全 文 ：猫儿屎内生真菌分离鉴定及抑菌活性研究
王鹏飞1， 马养民1,2， 孔 阳3
(1.陕西科技大学化学与化工学院/教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西 西安 710021；
2.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021；3.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021）
摘 要：以新鲜猫儿屎为材料，采用组织分离法从其茎、叶、果实中分离内生真菌，采用形态学方法进行初步鉴定；采用滤纸片
法测定猫儿屎内生真菌次生代谢产物的抑菌活性。 从猫儿屎的茎、叶和果实中共分离出 91 株内生真菌，分别属于 6 目 7 科 15 属；
曲霉属为优势种属，占总量的 32%；91 株内生真菌具有不同程度的抑菌活性，菌种 DS37、DS58、DL06 和 DL14 的抑菌活性较强。 结
果表明，猫儿屎内生真菌种类具有多样性，次生代谢产物具有广泛的抑菌活性。
关键词：猫儿屎； 内生真菌； 抑菌活性
中图分类号：S567.19 文献标识码：A 文章编号：1004－874X（2013）13－0085-03
Isolation, identification and antimicrobial activities of endophytic
fungi from Decaisnea fargesii Franch.
WANG Peng-fei1， MA Yang-min1,2， KONG Yang3
(1.College of Chemistry ＆ Chemical Engineering, Shaanxi University of Science ＆ Technology/Key Laboratory of
Auxiliary Chemistry ＆ Technology for Chemical Industry，Ministry of Education, Xian 710021, China;
2. Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology, Xian 710021, China;
3. College of Life Science & Engineering, Shaanxi University of Science ＆ Technology, Xian 710021, China)
Abstract: Endophytic fungi were isolated from the stem, leaf and fruit of Decaisnea fargesii Franch., and then morphologically
identified; the antimicrobial activities were screened by paper sheet method. 91 strains of endophytic fungi were isolated from Decaisnea
fargesii Franch., they were identified as 6 orders, 7 families, 15 genus. Aspergillus was the dominant species, accounting for 32 % of the
total. Almost 91 strains presented antimicrobial activities, DS37, DS58, DL06 and DL14 has a strong antimicrobial activity. Endophytic
fungi exist in Decaisnea fargesii Franch. have a variety of species, their secondary metabolites with a wide range of antimicrobial activity.
Key words: Decaisnea fargesii Franch.; Endophytic Fungi; atibacterial ativity
内生真菌(Endophytic Fungi)是指生活史中的某一段时
期生活在植物组织内， 对植物组织没有引起明显病害症状
的菌， 同时还包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生
的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌[1]。
内生真菌可通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中
分离或从植物组织内直接扩增出微生物 DNA的方法来证
明其内生，是生活在植物组织内的一类微生物[2]。 据文献记
载，内生真菌与植物长期互惠共生，因此可能产生与宿主相
同或者相似的次生代谢产物， 这些次生代谢产物可能具有
