4.6mm,
5μm);Themobilephaseisacetonitrile-1.1% aceticacidwater(94:6);Flowrate:0.5mL/min;UVdetection
wavelength:205nm;Columntemperatureisroomtemperature.Bythismethod, theaveragecontentofoleanolicin
Chaenomelescathayensis(Hemsl.)Schneidis0.1138%, andtheaveragecontentofursolicis0.4400%.
Keywords:HPLC;Chaenomelescathayensis(Hemsl.)schneid;epimer;oleanolic;ursolic
野木瓜 [ Chaenomelescathayensis(Hemsl.)
Schneid] 是一种比较珍贵 , 药食一体的天然植
物 , 盛产于 “中国野木瓜之乡 ” ———贵州省正安
县 。野木瓜中所含齐墩果酸 (oleanolic)、 熊果酸
(ursolic)等五环三萜皂苷是其主要的生理活性物
质 [ 1] 。近年来研究表明:齐墩果酸 、 熊果酸不仅
具有消炎抑菌 、 降低转氨酶 、 促进肝细胞再生 、
防止肝硬化等功效 , 还具有一定的抗癌活性 [ 2] ,
且以熊果酸尤为突出 , 故而对野木瓜中齐墩果酸
及熊果酸展开研究 , 具有非常重要的科学意义 。
收稿日期: 2010-05-31　　　　　＊通讯作者
基金项目:贵州大学自然科学青年科研基金 (贵大自青基合字 [ 2007] 023号)。
作者简介:唐维媛 (1977-), 女 , 硕士 , 讲师 , 研究方向为天然产物活性成分分析。
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在采用测定三萜皂苷所常用的比色法 、 分光
光度法及薄层扫描法[ 3]等 , 定量齐墩果酸与熊果
酸时 , 由于两者几乎是共生共存于天然产物当
中 , 并且是一对差向异构体 (见图 1、 图 2), 结
构相似 , 极性差别小 , 因而很容易产生误差 , 造
成定量困难 [ 4] 。故本研究拟从它们结构当中孤立
的双键 , 会在低波长处产生紫外吸收的特点[ 2]着
手 , 建立起同时测定野木瓜中齐墩果酸 、 熊果酸
的 HPLC法 , 为其快速 、 准确定量 , 提供可靠的
科学研究依据。
图 1　齐墩果酸的分子结构
Fig.1　Themolecularformulaofoleanolic
图 2　熊果酸的分子结构
Fig.2　Themolecularformulaofursolic
1　材料与方法
1.1　主要仪器
岛津 10AVp高效液相色谱仪:包括 LC-10A
高压输液泵两台 , SPD-10AVp紫外可见光检测
器 , SCL-10AVp系统检测器及 CTO-10AVp柱
温箱;EYELAN-1000V-WB旋转蒸发仪;梅特
勒分析天平;岛津 UV-2550紫外可见分光光度
计;MiliporeA10超纯水制备仪;超声波清洗器
等 。
1.2　原料与试剂
野木瓜鲜果 , 由贵州省正安县天楼野木瓜有
限公司提供;
齐墩果酸 、 熊果酸标准品 (纯度大于 98%,
中国药品生物制品检定所提供);
乙腈 、 甲醇 、 醋酸 (色谱纯 , TEDIACOM-
PANY.INC提供), 其它试剂均为国产分析纯。
1.3　方法
1.3.1　色谱条件
色谱柱为 Shim-packVP-ODS柱 (250nm×
4.6mm, 5μm);流动相为乙腈 -1.1%乙酸水
(94 ∶6);流速 0.5mL/min;检测波长 205nm;柱
温为室温;进样量 20μL。
1.3.2　齐墩果酸与熊果酸特征峰分离度测定
在 HPLC法中 , 分离度 R(Resolution)大于
或等于 1, 是准确定量的前提:
R=2 (t2 -t1) / (w2 +w1)
式中:t1、 t2 -两相邻组分的保留时间;
w1 、 w2 -两组分色谱峰的基线峰宽 。
1.3.3　齐墩果酸标品溶液制备
精密称取减压干燥至恒重的齐墩果酸标品
4.00mg, 至 10mL容量瓶 , 加甲醇溶解稀释至刻
度 , 得浓度为 0.40mg/mL的对照品溶液。再分别
精 密 吸 取 该 液 0.50、 1.00、 1.50、 2.00、
2.50mL, 于 10mL容量瓶中 , 加甲醇定容 , 得浓
度梯度为 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.10mg/mL
的齐墩果酸标品溶液。
1.3.4　熊果酸标品溶液制备
精密称取减压干燥至恒重的熊果酸标品
