全 文 ：中图分类号:S 853.74　文献标识码:A　文章编号:1673-4696(2007)10-0909-05
蕨麻多糖对小鼠免疫细胞信号转导相关分子的影响
胡庭俊1 ,陈炅然2 ,张　霞3 ,郑立颖3 ,程富胜2 ,郑荣梁4
(1.广西大学 动物科技学院 ,广西 南宁　530004;2.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 ,
甘肃 兰州　730050;3.甘肃农业大学 动物医学院 ,甘肃 兰州　730070;
4.上海高校一氧化氮及炎症医学 E-研究院 ,上海　201203)
　　摘要:以 50 、100 、200 、400μg/mL 的蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞在体外分别孵育 4 、8 、12 、24 h ,测定了
细胞培养液中一氧化氮(NO)、6-酮-PGF1α及血栓素 B2(TXB2)的水平和细胞内 cGMP 的含量 ,测定了加入
蕨麻多糖后 2 、5 、10 min时细胞内游离钙离子(Ca2+)的浓度。结果显示 ,蕨麻多糖能明显促进小鼠脾淋巴细
胞分泌一氧化氮 ,显著升高小鼠脾淋巴细胞内 cGMP 及钙离子的水平 ,对细胞内 TXB2 的产生有抑制作用 ,
能够调整花生四烯酸体系向 6-酮-PGF1α一端偏移 。提示蕨麻多糖能够增强脾淋巴细胞的免疫作用 。
关键词:蕨麻多糖;免疫细胞;信号转导
Effect of Potent illa anserine polysaccharide on signal transduction-
related molecules in murine immunocytes
HU Ting-jun1 ,CHEN Jiong-ran2 ,ZHANG Xia3 ,ZHENG Li-ying3 ,
CHENG Fu-sheng2 ,ZHENG Rong-liang4
(1.Collegeo f Animal Science and Technology , Guangx i Univ ersity , Nanning 530004 , China;2.Lanzhou Institute o f
Animal Sciences &Veterinary Pharmaceutics , Chinese Academy o f Agricultural Sciences , Lanz hou 730050 , China;
3.College of Veterinary Medicine ,Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070 , China;4.Div ision o f N itric Ox ide
and In f lammatory Medicine , E-Institutes o f Shanghai Universities , Shanghai 201203 , China)
　　Abstract:Murine splenic lymphocy tes w ere incubated in medium alone or medium containing Potent i l-
la anserine poly saccharide(PAP)in the concentrations of 50μg/mL ,100μg/mL ,200μg/mL or 400μg/mL
fo r 4 h ,8 h , 12 h o r 24 h in vi tro , respectively .The supernatants at di ffe rent culture periods were analyzed
fo r changes in levels o f nit ric oxide(NO), 6-keto-prostaglandin F 1αand thromboxane B2(TXB2).The cells
were collected to determine contents of cGMP.The changes in levels o f the concentrations of cy toplasmic
f ree Ca
2+
were measured at minute 2 , 5 and 10 post-incubation , respectively.PAP increased the production
of NO and the concentration of intracellular f ree calcium in splenic lymphocy tes and raised the levels of
cGMP and 6-keto-PGF 1αof murine splenic lymphocy tes in v i tro.The levels o f TXB2 dropped in the cells
t reated w ith PAP.PAP was able to regulate arachidonic acid signal transduction o f immunocy tes.These
results show ed that PAP w as able to enhance immune funct ions of the splenic lymphocy tes.
