全 文 ：第 39卷第 2期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.2
2 0 1 0年 4月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Apr., 2 0 1 0
野木瓜注射液对体外缺血清缺氧培养的
小鼠脊髓神经细胞生长的影响
张秀璋 , 叶文博＊ , 周丽娜
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:分离小鼠脊髓神经细胞进行原代培养 ,通过缺血清缺氧培养建立神经细胞损伤模型.
受损的神经细胞中加入野木瓜注射液 ,利用 MTT法测定神经细胞的活性 ,用倒置相差显微镜
进行显微观察和测量.结果表明:浓度较高 500 mg/L时 ,野木瓜注射液对细胞有伤害作用 ,在
50 ～ 300 mg/L浓度范围内 ,能提高缺血清缺氧神经细胞的细胞活性 ,使细胞数和突起数增加 ,
胞体直径增长 ,浓度为 100mg/L时效果最明显.
关键词:小鼠;野木瓜注射液;脊髓神经细胞;缺血清缺氧培养
中图分类号:Q954.6, R931.7　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)02-0189-05
　　　　　　　　　　
收稿日期:2009-09-28
基金项目:上海师范大学科研项目(SK200715).
作者简介:张秀璋(1982-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;叶文博(1951-),男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院教授.
＊通讯作者.
0　引　言
野木瓜(StauntoniachinesisDC)是木通科野木瓜属植物 ,含齐墩果酸 、总糖 、黄酮 、皂甙等物质 ,是一
种常用中药 [ 1, 2] .野木瓜注射液(InjectionsStauntonia, IS)由野木瓜提炼精制而成 ,主要用于穴位注射治
疗坐骨神经痛 、枕大神经痛 ,颈椎痛和风湿关节痛等 [ 3, 4] .IS在脊髓水平上有一定程度的抑制外周伤害
性的传人 ,降低神经元的兴奋性的作用[ 5] .其中的皂甙类物质能阻滞神经传导 ,并对神经髓鞘和轴突膜
有一定的作用[ 5, 7] .大量文献记录和临床应用表明 IS可以减轻病症或使疾病痊愈.本实验旨在研究 IS
对受损脊髓神经细胞的修复是否存在积极的影响.
1　材料和方法
1.1　试剂与动物
野木瓜注射液(每 2 mL相当于生药 5 g,批号 000408)购自广东和平制药厂;台盼蓝 ,多聚赖氨酸
(PLL)和阿糖胞苷购自 SIGMA公司;Hanks液 , DMEM/F12培养液(含 HEPES缓冲液 ,谷氨酰胺)和胰
蛋白酶(1∶250)购自 GIBCO公司;新生胎牛血清由杭州四季青生物制品有限公司生产;新生昆明小鼠购
自复旦大学医学院实验动物中心.
1.2　小鼠脊髓神经细胞的取得和体外培养[ 8-11]
新生 1d昆明小鼠断颈后浸入 75%酒精 1min,无菌条件下取出小鼠脊髓神经 ,剪成 1 mm3颗粒 ,置
0.25%胰蛋白酶溶液中 , 37℃消化 15min, 常规终止消化 , 1000rpm离心 5 min弃上清 , 用含 20%胎
牛血清的 DMEM/F12培养液重悬 , 反复吹打制成单细胞悬液.调整细胞浓度到 4.0 ×107个 /mL, 台盼
　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
蓝染色计数活细胞在 95%以上 , 接种到事先用 0.1 g/L赖氨酸包被的 24孔板中 , 每孔加细胞悬液
5×10-4 L,置 37 ℃, 5% CO2培养箱中静置培养.培养 3d换液 ,同时加入 5×10-6 mol/L的阿糖胞苷以
抑制非神经元的生长.每隔 3 d换一次新鲜的培养液.
1.3　缺血清缺氧组损伤模型(神经细胞凋亡模型)的建立及实验分组[ 12, 13]
建立缺血清缺氧模型(SODM):取培养 6 d的神经细胞 ,吸去培养液 ,换上无血清的 DMEM/F12培
养液 ,用石蜡油封闭各孔造成缺氧条件 ,继续培养 4 d.
实验分 7组 ,如下:(1)正常对照组(C):培养 6 d的神经细胞 ,换上含 10%血清的 DMEM/F12培养
液 ,继续培养 4d;(2)缺血清缺氧模型组(SODM);(3)缺血清缺氧 IS50 mg/L组(SODM+IS50mg/L
组):在缺血清缺氧培养的同时加入 IS,终浓度为 50 mg/L;(4)缺血清缺氧 IS100 mg/L组(SODM+IS
100mg/L组):在缺血清缺氧培养的同时加入 IS,终浓度为 100 mg/L;(5)缺血清缺氧 IS200 mg/L组
(SODM+IS200mg/L组):在缺血清缺氧培养的同时加入 IS,终浓度为 200 mg/L;(6)缺血清缺氧 IS
300mg/L组(SODM+IS300mg/L组):在缺血清缺氧培养的同时加入 IS, 终浓度为 300 mg/L;(7)缺
血清缺氧 IS500 mg/L组 (SODM+IS500 mg/L组):在缺血清缺氧培养的同时加入 IS, 终浓度为
500mg/L.上述实验内容分别重复 6 ～ 9次.
