全 文 ：　蕨麻多糖对小鼠淋巴细胞增殖和一氧化氮分泌的影响
陈炅然 , 胡庭俊 , 程富胜 , 孟聚诚 , 高　芳
(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 , 甘肃 兰州　730050)
　　摘要:为探讨蕨麻多糖(Potenti l la anserine po lysaccharide ,PAP)免疫调节的作用机理 ,观察
了 PAP 对小鼠脾淋巴细胞体外增殖和分泌一氧化氮的影响。结果显示 , 50 mg/ L PAP 配合ConA
或 LPS(lipopo ly saccharide ,脂多糖)能使小鼠脾淋巴细胞在体外显著增殖(P <0.05);100 、200及
400 mg/L PAP 配合 ConA 或 LPS可使小鼠脾淋巴细胞在体外极显著增殖(P<0.01);与对照组
相比 ,PAP 以不同浓度(50 ～ 400 mg/ L)处理小鼠脾淋巴细胞后一氧化氮分泌量均显著升高(P<
0.05)。试验结果表明 ,蕨麻多糖能明显促进体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖和分泌一氧化氮 ,与
ConA 或 LPS 有协同作用。
关键词:蕨麻多糖;淋巴细胞;增殖;一氧化氮
中图分类号:S 853.7:R 446.62　文献标识码:A　文章编号:1000-6419(2005)09-0735-04
Effect of Potentilla anserine polysaccharide on proliferation of
splenic lymphocytes and production of nitric oxide in mice
CHEN Jiong-ran , HU Ting-jun , CHENG Fu-sheng , MENG Ju-cheng , GAO Fang
(Lanzhou Institute o f Animal Science and Veterinary Pharmaceutics , Chinese Academy of
A gricultural Sciences , Lanzhou 730050 , China)
Abstract:In o rder to evaluate the mechanism of immune modulation of Potenti l la anserine
po ly saccharide(PAP), the pro li feration and secre tion of nit ric oxide w ere observed in v it ro in
murine splenic lymphocy tes t reated wi th dif ferent PAP concentrations o f 0 ,50 ,100 ,200 ,400mg/L
respectively .Results w ere as fol low s.The cells t rea ted w ith ConA or LPS togethe r w ith 50mg/L
of PAP proliferated significant ly(P <0.05), the cells t reated w ith ConA or LPS together wi th
PAP ranging f rom 100 mg/L to 400 mg/L pro li ferated very significant ly in a concentration de-
pendent manne r , and the secretion of ni tric ox ide f rom the cells t reated wi th dif fe rent concentra-
tions of PA P raised markedly , compared wi th normal contro l.The results show ed that PAP can
st imulate pro liferation of splenic lymphocy tes in v itro in a concentrat ion dependent manner and
increase production of nit ric oxide.
Key words:Potenti l la anserine poly saccharide;lymphocyte;prolife ration;nit ric oxide
　　蕨麻为鹅绒委陵菜(Potent i lla anserine)的根 ,
属蔷薇科委陵菜属 ,又名委陵菜 、曲尖委陵菜 、人参
果 、延寿草 、戳玛 、卓老洒曾 、仙人果等。在青藏高原
有非常广泛的分布 ,其味道独特 ,口感细腻 ,并因具
有滋补 、治疗血症 、止咳利痰等作用而深受当地群众
的喜爱 , 《青海高原药物图鉴》就记载其为“常用上
药”[ 1] 。据报道 ,蕨麻具有较好的补益作用[ 2] ,对小
鼠抗疲劳和抗缺氧能力有一定增强作用[ 3] ,还有很
强的抗应激作用[ 4] , 且蕴藏量丰富 。蕨麻多糖
(Potent i lla anserine po lysaccharide , PAP)为蕨麻
活性成分之一 。虽然杨桦等[ 5] 从蕨麻中提取分离出
了多糖成分 ,并测定了总糖含量 ,但有关蕨麻多糖生
收稿日期:2005-05-26;修回日期:2005-07-26
基金项目:国家自然科学基金项目(30371056)
作者简介:陈炅然(1968 ), 女 ,辽宁沈阳人 , 副研究员 , 博士生 , 现从事中药药理研究工作 , E-mail:chenjiong ran@yahoo.