Key words:Potenti l la anserine poly saccharide;immunocy tes;signal t ransduction
　　蕨麻(Potent il la anserine),又名戳玛 、卓玛沙
曾 、延寿果和仙人果等 ,为蔷薇科植物委陵菜属鹅绒
委陵菜的块根 ,多年生草本 ,主产于我国甘肃 、青海 、
宁夏 、西藏 、山西等十多个省区[ 1] 。蕨麻为藏医常用
收稿日期:2007-05-14;修回日期:2007-07-30
基金项目:国家自然科学基金项目(30371056)
作者简介:胡庭俊(1965-), 男 ,甘肃白银人 , 研究员 ,博士 , 现从事中药免疫药理及兽用免疫增强剂方面的研究工作 , Tel:
0771-3238506 , 13877136801 , Fax:0771-3236103 , E-mail:tingjunhu@126.com
中国兽医科学　2007 , 37(10):909-913
Ve te rinary Science in China
DOI :10.16656/j.issn.1673-4696.2007.10.012
药物 ,又是藏民四季常用的传统滋补品。蕨麻可全
草入药 ,春采性凉 ,秋采性温 ,有收敛止血 、止咳利
痰 、治诸血症及下痢 、健脾益胃 、生津止渴 、益气补血
等功用[ 2-3] 。蕨麻作为藏药历史悠久 ,历代有关蕨麻
的记载已有不少 ,但对其研究只涉及临床应用方面 。
笔者采用乙醇分级沉淀法从青海产蕨麻的根部 ,获
得了具有免疫增强作用的活性成分蕨麻多糖(简称
PAP)。本研究采用激光扫描共聚焦显微镜技术测
定小鼠脾淋巴细胞内 Ca2+浓度 ,采用 Griess法对小
鼠脾淋巴细胞产生的 NO 进行测定 ,用放射免疫方
法检测小鼠脾淋巴细胞内 cGMP 、血栓素 B2
(TXB2)和 6-酮-PGF1α(6-keto-PGF1α)的含量 ,旨在
探讨蕨麻多糖免疫调节作用的机制 。
1　材料与方法
1.1　实验动物
　　BA LB/c纯系小鼠 ,8周龄 ,体重18 ～ 22 g ,雌雄
各半 ,由兰州军区总医院动物试验科提供。
1.2　药物
　　蕨麻多糖 ,灰白色粉末 ,为一种杂多糖 ,由鼠李
糖 、阿拉伯糖 、葡萄糖和半乳糖组成 。用时配制成 1
g/ L 灭菌生理盐水溶液 。
1.3　试剂及仪器
　　RPM I 1640为 Gibco 产品;Fura-2/AM 为 Sig-
ma公司产品;cGMP 放射免疫试剂盒购自上海医科
大学;TXB2 、6-酮-PGF1α试剂盒为北京北方生物技
术研究所产品;犊牛血清为杭州四季青生物工程材
料有限公司产品;其他试剂均为国产分析纯。试验
用仪器主要有激光扫描共聚焦显微镜(ZESSLSM-
510META 型 ,德国)和智能放免 γ-测量仪(SN-
695B型 ,上海原子核研究所日环仪器一厂)。
1.4　小鼠脾淋巴细胞的制备
　　无菌采取小鼠脾置于 0.147 mm 尼龙网上 ,加
Hank s液研磨 , 制备细胞悬液 , 2 000 r/min 离心
5 min ,弃去上清液 ,用 NH 4Cl-T ris溶解红细胞后 ,
加 Hank s液洗涤 2次至悬液澄清为止。经台盼蓝
染色 ,细胞存活率为 95%以上 ,调整细胞浓度为
8×106/mL。
1.5　小鼠脾淋巴细胞内钙离子浓度的测定
　　取新鲜制备的脾淋巴细胞悬液 ,用 RPM I 1640
完全培养基调整细胞浓度为 2×106/mL。将细胞
悬液分装于培养皿中 ,每个培养皿 2 mL ,分别加入
10μmol/L Fura-2/AM 200μL , 37 ℃孵育 40 min ,
1 500 r/min离心 5 min ,弃上清液 ,用 PBS 液洗涤 3
次 ,以 PBS 液重悬细胞。将细胞置于激光扫描共聚
焦显微镜下 ,选激发光波长为 488 nm ,发射波长为
530 nm ,在选定的测试细胞区域内进行动态扫描。
试验组 A 、B 、C 、D分别加入 PAP 溶液 50 、100 、200 、
400μg/mL ,对照组 E加入同体积 RPMI 1640 完全
培养液 ,分别监测第 2 、5 、10 min时细胞荧光水平的
动态变化。
1.6　小鼠脾淋巴细胞的体外培养和 NO生成量的
测定
　　取小鼠脾淋巴细胞悬液 , 调节细胞浓度为
5×106/mL。试验分 5个组 ,每组设 3个平行 。试验
组 A 、B 、C 、D分别加入 PAP 溶液 50 、100 、200 、400
μg/mL;对照组 E加入同体积 RPMI 1640完全培养
液 。每个培养瓶加淋巴细胞悬液 3 mL ,蕨麻多糖分
别按上述量加入 ,在 37 ℃、50 mL/L CO 2 培养箱中
分别孵育 4 、8 、12 、24 h 后 ,收集不同培养时间的细
胞及上清液 , 应用 G riess 法测定 NO 的含量
