全 文 ：收稿日期:2009-02-21
1)基金项目:黄山市自然科学重点项目[黄综字(2007)134号]
柳叶蜡梅叶片愈伤组织诱导实验研究1)
胡长玉 ,张霄雯
(黄山学院生命与环境科学学院 , 安徽 屯溪 245041)
摘　要:以不同方式处理柳叶蜡梅种子 ,观察其在 MS 培养基上萌发和生长的状况。结果显示:98%浓
硫酸处理的种子发芽率达 32%,其它处理萌发率低。以种子无菌苗叶为外植体 ,接种于 2 , 4-D 、NAA 、6-
BA组合不同浓度生长调节剂的 MS 固体培养基上 ,进行愈伤组织诱导实验;外植体愈伤组织诱导培养
基MS+NAA 0.3mg ·L-1 +6-BA 1.0mg ·L-1的诱导率为 80%,生长稳定可分化出苗。
关键词:柳叶蜡梅;种子处理;生长调节物质;愈伤组织培养
Induction of Callus from the Leaf of Chimonanthus salici folius
Hu Changyu ,Zhang Xiaowen
(College of Life and Environmental Sciences , HuangshanUniversity , Tunxi Anhui 245041 )
Abstract:Seeds of Chimonanthus salici f olius by different t reatments w ere cultured on solid MS medium.
Result s showed that t he germination rate reached 32%after t he seeds were soaked in 98% sulfuric acid
and the other t reatment s had a low termination rate.Explants from the aseptic leaves were incubated on
solid MS medium supplemented with 2 , 4-D , NAA , 6-BA or diff erent combinations of these plant g rowth
regulators t o induce callus.The formula of MS+NAA 0.3mg ·L-1 +6-BA 1.0mg ·L-1 had the bes t re-
sult , with the induction rate of 80% and plant lets were dif ferentiat ed afterwards.
Key words:Chimonanthus salici f o lius;T reatment s on the seeds;P lant grow th regulato r;Tissue culture
　　中国植物志(1979)记录柳叶蜡梅为中国特有种 ,
是一种半常绿灌木 ,生长于海拔 100 ～ 400m 阳坡的路
旁或林缘 ,喜石灰质土 ,在一般土壤上亦可生长。其鲜
叶可按茶叶工艺制作“炒青” 、“烘青”干品;用沸水冲
泡 ,清香扑鼻 , 饮用香中带甜 , 风味独特;程文亮等
(2008)报道柳叶蜡梅种子繁殖率低 ,其药用价值和商
业价值正倍受重视;但其组织培养和快速繁殖未见报
道 ,我们以不同方式处理柳叶蜡梅种子 ,观察 MS 培养
基培养下 ,柳叶蜡梅种子萌发和幼苗生长的状况。同时
通过采用不同生长调节物质对柳叶蜡梅外植体进行诱
导愈伤组织效应的研究 ,探讨诱导愈伤组织分化成苗的
最优组合和条件。为生产和人工种植提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料的鉴定
实验材料于 2006年 11 月采于黄山市黟县艾山村 ,
经黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定为
柳叶蜡梅(Chimonanthussalici f olius S.Y.Hu)种子。
1.2　主要仪器与试剂
岛津电子天平 、电热鼓风干燥箱 、超净工作台 、