1.4　活细胞观测 [ 13, 14]
取培养于 24孔板中的细胞 ,在倒置相差显微镜(×200)下观测 ,胞体饱满 ,光晕明显 ,突起均匀光
滑的细胞认为是活细胞;胞体肿胀或皱缩 ,形状不规则 ,空泡化 ,突起断裂呈串珠样认为是受损或死亡的
细胞.每实验组随机观察 30个视野 ,对存活的细胞进行计数 ,并计算求得每孔的细胞数量.
1.5　细胞生长发育状况的测量 [ 13]
在倒置相差显微镜下每组随机选 30个细胞 ,测量其胞体平均直径 ,即测量胞体长径和长径中点垂
直径 ,计算两者之和 ,求其平均数 ,以示胞体发育状况.计算每个细胞的突起数 ,以示细胞突起发育状况.
1.6　MTT法测定神经细胞存活率[ 14, 15]
神经细胞培养于 96孔板中 , 给药后再培养 4 d.然后 , 每孔加 2×10-5 LMTT溶液(终浓度
5 mg/mL), 37 ℃下培养 4 h,再加入 1×10-4 molDMSO,震荡 5 min使结晶完全溶解.用微孔酶标仪在
570nm处测定吸光值(OD值).
1.7　统计学处理
本次实验内容分别重复 6 ～ 9次 ,表 1和图 2中使用的 n都代表实验的次数.每次实验的平均值作
为统计的一个样本值.统计采用 SPSS13.0软件的单因素设计的方差分析 (one-wayANOVA),各组间的
比较采用 LSD法.
2　结　果
2.1　形态学观察
细胞接种后 ,分散良好 ,细胞呈圆形 ,胞体饱满 ,遮光性好.细胞接种 4 h后 ,开始有部分细胞贴壁 ,
在培养 24 h后 ,绝大多数细胞贴壁.贴壁细胞多为圆形或椭圆形 ,有少数细胞长出突起.培养 2 d后 ,贴
壁细胞多数呈分散生长 ,所有神经细胞都长出突起.培养 3 ～ 7 d后 ,神经细胞突起分支增多 ,根据其突
起分支数量 ,分为单极 、双极和多极神经细胞 ,以双极神经细胞居多.细胞突起增长 ,有的细胞突起相互
连接 ,神经细胞胞体呈圆形或椭圆形及多边形不等.培养 7 ～ 10d,神经细胞胞体大且饱满 ,光晕明显.神
经突起增粗并进一步延长.多极细胞的数量逐渐增多.培养 10 d后 ,神经细胞开始有减少并退化迹象 ,
表现为细胞体积缩小或者体积膨大 ,胞浆内出现大小不等的空泡 ,突起减少并萎缩.14 d后凋亡细胞变
多 ,细胞连接稀疏 ,大量脱落 ,漂浮死亡.
2.1.1　缺血清缺氧对细胞存活的影响
正常对照组细胞胞体饱满 ,遮光性强 ,突起较多 ,相互连接成网状 ,见图 1A.缺血清缺氧组的细胞透
190
　第 2期 张秀璋 , 叶文博 , 周丽娜:野木瓜注射液对体外缺血清缺氧培养的小鼠脊髓神经细胞生长的影响 　　
光率下降 ,胞体皱缩成球形 ,或胞体肿胀膨大 ,突起断裂 ,网络消失 ,细胞集落数减少 ,不少细胞破裂死
亡 ,贴壁性下降 ,并出现悬浮死细胞 ,见图 1B.
图 1　倒置相差显微镜下观察到的 IS对神经细胞生长影响
2.1.2　IS对小鼠脊髓神经细胞生长的影响培养
经过缺血清缺氧培养的神经细胞活性极度降低 ,而 SODM+IS组在 50 ～ 300 mg/L浓度范围内 ,细
胞生长状态明显好于 SODM组 ,尤其是 100 mg/L浓度时效果最好 ,细胞突起增多 ,长度增长 ,胞体大而
饱满 ,见图 1中的 C, D, E, F.而缺血清缺氧组的细胞加入 IS的为浓度 500mg/L时细胞损伤更严重 ,细
胞数目 ,突起数都减少 ,胞体皱缩成团 ,突起变得跟短 ,或者断裂 ,见图 1G.细胞在培养 10 d时进行显微
测量 ,所得的三类数据分别进行方差分析 ,各组细胞数的 F=111.619, P<0.01;各组胞体直径的 F=
18.521, P<0.01;各组的突起数的 F=154.324, P<0.01.SODM效果明显 ,模型中每孔细胞数减少 、胞
体直径减小和每个细胞的突起数减少 ,同正常对照相比有极显著的差异.IS在 50 ～ 300mg/L范围内 ,能
改善由于缺血清缺氧引起的这些变化 ,差异也是极显著的(表 1).