(D550 nm)。
1.7　小鼠脾淋巴细胞内 cGMP含量的测定
　　将不同时间培养的细胞调浓度为 1×106/mL。
取 1mL , 1 500 r/min 离心 5min ,弃去上清液。细胞
沉淀加 1 mL 醋酸缓冲液(50 mmol/L , pH4.75),混
悬 ,反复冻融细胞 3 ～ 4 次 , 3 000 r/min 离心 15
min ,取上清液 100μL ,按照试剂盒操作说明书测定
cGMP 含量 。
1.8　小鼠脾淋巴细胞内花生四烯酸代谢产物的
测定
　　将不同时间培养的细胞调浓度为 1×106/mL。
取 1 mL ,1 500 r/min离心 5 min ,分别取上清液 200
μL ,按照试剂盒测定说明书进行 6-酮-PGF1α和
TXB2含量的测定。
2　结果
2.1　蕨麻多糖可显著刺激体外培养的小鼠脾淋巴
细胞产生 NO
　　随着蕨麻多糖浓度的递增 ,细胞产生的 NO 量
在递增 ,且随着培养时间的延长 ,细胞产生的 NO量
也在递增。见表 1。
2.2　蕨麻多糖能升高小鼠脾淋巴细胞内游离钙离
子的水平
　　在细胞内游离钙离子测定中 ,应用激光扫描共
聚焦显微镜 ,在激发光波长为 488 nm ,发射波长为
530 nm , 分别测定了加入 PAP(50 、100 、200 、400
μg/mL ,终浓度)后 2 、5 、10 min 的细胞荧光水平。
结果 ,加入 PAP 后细胞的荧光强度明显增加 , PAP
浓度达 100μg/mL 时 ,与对照组差异极显著(P <
910 中国兽医科学 第 37 卷
0.01)。结果见表 2。
2.3　蕨麻多糖能升高小鼠脾淋巴细胞内 cGMP 的
水平
　　培养时间为 8 h和 24 h 时 ,蕨麻多糖低浓度组
(50μg/mL 和 100μg/mL)细胞内 cGMP 水平显著
高于对照组(P <0.05)。蕨麻多糖高浓度组(200
μg/mL 或 400μg/mL)与对照组无显著差异。结果
见表 3。
2.4　蕨麻多糖能降低细胞内 TXB2含量 ,对细胞内
6-酮-PGF1α的产生有促进作用
　　从细胞内 6-酮-PGF 1α/TXB2比值可以看出 ,培
养 4 h 起 , 50 μg/mL 组与对照组差异显著(P <
0.05), 100μg/mL 多糖组与对照差异极显著(P <
0.01)。结果见表 4 。
表 1　蕨麻多糖对体外培养的小鼠脾淋巴细胞 NO生成的影响
Table 1　Effect of PAP on the production of NO in splenic lymphocytes of mice in vitro
组别
G roup s
处理
T reatm ents
不同培养时间 NO 的生成量/(μmol· L -1)　Product ions of NO at dif f erent culturing time points
Hour 4 H ou r 8 Hour 12 H ou r 24
A 50μg/mL PAP 6.90±0.98 7.30±0.03 8.60±0.34 9.00±0.45
B 100μg/mL PAP 7.70±0.36 7.80±0.05 9.30±1.02 9.90±1.19a
C 200μg/mL PAP 8.00±0.57 8.50±0.64 10.20±0.49a 10.90±0.07 a
D 400μg/mL PAP 8.60±0.25 9.30±0.68 11.00±0.78a 12.00±0.47 a
E 0 6.50±0.23 6.40±0.65 6.00±0.78 5.49±0.12
同一纵栏内标记字母 a 的均值与 E组均值之间差异显著(P<0.05)。下同
The means w ith let ter a are signi ficant ly dif feren t f rom that in Group E in a same colum n(P<0.05).The same as follow s
表 2　蕨麻多糖对升高小鼠脾淋巴细胞内游离钙离子水平的影响
Table 2　Effect of PAP on the level of free Ca2+ in splenic lymphocytes of mice in vitro
组别
G roup s
处理
T reatm ents
加入 PAP溶液后不同时间的 D530 nm , Ca2+　D530 nm ,C a2+ at dif feren t time post-PAP-t reatmen t
M in ute 2 Minute 5 Minu te 10
A 50μg/mL PAP 86.58±5.63b 205.73±15.35b 215.50±16.22b
B 100μg/mL PAP 173.09±12.24b 202.11±14.38b 211.23±15.13b