多种生物活性，是新的筛选抑菌活性物质的潜在资源[3-5] 。
近年来国内外对内生真菌的研究主要集中在逆境生
长植物和药用植物内生真菌上。 猫儿屎（Decaisnea fargesii
Franch.）为木通科猫儿屎属植物，分布于我国西南部和中
部以及东喜马拉雅山脉地区，具有治疗肺痨咳嗽、风湿关
节痛以及清热解毒作用[6]。 目前国内外对猫儿屎的研究主
要集中在植物化学成分上，猫儿屎内生真菌的研究尚未见
报道。 本试验主要对猫儿屎内生真菌进行分离，并对其次
生代谢产物抑菌活性进行初步研究，旨在筛选出能够产生
较强抑菌活性物质的菌株，为进一步发掘猫儿屎内生真菌
抑菌活性物质和猫儿屎的综合开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
猫儿屎（Decaisnea fargesii Franch.）于 2012 年 8 月采
自秦岭太白山地区，以其茎、叶和果实作为研究对象。
内生真菌的分离和纯化采用马铃薯葡萄糖培养基（PDA
培养基）；发酵过程采用察氏培养基（Czapek培养基）；活性测
试过程真菌采用 PDA，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。
细菌 ： 大肠杆菌 （Enterococcus coli）、 绿脓杆菌
（Pseudomonas aeruginosa）、 枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillus
subtilis）、金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、纳豆芽孢
杆菌（Bacillus natto）、乳链球菌（Streptococcus agalactiae）；
真菌：烟草霜霉病菌（Peronospora tabacina Adam.）、苹果树
腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、尖孢镰孢菌（Fusarium
oxysporium）、 白菜黑斑病菌 〔Alternaria brassicae（Berk.）
Sace.〕、 蕃茄灰霉病菌 （Botrytis cirerea）、 小麦赤霉病菌
（Gibberella saubinerii）。 以上菌种均由中国科学院陕西省
微生物研究所提供。
1.2 仪器与试剂
葡萄糖（分析纯，天津市津北精细化工有限公司）；琼
脂粉，牛肉膏和蛋白胨（生化试剂，北京奥博星生物技术有
限责任公司）。 SW-CJ-1FD 超净工作台（上海博迅实业有
限公司医疗设备厂）；YX280B 手提式压力蒸汽灭菌锅（上
海三申医疗器械有限公司）；DH5000B 电热恒温培养箱
收稿日期：2013-04-19
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20116125110001）；
陕西省自然科学基金（2010JM2005）
作者简介：王鹏飞（1988-），男，在读硕士生，E-mail：wpf1230@
tom.com
通讯作者：马养民（1963-），男，博士，教授，E-mail：mym63@sina.
com
广东农业科学 2013 年第 13 期 85
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.13.036
图 1 4株内生真菌抑菌效果
A B C D
果实
0
0
0
0
1
0
2
0
1
0
3
0
0
0
1
叶
1
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3
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1
2
1
1
5
2
0
4
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茎
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8
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5
0
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0
21
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2
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占比
（%）
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9
1
13
1
2
9
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8
1
32
3
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7
7
总数