GZP-256 型光照培养箱 、高压灭菌锅 、数显恒温水浴锅
;浓硫酸(98%)、赤霉素 、氨水 、升汞(0.1%)、乙醇
(75%)吐温-80 均为国产分析纯或化学纯。
1.3　种子处理
参考秦淑英等(2001),郑艳玲等(2008)处理种子
方法 ,用MS 培养基培养种子。
1.3.1 　温水浸种:种子用温水浸种 ,始温控制在约 59
～ 61℃,24h 换水 1 次 ,浸种 72h。
1.3.2 　浓硫酸处理:种子用 98%浓硫酸浸泡 40 ～
50min后 ,用流水洗净。
1.3.3　氨水处理:种子用温水浸种 ,始温 60℃,后控
制在 40℃,加入质量分数(1∶50)氨水后搅动数分钟 ,
后每隔 3 ～ 4h 搅动 1次。24h 后捞出 ,用流水洗净。
1.3.4　赤霉素处理:用 40 ～ 60℃的热水浸种约 30min
后 ,将种子捞出置于 0.02%的赤霉素溶液中浸泡 24h ,
24h后捞出晾干。
将上述种子无菌水冲洗 3 ～ 4 次 , 70%酒精中浸
10s ,无菌水冲洗 ,接种于琼脂 6 g/L 培养基上 , pH 5.4
～ 5.8。接种时注意种子的种脐要接触到培养基。
1.4　愈伤组织诱导
分别采用了 2 , 4-D 、6-BA 、NAA 及其组合的植物
生长调节物质[ 6-7] 。观察采用不同的生长调节物质对
柳叶蜡梅叶外植体愈伤组织形成的影响。比较愈伤组
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第 4期(总第 101) 中 国 林 副 特 产 No.4(GSNO.101)
2009年 8月 Fo rest By-Product and Speciali ty in China Aug.2009
DOI :10.13268/j.cnki.fbsic.2009.04.018
织的诱导率及生长情况。
1.5　试管苗生根与移栽　
当幼苗长至 2 ～ 4 cm 、带有 6 ～ 8 个叶片时 ,将其沿
茎基部剪断接入培养基 1/2MS +NAA 0.1mg/L +
1.5%蔗糖 ,进行生根培养。试管苗在培养基上培养
30d左右 ,从小苗基部切口处产生 2 ～ 3 条根 ,根长达
1cm左右 ,生根率 70%以上。这些苗可进行移栽。幼
苗移栽前 ,先打开瓶塞 ,置于室温下锻炼 7d ,以培养基
不染菌为宜。洗去根部的琼脂 ,移入事先消过毒的珍
珠岩蛭石苗床上 ,移栽后 7d内进行 50%～ 70%遮荫。
控制温度在 25℃左右 ,湿度在 85%左右。20d 后 ,逐渐
移去塑料薄膜 ,成活率达 85%以上。
2　结果与分析
通过将种子无菌处理接种于 MS 培养基 ,置培养
室中培养 ,温度控制 22±1℃,第 1 个月避光培养 ,第 2
个月白天正常光照 ,晚上避光 ,经 2 个月培养后观察。
结果见表 1。
表 1　柳叶蜡梅种子处理
处理方法 种子数 培养基 出芽数 出芽率/ %
温水处理 50 MS 1 2
98%浓硫酸处理 50 MS 16 32
氨水(1∶50)处理 50 MS 1 2
0.02%赤霉素处理 50 MS 2 4
　　取生长良好 ,植株健壮颜色深绿 ,无营养不良情况
产生的叶片 ,在超净台上 ,将柳叶蜡梅无菌苗的叶片剪
成 0.5cm ×0.5cm的小块 ,分别接种于附加不同配比
激素的MS 固体培养基上 ,放置于培养室内。接种时
叶片为平接 ,接触到培养基上。接种时要注意切割外
植体叶片时 ,刀片和镊子在酒精灯上灭菌后要等冷却
了再接触外植体材料 ,否则会烫伤外植体 ,使伤口坏
死 ,无法产生愈伤组织。光照强度为 50～ 60mmol/m2 ·s ,
光照时间 16h/d;45d后统计愈伤组织诱导数量并计算
诱导率。
诱导率=(形成愈伤组织的外植体数/总接种成活
外植体的块数)×100%。
表 2 不同激素对叶片愈伤组织形成的影响
培养基
编号
激素组合/mg· L -1
NAA　2 , 4-D　6-BA
接种
块数
接种成
活数
形成愈伤
组织块数
诱导率
/ %
1 — 0.3 1.0 10 5 4 80
2 — 0.5 1.0 10 7 2 28.6
3 — 1.0 1.0 10 0 0 0