C 200μg/mL PAP 120.73±9.87 139.56±10.86 113.39±9.07
D 400μg/mL PAP 140.36±10.15a 155.54±11.12a 180.26±13.02a
E 0 105.09±8.69 126.94±10.16 121.17±9.67
同一纵栏内标记字母 b的均值与 E组均值之间差异极显著(P<0.01)。下同
The means w ith let ter b are very signif icant ly di ff erent from that in Group E(P<0.01)in a same column.T he same as follow s
表 3　蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞内 cGMP水平的影响
Table 3　Effect of PAP on the level of cGMP in splenic lymphocytes of mice in vitro
组别
G roup s
处理
T reatm ents
不同培养时间的 cGMP 水平/(1×10-1pg·mL-1)　Levels of cGMP at diff erent cul tu ring time points
Hour 4 H ou r 8 Hour 12 H our 24
A 50μg/mL PAP 7.07±0.13 12.68±1.06 a 4.66±0.58 9.83±1.08 a
B 100μg/mL PAP 7.38±0.23 10.76±1.28 a 6.06±0.72 10.95±1.38 a
C 200μg/mL PAP 8.84±0.56 8.74±1.08 6.48±0.29 5.09±0.46
D 400μg/mL PAP 4.57±0.98 6.07±0.38 5.02±1.03 4.79±0.58
E 0 5.83±0.02 6.00±0.27 4.50±0.84 6.00±0.49
表 4　蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞内 6-酮-PGF1α/ TXB2比值的影响
Table 4　Effect of PAP on ratios of 6-keto-PGF1αto TXB2 in splenic lymphocytes of mice in vitro
组别
G roup s
处理
T reatm ents
不同培养时间的 6-酮-PGF1α/ TXB2比值
T he ratios of 6-keto-PGF1αt o TXB2 at diff eren t cul tu ring time points
Hour 4 H ou r 8 Hour 12 H our 24
A 50μg/mL PAP 0.31±0.01a 0.27±0.01 0.39±0.08a 0.42±0.01 a
B 100μg/mL PAP 0.70±0.01b 0.53±0.02b 0.90±0.02b 0.47±0.02 a
C 200μg/mL PAP 0.21±0.02 0.21±0.01 0.28±0.02 0.32±0.02 a
D 400μg/mL PAP 0.18±0.01 0.16±0.03 0.23±0.01 0.23±0.02
E 0 0.11±0.01 0.17±0.03 0.15±0.03 0.18±0.034
911第 10 期　　　　　　　 　　胡庭俊等:蕨麻多糖对小鼠免疫细胞信号转导相关分子的影响
3　讨论与结论
3.1　NO 在免疫系统中作为信号转导的一种重要
介质起作用[ 4] 。NO由 NO合酶(NOS)催化 L-精氨
酸(L-Arg)末端胍基中的一个氮原子氧化生成;NO
的生成量不仅依赖于 NOS ,且依赖于底物 L-A rg 。
而转运 L-A rg 的转运体蛋白为 Na+-非依赖性
的[ 5-6] 。NO生成后迅速经生物膜和体液扩散到临
近靶细胞 ,激活鸟苷酸环化酶(GC),使 cGMP 合成
增加并发挥其第二信使作用。巨噬细胞在许多因素
的刺激下 ,NOS mRNA系统能够表达 NOS 并使之
激活 ,从而催化 L-Arg 产生 NO 。本试验结果首次
发现 ,蕨麻多糖能促进小鼠脾淋巴细胞分泌 NO ,参
与活性氧介导的信号转导 。
3.2　钙离子在生物体内具有广泛的作用 ,如肌肉收
缩 、神经递质释放 、细胞分化和死亡等。细胞钙以结
合钙和游离 Ca2+两种形式存在 ,细胞内钙 99.90%
以上为结合钙 ,主要分布在细胞核 、线粒体 、内质网/
肌浆网和质膜 ,而胞内游离 Ca2+极少。细胞在非激
活状态时 , 胞内游离 Ca2+浓度仅为 1 ×10-7 ～