2
8
1
12
1
2
8
4
7
1
29
3
1
6
6
属
Clavispora sp.
Nectria sp.
Tubercularia sp.
Oidium sp.
Aternana sp
Trichothecium sp.
Oidiopsis sp.
Botrytis sp.
Tolyposporium sp.
Guignardia sp.
Aspergillus sp.
Alternaria sp.
Rhizoctonia sp.
Penicilliopsis sp.
Penicillium sp.
表 1 猫儿屎内生真菌分布（天津市泰斯特仪器有限公司）；电子天平〔赛多利斯科学
仪器（北京）有限公司〕。
1.3 试验方法
1.3.1 内生真菌的分离 取健康猫儿屎植株的茎、叶和果
实，用自来水将表面清洗干净，晾干，于无菌条件下将植物
组织先于灭菌水中清洗， 然后用 75%乙醇浸泡 2 min，用
无菌水冲洗干净后用有效氯含量为 2 %的次氯酸钠溶液
浸泡 1 min，随后再用 75%乙醇清洗 1 min，最后用灭菌水
清洗，滤纸吸干植物组织表面水分备用。 将植物组织制成
大小约为 1 cm×1 cm 的切片， 将切片接入新鲜的 PDA培
养基中，置于 28℃培养箱中培养 3～5 d。 待切口处长出菌
丝后，立即转接至新鲜的 PDA培养基中[7]。
1.3.2 内生真菌的初步鉴定 根据内生真菌的菌落形态特
征，包括菌落大小、颜色、表面特征、基质特征等，以及个体形
态特征，包括菌丝、子实和孢子形态，对其进行分类鉴定[8-9]。
1.3.3 次生代谢产物的提取 无菌条件下将内生真菌打成
6 mm的菌饼，接种于 600 mL察氏液体培养基中，于 28℃，
120 r/min的摇床中培养 10 d。 过滤菌丝体，滤液用乙酸乙
酯萃取 3次，将菌丝体晾干后粉碎，用乙酸乙酯提取 3 次。
将发酵液的萃取液和菌丝体的提取液合并， 浓缩蒸干，分
别取 100 mg提取物溶解于 3 mL乙酸乙酯中备用。
1.3.4 抑菌试验 滤纸片法：将无菌滤纸片（直径 6 mm）
浸泡于上述次生代谢产物溶液中 1 d， 使其充分饱和，取
出，晾干，置于含测试菌的培养皿中进行观察，其中细菌测
试菌采用牛肉膏蛋白冻培养基于 37℃培养 24 h 后观察，
真菌测试菌采用 PDA 培养基于 28℃培养 48 h 后观察，3
次重复，记录抑菌圈大小。 含测试菌的平板培养基制法如
下：无菌条件下，将斜面培养的测试菌用少量无菌水冲洗
数次，得到较浓菌悬液，用血细胞计数板进行观察，最终用
无菌水将浓度稀释到约为 106 CFU/mL。 将上述菌悬液加
入 30～40℃适量的相应抑菌试验培养基中， 混合均匀，迅
速倒入培养皿中备用。
2 结果与分析
2.1 内生真菌的分离及其形态学初步鉴定
从猫儿屎的茎、 叶和果实中， 共分离得到内生真菌 91
株。 其中，从茎部分离到 61株、占 67.0 %，从叶部分离到 22
株、占 24.2%，从果实部分分离到 8株、占 8.8%。 从对内生真
菌的鉴定可以看出，内生真菌主要集中在茎部，其中曲霉属
（Aspergillus sp.）占 32 %，粉孢霉属(Oidium sp.)占 13%，曲霉
属为优势菌属，内生真菌的分布情况如表 1所示。
2.2 猫儿屎内生真菌次生代谢产物的抑菌活性
如表 2所示，以 6种细菌为测试菌，对 91 株内生真菌
次生代谢产物进行抑菌活性试验，结果发现 36株内生真菌
代谢产物对至少 5种细菌具有良好的抑制作用 （直径> 10
mm），占总数的 39.56 %，同时又以 6种植物病原真菌为测试
菌， 对 91株内生真菌次生代谢产物进行抑菌活性试验，发
现 47株内生真菌代谢产物对至少一种植物病原真菌具有
抑制作用（直径>10 mm），占总数的 51.65 %。 抑菌活性最为
显著的菌株是 DS37、DS58、DL06和 DL14，其次生代谢产物
至少对 12种测试菌的抑菌圈直径在 16 mm以上，这 4株内
生真菌次生代谢产物对部分细菌的抑菌效果见图 1所示。
3 结语
猫儿屎内生真菌种类具有多样性，其次生代谢产物对
植物病原真菌及细菌的生长有不同程度的抑制作用，其
中真菌 DS37、DS58、DL06 和 DL14 对植物病原真菌及细
菌生长均表现出较强的抑制作用。 通过对猫儿屎内生真
菌抑菌活性的研究， 为后续的内生真菌次生代谢产物化
学成分及植物抗病虫害研究提供必要的依据。
参考文献：
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表 2 内生真菌次生代谢产物抑菌活性筛选结果
抑菌活性
注： A为烟草霜霉病菌；B 为尖孢镰孢菌；C 为苹果腐烂菌；D为番茄灰霉病菌；E 为小麦赤霉病菌；F 为白菜黑斑病菌；G 为纳豆芽孢杆菌；H 为枯
草芽孢杆菌；I为乳链球菌；J 为金黄色葡萄球菌; K为绿脓杆菌；L 为大肠杆菌。 “–”表示无活性；“+”表示活性较弱；“++”表示活性中等；“+++”表示活
性好；“++++”表示活性强。
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