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类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用



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(收稿日期:2012-11-10)
类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用
赵 军1,2,刘 涛1,马 龙1,苏德奇1(1.新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐 830011;2.新疆药物研究所维吾尔药重点
实验室,乌鲁木齐830004)
摘要:目的 观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法 采用卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)建立大
鼠原代肝细胞免疫性损伤模型,测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和一氧化氮
(NO)在不同培养时间点(3,6,12和24h)的含量。结果 与模型组相比较,类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ALT、AST
和NO水平(P<0.01),且呈剂量依赖关系。结论 类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有
保护作用。
关键词:类叶升麻苷;肝细胞;免疫性肝损伤;肝保护作用
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2013.03.018
中图分类号:R965   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2013)03-0269-03
Protective effects of acteoside on immunological liver injury in rat primary hepatocytes
ZHAO Jun1,2,LIU Tao1,MA Long1,SU Deqi 1(1.Colege of Public Health,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China;
2.Institute of Materia Medica of Xinjiang,Urumqi 830004,China)
Abstract:Objective To study the effect of acteoside on immunological liver injury model in vitro.Methods Immunological liver inju-
ry in rat primary hepatocytes was induced by Bacilus Calmette Guerin(BCG)plus lipopolysaccharides(LPS).The levels of super-
natant AST,ALT and NO at different cultural time points were determined by general methods.Results Compared with model
group,acteoside(5,20and 80μg·mL-1)significantly decreased the supernatant enzyme activities(AST,P<0.01;ALT,P<0.01)
and nitric oxide(NO,P<0.01).Conclusions The results indicate that acteoside had significantly protective effects on the damage
of the primary cultured hepatocytes in rats by BCG plus LPS.
Key words:acteoside;hepatocytes;immunological liver injury;hepatoprotective effect
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:81260624)
  苯乙醇苷类(phenylethanoid glycosides)含有羟
基、甲氧基取代苯乙基及羟基、甲氧基取代肉桂酰基,
通常是以β-葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天
然糖苷类化合物,具有抗氧化、抗菌抗炎和免疫调节
等多种药理作用[1]。近年来还发现,该类化合物具有
较强的肝保护作用。类叶升麻苷(acteoside)是此类
成分中最有代表性的化合物,是多种复方及单方中药
民族药所含的主要标志性成分,广泛分布于肉苁蓉和
列当等生长于干旱、半干旱地区的植物中[2-3]。为了
进一步开发类叶升麻苷,拓展其应用,笔者以临床常
用的保肝降酶药联苯双酯(DDB)作为阳性对照,采用
卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)诱导的原代肝细胞
