全 文 ：实验结果表明，psbA-trnH 序列的 PCＲ 扩增效
率较高，但插入和缺失位点也较多，不易于进行序列
比对，所以数据分析过程中，忽略了插入和缺失的信
息。同时在测序过程中部分序列出现了“高级结
构”，但经过双向测序后，序列可以拼接和使用。
参 考 文 献
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收稿日期:2014-03-13
基金项目:研究生创新基金项目(JZYC12C01)
作者简介:黄佩蓓(1964-)，女，硕士，副教授，主要从事中药生化研究;E-mail:hhhpei@ tom. com。
* 通讯作者:陈世华，Tel:18107008606，E-mail:504853478@ qq. com。
白木通 SＲAP反应体系的优化及其应用
黄佩蓓，陈世华* ，王 飞，曾 贤，余春波
(江西中医药大学，江西 南昌 330004)
摘要 目的:建立适于白木通的 SＲAP反应体系，为白木通的遗传多样性研究奠定基础。方法:以白木通基因
组 DNA为模板，优化了 SＲAP反应体系的各主要参数。结果:建立稳定可靠的 SＲAP-PCＲ 反应体系(25 μL):模板
DNA 90 ng，dNTPs 200 μmol /L，TaqDNA聚合酶 1 U，引物 0. 4 μmol /L，10 × PCＲ Buffer 2. 5 μL;反应程序中第 2 次最
适退火温度为 55 ℃;筛选出 12 对稳定性好、多态性高的 SＲAP引物;并对 5 个白木通进行扩增验证，共获得 114 个
多态性位点。结论:该体系是适于白木通的 SＲAP反应体系，为后续白木通遗传多样性研究奠定了基础。
关键词 白木通;SＲAP;体系优化
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)08-1371-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2014. 08. 014
白木通 Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． var． au-
stralis (Diels)Ｒehd. 为木通科木通属植物，系三叶
木通的变种，其干燥藤茎作为木通入药收载于 2010
年版中国药典〔1〕，味苦，性寒，具利尿通淋、清心除
烦、通经下乳之功效。药理研究表明，白木通有利
尿、抗肿瘤作用〔2〕。我国白木通资源主要分布于华
南及长江流域各省区，但开发利用较少〔3〕。为了加
强白木通的合理开发利用，有必要对其进行遗传多
样性分析与评价等研究。
SＲAP(序列相关扩增多态性)分析是一种以
PCＲ 为基础的新型分子标记技术，针对基因 OＲFs
中外显子富含 GC 而内含子富含 AT 特点设计引物，
因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而
产生多态性，具有简便、稳定、中等产率、成本低等特
点〔4〕，目前已在中药材的遗传多样性研究、道地性
分析、遗传图谱构建等成功应用〔5〕。本研究通过对
白木通 SＲAP-PCＲ 反应体系中的模板 DNA 用量、
dNTPs浓度、引物浓度与 Taq 酶用量等主要因子进
行优化试验，并进行初步应用，从中筛选出适宜的反
应体系，以期为进一步利用该技术开展白木通种质
资源的遗传多样性分析与评价等研究奠定技术基
础。
1 材料和方法
1. 1 材料 试验样品白木通采自江西中医药大学
神农园、井冈山、庐山，均由江西中医学院赖学文教
授鉴定为木通科木通属植物白木通 Akebia trifoliata
(Thunb. )Koidz. var. australis(Diels)Ｒehd. 。具体采
样信息见表 1。
Taq 酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker 购自北京
全式金生物技术有限公司;SＲAP 引物序列的设计
参照文献〔4，6，7〕，由上海生物工程有限公司合成，引
物序列见表 2。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA提取:采用改良CTAB法提取各样品
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表 1 白木通样品采集地信息
样品编号 采集地
1 江西中医药大学神农园
2 江西庐山三叠泉
3 江西庐山石门涧
4 江西井冈山上井村
5 江西井冈山龙潭
表 2 SＲAP引物序列
正向引
物编号
引物序列
(5→3)
反向引
物编号
引物序列
(5→3)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGATG Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me24 GACCAGTAAACCGGATG