表 1　IS引起的缺血清缺氧神经细胞数量和形态的变化 　
组别 细胞数(孔) 胞体直径(μm) 突起数 /细胞
正常对照 37.81±2.69☆(n=8) 16.18±0.90☆(n=5) 2.80±0.10☆(n=8)
SODM 15.60±1.87＊(n=7) 8.95±0.98＊(n=5) 1.57±0.11＊(n=8)
SODM+IS50mg/L 25.41±1.32＊☆(n=8) 12.48±1.31＊☆(n=7) 2.32±0.16＊☆(n=7)
SODM+IS100mg/L 32.58±2.30＊☆(n=8) 14.59±2.65☆(n=5) 2.67±0.06#☆(n=6)
SODM+IS200mg/L 27.38±1.98＊☆(n=7) 12.68±1.68＊☆(n=5) 2.23±0.07＊☆(n=5)
SODM+IS300mg/L 25.74±3.51＊☆(n=7) 11.73±1.38＊＄(n=7) 2.22±0.09＊☆(n=5)
SODM+IS500mg/L 15.92±1.27＊☆(n=7) 8.27±0.54＊(n=5) 1.48±0.12＊(n=6)
　　注:与正常对照组比 , #P<0.05, ＊P<0.01;缺氧对照组相比 , ＄P<0.01, ☆P<0.01
2.2　神经细胞存活率测定结果
实验组 MTT测定结果的方差分析显示 , F=278.54, P<0.01.神经细胞经 SODM培养 4 d后 , OD值
显著下降(P<0.01),细胞存活率下降;如果在 SODM培养同时给于 IS(浓度从 100 ～ 300 mg/L)处理 ,
OD值显著恢复 ,细胞存活率增加.SODM组(b)与正常对照组(a)相比有显著性差异(P<0.01);而加
191
　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
图 2　IS对缺血清缺氧神经细胞存活的影响
药组(c, d, e, f)的 OD值显著高于 SODM组
(b)(P<0.01);加药组(g)的 OD值与 SODM
组(b)没有显著的差别 ,如图 2所示.
3　讨　论
神经痛是一种常见的疾病 ,种类很多 ,而
引起它的原因不明.有研究表明枕神经痛和坐
骨神经痛的原因之一是当体内血液循环受阻
不畅时 ,缺血缺氧引起的[ 16, 17] .体外培养的脊
髓神经细胞对缺血缺氧较为敏感 ,缺血缺氧可
诱导神经细胞的凋亡 ,采用 MTT法以确定细
胞活性及凋亡的形成.研究发现经缺血清缺氧
处理的神经细胞凋亡的百分率升高.本实验建立的缺血清缺氧损伤模型引起的神经细胞损害的过程与
临床脊髓组织缺血缺氧病理过程类似 [ 18] .
在临床上 , IS长期被应用于镇痛和治疗神经痛等疾病.动物的在体药理研究发现 , IS对大鼠隐神经
的神经传导有抑制作用[ 6] .引起此种作用的原因是 , IS使神经髓鞘和轴突膜遭到破坏 [ 7] ,或使神经细胞
膜发生变化 [ 16] ,引起传导阻滞 ,从而起到镇痛作用.目前所有的有关研究都集中于 IS的镇痛作用 ,至于
它是否能对治疗过程中受损的神经细胞有修复作用至今未见任何报道.本实验利用离体培养的小鼠脊
髓神经细胞便于观察的优点 ,在模拟临床缺血缺氧的条件下研究发现:IS在高浓度(≥500 mg/L)下对
神经细胞确有损伤作用 , 能使突起断裂 , 长度缩短 , 数目减少 , 细胞活性下降;但是当 IS浓度降于
300mg/L后 ,它对受损神经细胞有保护和修复作用.浓度越低 ,这种作用越明显 ,到 100 mg/L时效果最
好.与受损细胞对照组(缺血清缺氧组)相比 ,低浓度 IS使受损神经细胞的突起变长 ,数目增加 ,胞体变
大 ,细胞活性提高.综上所述 , IS对神经膜的作用是多方面的.可以推测 ,当浓度较高时它能使在体的神
经髓鞘和轴突膜 、神经细胞膜崩解 ,对神经传导有一定的抑制作用;当在体药物浓度降低到一定范围时
它又可以促进受损神经细胞的修复 ,治愈神经痛.