12.00mg, 至 10mL容量瓶 , 加甲醇溶解稀释至刻
度 , 得浓度为 1.20mg/mL的对照品溶液。再分别
精 密 吸 取 该 液 0.50、 1.00、 1.50、 2.00、
2.50mL, 于 10mL容量瓶中 , 加甲醇定容 , 得浓
度梯度为 0.06、 0.12、 0.18、 0.24、 0.30mg/mL
的熊果酸标品溶液 。
1.3.5　样品溶液的制备
取野木瓜鲜果切片干燥后粉碎 , 过 120目筛 ,
精密称取 10.00g于烧瓶中 , 加入 100mL石油醚
回流脱脂两次 , 每次 2h, 过滤。再将处理好的木
瓜粉干燥后 , 称取 2.00g于索氏提取器中 , 加入
100mL75%乙醇回流 2 ～ 3h, 然后真空浓缩该提
取液 , 并将所得浸膏用甲醇富集定容于 50mL容
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量瓶中 , 过 0.45μm滤膜 , 即得样品溶液。
1.3.6　样品含量计算
样品含量 = [ (样品溶液浓度 ×样品溶液体
积)/样品干重 ] ×100%
2　结果与分析
2.1　分离度测定结果
将 1.3.3中浓度为 0.40mg/mL的齐墩果酸对
照品溶液与 1.3.4中浓度为 1.20mg/mL的熊果酸
对照品溶液混合 , 以 1.3.1色谱条件测定 , 得此
混合溶液中齐墩果酸保留时间 t=21.426min, 峰
宽 w=0.86;熊果酸保留时间 t=22.265min, 峰
宽 w=0.67。经计算 , 分离度 R=1.0967, 该值
大于 1, 说明:在本色谱条件下 , 齐墩果酸与熊
果酸分离效果良好 , 能够进行准确定量。
2.2　标准曲线绘制
分别准确吸取 1.3.3及 1.3.4中 , 不同浓度
梯度的齐墩果酸 、熊果酸标品溶液各 20μL, 进样
检测 , 以峰面积为横坐标 , 标品浓度为纵坐标作
齐墩果酸 、 熊果酸标准曲线 (图 3、 图 4), 齐墩
果酸回归方程 y=3.81424×10-8x-0.00240239,
相关系数 r=0.9994, 熊果酸回归方程 y=
3.99319×10-8x-0.00057 , 相关系数 r=0.9988,
说明:齐墩果酸标品溶液浓在 0.02 ～ 0.10mg/mL
范围内线性关系良好 , 熊果酸对照品溶液浓度在
0.06 ～ 0.30mg/mL范围内线性关系良好 。
图 3　齐墩果酸标准工作曲线
Fig.3　Thestandardworkcurveofoleanolic
图 4　熊果酸标准工作曲线
Fig.4　Thestandardworkcurveofursolic
2.3　样品含量测定
按 1.3.5的样品溶液制备方法配制平行样品
1、 样品 2。并分别对它们采用 1.3.1中色谱条件
进行检测 (见图 5), 并根据所得样品溶液浓度 ,
计算样品含量 , 结果见表 1。
图 5　齐墩果酸 、 熊果酸色谱图
Fig.5　Chromatogramofoleanolicandursolic
表 1　样品溶液中齐墩果酸 、 熊果酸含量
Tab.1　Thecontentofoleanolicand
ursolicinthesample
项目 样品 1 样品 2 平均
样品溶液中齐墩果酸浓度 (mg/mL) 0.0430 0.0480 0.0455
样品溶液中熊果酸浓度 (mg/mL) 0.1660 0.1860 0.1760
野木瓜中齐墩果酸含量 (%) 0.1075 0.1200 0.1138
野木瓜中熊果酸含量 (%) 0.4150 0.4650 0.4400
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3　方法学考察
3.1　精密度实验
取 1.3.3中浓度为 0.06mg/mL的齐墩果酸标
品溶液及 1.3.4中浓度为 0.18mg/mL的熊果酸标
品溶液分别重复进样 5次 , 每次 20μL, 得齐墩果
酸峰面积相对标准偏差 (RSD)为 1.1570%, 熊
果酸峰面积 RSD为 1.2524%, 两值均小于 5%,
说明仪器性能良好 , 随机误差小 , 色谱分析方法
适宜 [ 5-7] 。
表 2　标品精密度实验结果
Tab.2　Theprecisionexperimentationresultsofstandard
序号 1 2 3 4 5 RSD(%)
齐墩果酸峰面积 1688072 1695542 1739667 1711080 1708643 1.1570
熊果酸峰面积 4650982 4685213 4795015 4766077 4703998 1.2524
3.2　重复性实验
取按 1.3.5方法配制的样品 2溶液 5份 , 在