损伤模型,在体外研究类叶升麻苷的肝保护作用。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Beckman 700全自动生化分析仪(Beck-
man公司);CO2恒温培养箱(Thermo Forma公司);
HL-2型恒流泵(上海精科实业有限公司);TDL80-
2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);BOXUN洁
净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);
ZPX-35BI座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安
医疗器械厂)。
1.2 试药 类叶升麻苷(自制,质量分数>95%);联
苯双酯滴丸(DDB,德州德药制药有限公司,批号
060410);Ⅳ型胶原酶、脂多糖LPS(E coli 0555:B5,Sig-
ma公司);高糖DMEM培养基(GIBCO公司);无噬菌
体低内毒素胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限
公司,批号061205);卡介苗(BCG,上海生物制品检定
所,50mg/支);谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶
(ALT)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司);N-
萘基-乙烯二胺和对氨基苯磺酰胺(Fluka公司)。
1.3 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠(180~
220g)购自新疆医科大学实验动物中心,动物使用许
可证号SYXK[新]2003-0001。
962西北药学杂志 2013年5月 第28卷 第3期
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2 方法
2.1 大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤模型的制备 
雄性Sprague-Dawley大鼠10只,随机分为正常对照
组和模型组,模型鼠经尾静脉注射BCG 8mg/只(约
5×107个活菌数)致敏,正常对照组经尾静脉注射同
体积生理盐水。实验第12d后分别取正常和BCG
致敏的大鼠,按文献报道方法[4]采用两步灌流法分离
获取大鼠原代肝细胞:用3g·L-1的戊巴比妥钠0.5
mL麻醉后,手术分离肝门静脉并行门静脉插管,以
37℃恒温氧饱和的无钙灌流液500mL灌流肝脏(流
速20mL·min-1),并迅速剪断下腔静脉,作在位灌
流5min,边灌流边切断肝与周围组织的联系,37℃
恒温氧饱和的0.25g·L-1Ⅳ型胶原酶灌流液循环
灌流10min,然后经门静脉插管推注4 ℃高糖
DMEM培养液20mL封闭消化。取出肝脏放入盛
有30mL含4℃高糖DMEM培养液的平皿中,用高
糖DMEM培养液清洗2次,散落肝细胞,用100目
筛网过滤,收集细胞悬液,500r·min-1离心3min,
弃上清液,向沉淀中加入高糖DMEM培养液轻轻吹
打均匀,同条件重复离心2次。用4g·L-1等张台
盼蓝溶液染色,光镜下计数细胞产量与活率,细胞活
率在95%以上的肝细胞用于进一步实验。
2.2 细胞活性实验 设正常对照组、模型组(BCG+
LPS)、溶剂对照组(BCG+LPS+DMSO)、类叶升麻苷
(5,20和80μg·mL-1)组和DDB(5,10和20μg·mL-1)
组。取正常和BCG致敏的大鼠肝细胞悬液用高糖
DMEM培养液稀释成2.5×105细胞·mL-1,接种于
24孔培养板中,每孔1.0mL。继续培养16h后,
BCG致敏大鼠的肝细胞用10μg·mL-1的LPS攻
击,造成肝损伤细胞模型,同时分别加入以不含血清
的高糖DMEM培养液配制的各质量浓度样品溶液
1.0mL,继续培养。分别于3,6,12和24h收集细胞
上清液,置-70℃冰箱保存,待测。细胞上清液
AST和ALT活性测定按照试剂盒说明书测定,NO
含量采用Griess法测定。
2.3 数据处理与统计分析 实验结果用珚x±s表示,
使用SPSS12.0软件包进行方差分析。
3 结果
  类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上
清液AST、ALT活性及NO含量的影响见图1~3。
3.1 对AST和ALT活性的影响 BCG联合LPS
造成大鼠原代肝细胞损伤后,其肝细胞培养上清液中
的AST和ALT水平明显高于正常组,且随时间的
延长逐步升高。类叶升麻苷各剂量组在3h均能显
著降低ALT,高剂量组在3h可显著降低AST,并与
低剂量组间存在显著差异(P<0.01),在6,12和24
h均可使升高的AST和ALT明显下降,且呈剂量依
赖关系。此外从图1和图2中还可看出,中、低剂量
类叶升麻苷的活性与等剂量DDB的活性相似。
3.2 对NO含量的影响 与正常组相比较,模型组
大鼠肝细胞上清液NO的含量随时间的延长而逐步
升高,在12h达到最高水平(P<0.01)。阳性对照药
物DDB,除3h低剂量组外,在各时间点均可显著降
低NO含量,且6,12和24h各剂量组间存在显著的
剂量反应关系(P<0.01,P<0.05)。类叶升麻苷各
剂量组在6,12和24h均可不同程度地使升高的NO
含量下降(P<0.01,P<0.05)。此外,在药物干预3
h时,类叶升麻苷的高剂量组可显著降低NO含量,