本实验是 IS对脊髓神经细胞影响的初步研究 ,为进一步研究其成分和作用提供了依据.
参考文献:
[ 1] 　上海医药工业研究院.药品集第 9分册神经系统药物 [ M] .上海:上海科技出版社 , 1985.
[ 2] 　陈瑛一 , 李锦 ,吴英良.野木瓜化学成分及其药理和临床研究进展 [ J] .沈阳药科大学学报 , 2008, 25(11):924 -
927.
[ 3] 　吴一福.中药镇痛新药一精制野木瓜注射液 [ J] .世界药品信息 , 2002, 3(1):50-50.
[ 4] 　陈和吉.野木瓜穴位注射治疗坐骨神经痛 144例 [ J] .人民军医 , 1991, 41(5):49.
[ 5] 　兰星 , 陈素 ,郭敏 , 等.野木瓜注射液对大鼠脊髓背角广动力范围神经细胞诱发放电的影响 [ J] .中南民族大学学报
(自然科学版), 2008, 27(4):56-60.
[ 6] 　叶文博 , 刘强 ,叶青 , 等.野木瓜注射液对大鼠隐神经传导的影响 [ J] .中草药 , 1995, 26(1):20-21.
[ 7] 　叶文博 , 张慧绮 , 金荣华.野木瓜皂甙对大鼠神经髓鞘和轴突膜的作用 [ J] .神经解剖学杂志 , 2003, 19(3):311 -
316.
[ 8] 　余磊 , 潘树义 ,秦建强.脊髓神经细胞培养的方法 [ J] .中国临床解剖学杂志 , 2002, 20(4):267.
[ 9] 　杨浩 , 王春婷 ,鞠躬.不同方法纯化体外培养脊髓神经细胞的比较 [ J] .中国组织化学与细胞化学杂志 , 2000, 9(3):
258-260.
192
　第 2期 张秀璋 , 叶文博 , 周丽娜:野木瓜注射液对体外缺血清缺氧培养的小鼠脊髓神经细胞生长的影响 　　
[ 10] 张俐 , 聂光瑞.体外培养原代脊髓神经细胞 [ J] .中国中医骨伤科杂志 , 2008, 16(2):13-15.
[ 11] 李芳 , 何风慈 ,李东红 , 等.胎鼠脊髓神经细胞的分离培养与生长分化 [ J] .第三军医大学学报 , 1993, 15(6):544 -
545.
[ 12] 顾晓素 , 顾永健 ,姜正林.刺五加皂甙对自由液作用和无血清培养条件下两种神经细胞衰老模型细胞的保护作用
[ J] .中国临床康复 , 2005, 9(25):123-125.
[ 13] 叶蓓 , 高建新 ,张立光.银杏内酯 B促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞生长发育的研究 [ J] .安徽医药 , 2008, 12
(8):685-687.
[ 14] 肖伟 , 罗卓荆 ,黄明.不同营养因子组合对大鼠脊髓神经细胞的作用研究 [ J] .中国矫形外科杂志 , 2008, 16(12):
940-943.
[ 15] 陈剑峰 , 张烽.刺五加皂苷对体外培养大鼠脊髓运动神经元缺氧预保护效应的实验研究 [ J] .中国交通医学杂志
2005, 19(6):581-583.
[ 16] 王方凌.神经痛治疗与护理 [ M] .广东:广东旅游出版社 , 2006.
[ 17] WANGH, YUD, LIANGX, etal.YemousideYM7, YMYM13 andYM14:FournortriterpenoidsaponinsfromStauntonia
chinensis[ J] .PlantaMedica, 1989, 55(6):303-306.
[ 18] 杨友松 , 袁光固 ,陈春晖 , 等.枕神经痛发病的相关因素及其机制分析 [ J] .中国临床康复 , 2004, 8(20):3950-3952.
Effectsofinjectionstauntoniaeonthegrowthofmousespinal
neuronsunderaerumfreeandanoxiaconditioninvitro
ZHANGXiu-zhang, YEWen-bo＊ , ZHOULi-na
(ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:Thespinalneuronsweredissociatedfromprimarymouseandculturedinvitro.Themodelofapoptosisinducedbyanox-
iaandaerumfreewasestablishedonculturedneurons.AftergivenInjectionStauntoniae(IS)4 days, thesecellswereobserved
underinvertedphasecontrastmicroscopeandtestedMTTassay.TheresultsindicatedthatIScausedcelinjuryathighconcentra-
tions(>500 mg/L).However, IScouldenhancethecytoactivityandincreasethenumberofneuronsandneurites, andthesizeof
celbodyatconcentrationsfrom50 to300 mg/L, especialyat100 mg/L.
Keywords:mouse;injectionstauntoniae;spinalneurons;anoxiaandaerumfreeculture
(责任编辑:郁　慧)
193