4 — 2.0 1.0 10 0 0 0
5 — 3.0 1.0 10 0 0 0
6 0.3 — 1.0 10 5 4 80
7 0.5 — 1.0 10 5 3 60
8 1.0 — 1.0 10 7 4 57.1
9 2.0 — 1.0 10 6 2 33.3
10 4.0 — 1.0 10 6 1 16.7
　　表 2中 MS+NAA0.3mg/L+6-BA1.0mg/L培养
基效果明显 ,在叶片平接于培养基 15 ～ 20d后 ,外植体
周缘膨大 ,表面出现绿白色腐状物 ,随后白色逐渐变成
灰褐色再到绿色 , 30d 后 ,可观察到芽丝的出现;约 40
～ 45d后 ,每个外植体上可形成 2 ～ 5 个株芽;出现大
量愈伤组织 ,愈伤组织呈淡绿色 、颗粒状;在 MS+2 , 4-
D 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基上也出现少量呈
淡绿色 、颗粒状的愈伤组织 ,生长较缓慢;其它培养基
中 ,叶片颜色逐渐变淡 ,发黄 ,最后死亡 ,没有愈伤组织
产生。
3　讨论
柳叶蜡梅种子种皮致密坚硬 ,透水性差 ,阻碍了种
子对水分的吸收 ,同时坚硬的种皮对种子萌发时胚根
的伸展具有一定的机械阻力 ,使柳叶蜡梅种子不易萌
发 ,经过 98%浓硫酸处理使种子的种皮被酸腐蚀 ,有
利于种子吸水萌发 ,此外 MS 培养基有足够的外源营
养物质供应 ,同时培养室中环境条件适宜 ,种胚生长条
件优越 ,有利于其发芽生长。
在柳叶蜡梅愈伤组织诱导过程中 , NAA 对愈伤
组织的诱导效果好 , NAA 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L
组合诱导形成的愈伤组织生长势好 ,而 2 , 4-D 0.3mg/
L+6-BA 1.0mg/L 组合诱导形成的叶的愈伤组织较
好。柳叶蜡梅的愈伤组织形成 MS+NAA 0.3mg/L+
6-BA 1.0mg/L诱导较适宜。一般来说 ,植物细胞在离
体条件下 ,外源激素对愈伤组织的形成是必不可少的。
不同的外源生长调节物质对外植体的作用是不同的;
从诱导率来看 ,相同浓度时 , NAA 作用效果比 2 , 4-D
作用效果好 ,当 2 , 4-D 与 6-BA 同时使用时 , 2 , 4-D 的
浓度越高 ,越抑制愈伤组织的形成 ,在 2 , 4-D 浓度为
0.3mg/L时 ,愈伤组织形成较好 ,但是生长缓慢 , 当
2 , 4-D浓度大于 1.0mg/L 时 ,抑制外植体产生愈伤组
织。可能是因为高浓度的 2 , 4-D会诱导愈伤组织内多
酚氧化酶活性升高 ,导致愈伤组织褐化 ,从诱导率方面
来看 ,在不同浓度的 NAA 中 ,以 0.3mg/L的出愈率最
高 ,为 80%;NAA 对柳叶蜡梅外植体的诱导作用较
强。
参 考 文 献
[ 1] 　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[ M ] .
30 卷.2分册.北京:科学出版社 , 1979:1-10.
[ 2] 　程文亮 , 华金渭.柳叶蜡梅扦插繁殖研究[ J] .中国中
药杂志 , 2008 , 33(2):451-454.
[ 3] 　秦淑英 ,唐秀光 ,王文全 , 等.药用植物种子处理研究概
况[ J] .种子 , 2001 , 11(4):37-39.
[ 4] 　郑艳玲 , 孙卫邦 , 赵兴峰.极度濒危植物华盖木的种子
休眠与萌发[ J] .植物生理学通讯 , 2008 , 44(1):100-
102.
[ 5] 　张志良 , 瞿伟菁.植物生理学实验指导[ M] .北京:高等
教育出版社 , 2003.
[ 6] 　潘瑞炽 ,王小菁 , 李娘辉.植物生理学[ M] .6 版.北京:
高等教育出版社 , 2008:167-188.
[ 7] 　马国华 , 胡玉姬 , 许秋生.檀香的组织培养与快速繁殖
[ J] .植物生理学通讯 , 2008 , 44(2):296.
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2009年 中　国　林　副　特　产 第 4期