并与低剂量组间存在统计学意义(P<0.01)。
图1 类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液
AST水平的影响
注:与空白对照组相比较a)P<0.01;与模型组相比较 b)P<0.01;
与同组低剂量组相比较c)P<0.01,d)P<0.05
Fig.1Effect of acteoside on supernatant AST levels in immuno-
logic injury in primary cultured rat hepatocytes
note:a)P<0.01vs control;b)P<0.01vs BCG+LPS;c)P<0.01,
d)P<0.05vs low dose same group
图2 类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液
ALT水平的影响
注:与空白对照组相比较a)P<0.01;与模型组相比较b)P<0.01,
c)P<0.05;与同组低剂量组相比较d)P<0.01,e)P<0.05
Fig.2Effect of acteoside on supernatant ALT levels in immuno-
logic injury in primary cultured rat hepatocytes
note:a)P<0.01vs control;b)P<0.01,c)P<0.05vs BCG+
LPS;d)P<0.01,e)P<0.05vs low dose same group
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图3 类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液
NO水平的影响
注:与空白对照组相比较a)P<0.01;与模型组相比较b)P<0.01,
c)P<0.05;与低剂量组相比较d)P<0.01,e)P<0.05
Fig.3Effect of acteoside on supernatant NO content in immuno-
logic injury in primary cultured rat hepatocytes
note:a)P<0.01vs control;b)P<0.01,c)P<0.05vs BCG+
LPS;d)P<0.01,e)P<0.05vs low dose same group
4 讨论
  近年来,采用BCG联合LPS诱导大鼠原代肝细
胞产生免疫性肝损伤模型已成为筛选和研究抗肝炎
药物的常用方法之一。该模型的损伤机制为BCG首
先激活致敏T淋巴细胞,尤其是致敏肝内枯否氏细
胞和巨噬细胞,并大量聚集于肝脏。当用LPS进一
步刺激激活处于致敏状态的巨噬细胞后,大量细胞毒
性因子被释放出来,如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子
(TNF)和白细胞介素等,造成肝细胞损害[5]。肝脏
是富含酶的脏器,在肝内ALT和AST主要分布于
细胞浆和线粒体中。在肝脏组织受损时,酶从细胞内
逸出进入血液,致使血清中ALT和AST增高。因
此,肝组织AST、ALT活性下降及血清AST、ALT
活性升高为肝功能受损的特异性指标。本实验结果显
示,类叶升麻苷在6,12和24h均可不同程度地使升
高的AST和ALT活性降低,说明该成分对免疫性
肝损伤具有较好的降酶作用,且与阳性对照药物
DDB的作用类似。作为一种自由基,NO的过度产生
也可直接导致机体正常组织的损伤。肝巨噬细胞可
通过释放NO对肝细胞产生毒性,且肝细胞在体外也
可经特异性细胞因子及LPS协同诱导,持续产生大
量的NO,介导多种病理生理效应,包括肝细胞毒性
效应[6]。类叶升麻苷在不同的时间点均可使升高的
NO水平降低,且这种作用呈一定的浓度依赖关系。
此结果提示类叶升麻苷可能通过抑制肝细胞释放
NO的通路,降低肝细胞受损伤程度,进而抑制AST
和ALT的活性,显示出较好的保肝降酶作用。
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(收稿日期:2012-11-02)
石榴皮多酚对人前列腺癌PC-3细胞增殖及凋亡的影响
王春梅,马桂芝,高晓黎*,王晓然(新疆医科大学药学院,乌鲁木齐830011)
摘要:目的 探讨石榴皮多酚对前列腺癌PC-3细胞株增殖和凋亡的影响。方法 采用MTT法测定不同质量浓度组石榴皮多
酚作用不同时间对PC-3细胞生长的影响,应用流式细胞仪检测石榴皮多酚作用72h后PC-3细胞的周期时相变化及凋亡情况。
结果 石榴皮多酚明显抑制PC-3细胞的生长,抑制效应呈时间依赖型和浓度依赖型。流式细胞仪检测结果显示,石榴皮多酚可
将PC-3细胞阻滞于G1期,并诱导PC-3细胞凋亡。结论 石榴皮多酚在体外对前列腺癌PC-3细胞株有明显的生长抑制和诱
导凋亡的作用。
关键词:石榴皮多酚;前列腺癌细胞;MTT;细胞凋亡;周期
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2013.03.019
中图分类号:R965   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2013)03-0271-04
基金项目:新疆维吾尔自治区科技厅科技支撑计划项目(编号:201233135)
作者简介:王春梅,女,硕士研究生
*通信作者:高晓黎,女,教授,博士研究生导师
172西北药学杂志 2013年5月 第28卷 第3期