1×10-8 mol/L。细胞内游离 Ca2+浓度的改变是细
胞生理功能的关键环节[ 7-8] 。近年来 , Ca2+作为细胞
内信号分子参与信息传递已成为人们关注的热点 。
Ca2+作为细胞信使的基础 ,首先是在细胞质与胞内
钙库或胞外 Ca2+之间存在浓度梯度 , 由于胞内
Ca2+浓度很低 ,而胞外 Ca2+浓度要高几个数量级 ,
当外界信号分子刺激使胞外即使少量的 Ca2+进入
细胞质或钙库释放 Ca2+稍有增加时 ,均可导致胞浆
内 Ca2+浓度大幅增加 ,继而引发细胞一系列生理生
化反应 ,而起到传递信号作用[ 9] 。由此可见 ,胞内游
离 Ca2+水平的调节也就成为信号转导过程中的关
键环节。本研究表明 ,PAP 通过增加淋巴细胞内游
离 Ca2+浓度的途径影响细胞的信息传递 ,激活淋巴
细胞 ,发挥免疫调节作用 。
3.3　环核苷酸是重要的细胞内信使物质 ,参与调控
各种激素 、神经递质等所导致的各种生命活动 。
cGMP 是三磷酸鸟苷(GTP)在鸟苷酸环化酶(GC)
作用下水解产生的。 cGMP 作为细胞内第二信使 ,
通过依赖 cGMP 蛋白激酶的激活 ,使底物蛋白质磷
酸化 ,或者调节离子通道 ,参与生物体内多种功能的
调节[ 10] 。NO 是 GC 的主要激活物 , 在 Mg2+和
ATP 参与下 ,促进 cGMP 合成 , cGMP 促进增殖而
抑制分化[ 11] 。研究发现 ,细胞信号转导中存在 NO-
cGMP 通路。本试验中 ,蕨麻多糖浓度为 50μg/mL
和 100μg/mL 时 ,细胞内 cGMP 含量分别在培养 8
h 、24 h 段出现高峰 ,表明蕨麻多糖在较低浓度时对
细胞内 cGMP 具有上调作用 。
3.4　花生四烯酸(Arachidonic acid , AA)是通过磷
脂酶水解膜磷脂释放的不饱和脂肪酸 , AA 通过环
加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列的活
性物质 ,如前列腺素(PG s)、前列环素(PGI2)、血栓
素(TXs)、白三烯(LTs)等 ,它们虽然含量很少 ,但
具有极强的生物活性 ,既可作为某些激素 、递质 、生
物活性因子的第二信使或与其他第二信使共同调节
细胞功能 ,也可能起局部激素或局部调质的作用 ,并
在炎症和免疫反应中起重要调节作用[ 12] 。研究认
为 ,细胞内产生的花生四烯酸及其代谢产物本身在
细胞内可能发挥第二信使作用。花生四烯酸及其代
谢产物能直接激活 PKC ,也能激活 PLC;能不依赖
于 IP3而增加细胞内钙离子浓度 ,这样与 PLC 激活
后产生的第二信使 DAG(激活 PKC)和 IP3(动员细
胞内钙离子)协同作用 ,调节细胞功能[ 13] 。
　　6-酮-PGF1α-TXB2是一对平衡体系 , 6-酮-PGF1α/
TXB2比值是衡量该体系是否处于稳态的标志之一。
本次试验发现 ,蕨麻多糖能升高细胞内 6-酮-PGF 1α,
降低细胞内 TXB2水平 ,调整体系向 6-酮-PGF 1α一
端偏移 , 当蕨麻多糖浓度为 100 μg/mL 时 6-酮-
PGF 1α/TXB2比值升高极为显著 , 说明蕨麻多糖能
促进和调节免疫细胞内磷脂 、甘油三酯及胆固醇的
水解作用并对所释放的花生四烯酸代谢具有重要调
节作用 ,从而调控免疫细胞内花生四烯酸信号分子
的水平及相关基因的表达。
3.5　蕨麻多糖在体外具有清除羟自由基的作用 ,呈
剂量-效应关系 ,且对调理酵母多糖诱导的小鼠脾淋
巴细胞释放 H 2O 2具有抑制作用 ,对联苯三酚自氧
化具有抑制作用[ 14] 。蕨麻多糖能促进体外培养的
小鼠脾淋巴细胞增殖 , 并促进腹腔巨噬细胞分泌
NO[ 15] 。在体内能对抗环磷酰胺所致的免疫抑制 ,
升高小鼠血清干扰素 、白细胞介素-6和肿瘤坏死因
子水平[ 16] 。本试验观察了蕨麻多糖对小鼠免疫细
胞 NO-cGMP 信号通路的影响 ,结果发现脾淋巴细
胞分泌的 NO的量 、细胞内 cGMP 水平与蕨麻多糖
呈浓度依赖关系 ,表明该多糖通过激活可溶性鸟苷
酸环化酶 ,提高细胞内 cGMP 水平 ,发挥免疫调节
效应;发现蕨麻多糖通过升高免疫细胞内 Ca2+浓
度 ,激活 Ca2+相关信号途径 ,影响 PKC 信号通路 ,
调节基因的表达;在花生四烯酸信号体系方面 ,蕨麻
多糖对细胞内 TXB2与 PGF1水平具有双向调节作
用 ,从而调控免疫细胞内花生四烯酸信号分子的水
平及相关基因的表达 ,在免疫细胞内环境的稳定方
912 中国兽医科学 第 37 卷
面起着重要作用 。
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(in Chinese)
(责任编辑　张文举)　
913第 10 期　　　　　　　 　　胡庭俊等:蕨麻多糖对小鼠免疫细胞信号转导相关分子的影响