1.3.1色谱条件下测定 , 根据峰面积值 , 计算重
复测定野 木瓜 中齐墩 果酸峰 面积 RSD为
1.0500%, 熊果酸 RSD为 0.4789%。说明:此方
法检测野木瓜中齐墩果酸 、 熊果酸 , 具有很好的
可重复性 。
表 3　样品溶液重复性实验结果
Tab.3　Thereproducibilityexperimentationresultsofsample
序号 1 2 3 4 5 RSD(%)
齐墩果酸峰面积 1411512 1411932 1388913 1402334 1378341 1.0500
熊果酸峰面积 4872236 4884461 4831268 4869619 4837539 0.4789
3.3　稳定性实验
将按 1.3.5方法配制的样品 2溶液 , 室温放
置 1、 2、 4、 6、 8h后 , 分别进样测定 , 结果样品
溶液在 8h内没有明显变化 , 齐墩果酸峰面积
RSD为 1.7829%, 熊 果 酸 峰 面 积 RSD为
0.4972%, 说明采用 1.3.5提取的野木瓜样品溶
液在 8h内稳定。
表 4　稳定性实验结果
Tab.4　Thestabilityexperimentationresultsofsample
时间 (h) 1 2 4 6 8 RSD(%)
齐墩果酸峰面积 1399581 1362584 1425001 1408445 1422207 1.7829
熊果酸峰面积 4854112 4833108 4864117 4876905 4816758 0.4972
3.4　加样回收率实验
精密吸取 0.50mL已测得齐墩果酸浓度为
0.0430mg/mL、熊果酸浓度为 0.1660mg/mL的样
品 1溶液于 5mL小烧杯中 , 共 9份 , 分为 3组 ,
每组 3份。第 1组分别加入齐墩果酸标品 (质量
浓度为 0.06mg/mL)0.30mL, 熊果酸标品 (质
量浓度为 0.12mg/mL)0.20mL;第 2组分别加入
上述齐墩果酸标品 0.60mL, 熊果酸标品 0.40mL;
第 3组分别加入上述齐墩果酸标品 0.90mL, 熊果
酸标品 0.60mL。
按 1.3.1色谱条件分别进样 , 3组样品中齐
墩果酸回收率如表 5所示 , RSD为 1.2030%, 平
均回收率为 99.83%;3组样品中熊果酸的回收率
如表 6所示 , RSD为 1.5215%, 平均回收率为
99.79%, 两者均在理想范围之内 , 表明本方法对
样品的定量分析结果准确度高。
200　
表 5　齐墩果酸加样回收率实验结果
Tab.5　Therecoveryrateexperimentationresultsofoleanolic
样品中齐墩果酸含量 (mg) 加入标样量 (mg) 测得总量 (mg) 回收率 (%) 平均 (%) RSD(%)
0.0215 0.018 0.0389 98.48
0.0215 0.018 0.0402 101.82
0.0215 0.018 0.0386 97.64
0.0215 0.036 0.0578 100.34 99.83 1.2030
0.0215 0.036 0.0580 100.89
0.0215 0.036 0.0571 99.30
0.0215 0.054 0.0759 100.53
0.0215 0.054 0.0752 99.60
0.0215 0.054 0.0754 99.88
表 6　熊果酸加样回收率实验结果
Tab.6　Therecoveryrateexperimentationresultsofursolic
样品中熊果酸含量 (mg) 加入标样量 (mg) 测得总量 (mg) 回收率 (%) 平均 (%) RSD(%)
0.083 0.024 0.1074 100.33
0.083 0.024 0.1059 99.04
0.088 0.024 0.1068 99.83
0.083 0.048 0.1357 103.06
0.083 0.048 0.1291 98.55 99.79 1.5215
0.083 0.048 0.1287 98.22
0.083 0.072 0.1561 100.74
0.083 0.072 0.1525 98.39
0.083 0.072 0.1549 99.96
4　结论
本研究所建立的同时检测野木瓜中齐墩果
酸 、熊果酸的 HPLC法 , 能够实现野木瓜中差向
异构体 ———齐墩果酸与熊果酸的良好分离及准确
测定 , 方法简便快捷 、 精密度高 、 重现性好 , 实
验测得野木瓜中齐墩果酸平均含量为 0.1138%,
熊果酸平均含量为 0.4400%。
参考文献:
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