Me25 CAGGACTAAACCGGATA
新鲜叶片基因组 DNA。所提 DNA 的质量、浓度和
纯度，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行
检测，稀释至所需浓度后，－ 20 ℃冰箱保存备用。
1. 2. 2 SＲAP-PCＲ 的基本反应条件和扩增程序:
SＲAP-PCＲ基本反应条件:总体积为 25 μL，其中含
模板 DNA 60 ng，引物 0. 3 μmol /L，dNTPs 200 μmol /
L，Taq DNA 聚合酶 1 U，10 × PCＲ buffer(含 Mg2 +)
2. 5 μL，其余以 ddH2O 补充至 25 μL。SＲAP-PCＲ
扩增基本反应程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃ 1
min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，5 个循环;94 ℃ 1
min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃延伸
10 min;4 ℃保存。PCＲ扩增产物用 2%的琼脂糖凝
胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统上观察和记录。
1. 2. 3 SＲAP-PCＲ体系的优化:在保持其他因素一
致的条件下，分别设计不同梯度的模板 DNA 浓度、
dNTPs、引物浓度、Taq DNA 聚合酶用量以及退火温
度，每次改变扩增体系中的一个因素，以确定该因素
对 SＲAP扩增结果的影响，并进行反复比较筛选，以
确定最佳参数。各因素设计梯度见表 3。所使用的
DNA模板为来自江西中医药大学神农园白木通单
株所提取的 DNA。使用的引物组合为 Me6-Em3。
1. 2. 4 引物筛选:参照文献〔6〕合成的引物组合形
成 48 对引物，采用最佳反应体系进行 PCＲ 扩增，从
其组合的 48 个引物对中筛选出扩增清楚、可重复、
多态性高的引物对。
1. 2. 5 SＲAP-PCＲ 优化体系的验证:采用优化的
SＲAP-PCＲ体系，以筛选出的引物对对 5 个白木通
样品进行扩增，以验证优化体系的优劣。
表 3 SＲAP-PCＲ反应各影响因素的不同水平设计
因素
水平
1 2 3 4
模板 DNA/ng 30 60 90 120
dNTPs /(μmol /L) 150 200 250 300
引物 /(μmol /L) 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4
Taq DNA聚合酶 /U 0. 5 1 1. 5 2. 0
退火温度 /℃ 50 52 54 55
2 结果与分析
2. 1 白木通基因组 DNA 的检测 采用改良 CTAB
法提取的白木通基因组 DNA A260 /A280在 1. 79 ～
1. 88 之间;琼脂糖凝胶电泳 DNA 样品条带明亮清
晰、无拖尾，且点样孔干净(图 1)。结果表明所提
DNA样品纯度和质量都较好，满足本实验的要求。
图 1 改良 CTAB法提取的白木通叶片 DNA电泳图
1 ～ 5. 样品 1 ～ 5
2. 2 SＲAP-PCＲ体系的优化
2. 2. 1 模板 DNA浓度对 SＲAP 反应的影响:由图
2 可见，4 个模板 DNA 浓度(30、60、90、120 ng /25
μL)进行 PCＲ 扩增后均可扩增出条带。当模板
DNA浓度为 30 ng /25 μL时，扩增条带相对较浅，且
扩增条带相比其他模板 DNA 浓度少;当模板 DNA
浓度增加到 60 ng /25 μL 时，相对 90 和 120 ng /25
μL这两个 DNA浓度的 PCＲ 扩增产物，扩增条带数
目基本一致但条带相对较浅;模板 DNA浓度分别为
90、120 ng /25 μL时，扩增条带数目基本一致且条带
亮度基本无变化，故选用 90 ng /25 μL 作为最佳模
板用量。
图 2 模板 DNA浓度对 SＲAP反应的影响
注:M为 DL2000 DNA marker，1 ～ 4 DNA浓度:30、60、90、120 ng
/25 μL
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2. 2. 2 dNTPs 浓度对 SＲAP反应的影响:从设置的
4 个 dNTPs 浓度的 PCＲ 扩增结果来看(图 3)，
dNTPs 浓度较小时，扩增条带相对较少且浅;当
dNTPs 浓度从 150 μmol /L 增加到 200 μmol /L 时，
扩增条带增多且清晰;当 dNTPs 浓度从 200 μmol /L
分别增加到 250 μmol /L 和 300 μmol /L 时，扩增条
带数目基本不变但条带较浅，由此确定 dNTPs 的最
佳浓度为 200 μmol /L 。
图 3 dNTPs 浓度对 SＲAP反应的影响
注:M为 DL2000 DNA marker，1 ～ 4 dNTPs 浓度:150、200、250、
300 μmol /L
2. 2. 3 引物浓度对 SＲAP 反应的影响:由图 4 可
见，当引物浓度为 0. 1 μmol /L 时，扩增条带少且浅;
随着引物浓度的增大，扩增条带增多带型清晰，为减
少非特异性扩增以及确保产量，本研究确定 0. 4
μmol /L为引物的最佳浓度。
图 4 引物浓度对 SＲAP反应的影响
注:M为 DL2000 DNA marker，1 ～ 4 引物浓度:0. 1、0. 2、0. 3、0. 4
μmol /L
2. 2. 4 TaqDNA 聚合酶浓度对 SＲAP 反应的影响:
由图 5 可见，当 TaqDNA 聚合酶浓度为 0. 5 U /25 μL
时，扩增条带模糊甚至基本没有;当为 1 U /25 μL
时，条带数目较多且清晰、明亮，当浓度增至 1. 5 U /
25 μL甚至以上时，所扩增的条带基本和 1 U /25 μL
时一致，综合考虑，TaqDNA 聚合酶最佳浓度确定为
1 U /25 μL。
图 5 Taq DNA聚合酶浓度对 SＲAP反应的影响
注:M 为 DL2000 DNA marker，1 ～ 4 Taq DNA 聚合酶浓度:0. 5、1、
1. 5、2 U /25 μL
2. 2. 5 退火温度对 SＲAP 反应的影响:由图 6 可
见，在设定的 4 个退火温度中，退火温度从 50 ～ 52
℃，扩增条带无显著性差异，但 52 ℃扩增条带更清
晰;从 52 ℃上升至 54 ℃，扩增条带增多;而退火温
度为 54 ℃和 55 ℃ 时，扩增条带数基本一致，但 55
℃时的更清晰，为了得到较好的扩增效果，选用较高
的 55 ℃为适宜退火温度。
图 6 退火温度对 SＲAP反应的影响
注:M为 DL2000 DNA marker，1 ～ 4 退火温度:50、52、54、55 ℃
2. 2. 6 引物筛选:采用最佳反应体系进行 PCＲ 扩
增，从其组合的 48 对引物组中筛选出了 12 对(即
Me1-Em1、Me1-Em3、Me1-Em4、Me3-Em8、Me4-Em6、
Me4-Em8、Me5-Em3、Me6-Em3、Me6-Em5、Me24-
Em1、Me24-Em3、Me25-Em3)扩增条带多、清晰、重
复性好的引物组合。
2. 2. 7 SＲAP-PCＲ优化体系的验证:采用该体系筛
选出的引物对 5 个白木通 DNA 样品进行 SＲAP 扩
增，扩增结果表明:各引物组合均获得较好扩增，共
获得 141 条扩增条带，114 个多态性位点，多态性位
点比率为 80. 85% (见表 4)。图 7 为引物组合
Me24-Em3 对 5 个白木通 DNA样品的 SＲAP-PCＲ扩
增电泳图，由图可见，5 个样品都扩增出了多态性
强、条带清晰、稳定性好的条带，且供试材料间差异
·3731·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 8 期 2014 年 8 月
明显，这说明该 SＲAP反应体系是稳定可靠的，适合
于白木通的 SＲAP分析。
表 4 5 种白木通样品 SＲAP扩增结果
引物对 扩增总条带数 多态性条带数 多态性比率 /%
Me1-Em1 11 8 72. 7
Me1-Em3 11 9 81. 8
Me1-Em4 10 8 80. 0
Me3-Em8 13 11 84. 6
Me4-Em6 14 12 85. 7
Me4-Em8 14 13 92. 9
Me5-Em3 12 10 83. 3
Me6-Em3 10 8 80. 0
Me6-Em5 13 11 84. 6
Me24-Em1 11 8 72. 7
Me24-Em3 10 7 70. 0
Me25-Em3 12 9 75. 0
图 7 采用引物组合Me24-Em3 对 5 个白木通
样品 SＲAP-PCＲ的扩增结果
注:M为 DL2000 DNA marker，1 ～ 5 对应表 1 中各编号白木通样品
3 讨论
SＲAP标记是基于 PCＲ 的一种简便、实用的分
子标记方法，应用于不同物种分析时必须进行反应
条件的优化，才能确保反应体系的稳定性和准确性。
本研究通过优化建立的适于白木通的稳定可靠的
SＲAP-PCＲ反应体系为(25 μL总体积中)模板 DNA
90 ng，dNTPs 200 μmol /L，Taq DNA 聚合酶 1 U，引
物 0. 4 μmol /L，10 × PCＲ Buffer 2. 5 mmol /L;退火温
度 55 ℃;并筛选出 12 对(Me1-Em1、Me1-Em3、Me1-
Em4、Me3-Em8、Me4-Em6、Me4-Em8、Me5-Em3、Me6-
Em3、Me6-Em5、Me24-Em1、Me24-Em3、Me25-Em3)
重复性好、多态性强的引物，从而为进一步的白木通
种质资源遗传多样性研究奠定了基础。
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