com.cn
中国兽医科技　2005 , 35(9):735-738
Chinese Journa l of Veterinary Science and Techno log y
物活性方面的研究报道甚少。因此 ,提取分离蕨麻
多糖 ,探讨其免疫调节机理 ,可为它的进一步应用奠
定基础。
1　材料
1.1　药品
蕨麻多糖为灰白色粉末 ,易溶于水 ,不溶于乙
醇 、丙酮 、乙醚等有机溶剂 。用时配制为 4 g/L 生理
盐水溶液 ,高压灭菌后备用。
1.2　试剂及仪器
细胞培养基 RPM I 1640 培养液 、2-巯基乙醇 、
伴刀豆球蛋白 A(ConA)、脂多糖(LPS)、二甲基亚
砜(DMSO)、噻唑蓝(MT T)和 Tris购自美国 Sigma
公司;萘乙烯二胺和对氨基苯磺酸购自美国丰特斯
公司 。犊牛血清购自兰州民海生物工程公司 。谷氨
酰胺 、氯化铵(NH 4Cl)、氯化钠(NaCl)、磷酸等均为
国产分析纯试剂 。试验用仪器主要有岛津 UV -
3000分光光度计 、酶联免疫吸附测定仪 、二氧化碳
培养箱和聚苯乙烯 96孔培养板。
2　方法
2.1　小鼠脾淋巴细胞的制备
BA LB/c纯系小鼠 (8周龄 ,体重 18 ～ 22 g ,雌
性)断椎处死后 ,取出脾 ,置消毒平皿中孔径 10 μm
尼龙膜上剪碎 ,以瓶塞轻磨;然后以 Hank s液冲洗
1次 ,用吸管收集冲洗液至离心管 , 1 000 r/min ,离
心 10 min ,弃上清液 ,加入 Tris-NH 4Cl(0.15 mol/ L
NH 4Cl , pH 7.4)溶解红细胞 , 2 000 r/min离心 10
min ,弃上清;用 Hank s液洗 2次(1 000 r/min离心
10 min), RPM I 1640 洗 1次(1 000 r/min 离心 10
min),弃上清 ,加 RPM I 1640 完全培养基(由 100
mL/L 犊牛血清 、1.0 mmol/ L 谷氨酰胺 、0.02
mmo l/L 2-巯基乙醇 、青霉素 100 IU/mL 、链霉素
100μg/mL 组成)。为除去吞噬细胞 , 将脾细胞
(5×106/mL)置皮氏培养皿中 37 ℃孵育 1 h ,收集
非贴壁的细胞。调整细胞浓度至 2×106/mL ,台盼
蓝染色 ,经测定细胞生存率大于 95%。
2.2　小鼠脾淋巴细胞体外增殖试验[ 6]
2.2.1　T 淋巴细胞增殖试验　取 2×106/mL 脾淋
巴细胞加入 96 孔培养板 , 调整细胞浓度为每孔
1×105 ,将其分为静息期细胞 、ConA 刺激细胞分别
进行试验 。静息期细胞分为 A 、B 、C 、D 、E 共 5组 ,
每组 10孔 ,A 、B 、C 、D组分别加入蕨麻多糖至终浓
度为 50 、100 、200 、400 mg/ L;E 组为对照组 ,加入同
体积的 RPM I 1640 培养液。ConA 刺激细胞分为
A 、B 、C 、D 、E 共 5 组 , 每组 10 孔 ,各组分别加入
ConA 至终浓度为 5 mg/ L , A 、B 、C 、D组分别加入
蕨麻多糖至终浓度为 50 、100 、200 、400 mg/ L;E 组
为对照组 ,加入同体积的 RPMI 1640培养液 。无论
是静息期细胞 ,还是 ConA 刺激细胞处理后置 37
℃、50 mL/L CO 2 培养箱孵育 44 h , 加入 20 μL
MT T (5 g/ L),继续培养 4 h , 2 000 r/min 离心 10
min ,弃上清 ,每孔加入 150μL DMSO ,静置 10 min
后于酶标仪测定其 D 570 nm值。
2.2.2　B淋巴细胞增殖试验　取 2×106/mL 脾淋
巴细胞加入 96 孔培养板 , 调整细胞浓度为每孔
1×105 ,将其分为 A 、B 、C 、D 、E 共 5组 ,每组 10孔 ,
各组分别加入 LPS至终浓度为 10mg/L ,A 、B 、C 、D
组分别加入蕨麻多糖至终浓度为 50 、100 、200 、400
mg/ L;E 组为对照组 ,加入同体积的 RPM I 1640培
养液 。置 37 ℃、50 mL/L CO 2 培养箱孵育 44 h ,加
入 20μL MTT (5 g/ L),继续培养 4 h , 2 000 r/min
离心 10 min ,弃上清 ,每孔加入 150μL DMSO ,静置
10 min后于酶标仪测定其 D570 nm值 。
2.3　小鼠脾淋巴细胞 NO生成量的测定[ 7]
用含 100 mL/L 小牛血清的无酚红 RPM I 1640
培养液调整小鼠脾淋巴细胞浓度为 8×106/mL ,接
种于 24孔培养板 ,每孔 1.0 mL 。将小鼠脾淋巴细
胞分为 A 、B 、C 、D 、E 共 5组 ,每组 10孔 ,A 、B 、C 、D
组为试验组 , 分别加入蕨麻多糖至终浓度为 50 、
100 、200 、400 mg/L;E 组为对照组 ,加入同体积的
RPM I 1640液 。各组均于 50mL/L CO 2 、37 ℃培养
24 h 后测定 D548 nm值 ,用以间接反映上清液中 NO
的含量 。
2.4　统计学处理
采用 t检验判断试验组与对照组之间的差异显
著性。
3　结果与分析
3.1　蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
与对照组相比 ,无论是对于 ConA 刺激的 T 淋
巴细胞 ,还是对于 LPS 处理的B淋巴细胞 ,50mg/L
蕨麻多糖能促使其在体外显著增殖(P <0.05);
100 、200和 400 mg/L 蕨麻多糖均能极显著地促使
其在体外增殖(P<0.01),结果详见表 1。试验结果
表明 ,蕨麻多糖对小鼠脾 T 、B淋巴细胞的体外增殖
有明显的促进作用 。
3.2　蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞体外分泌 NO的
影响
与对照组相比 ,50 、100 、200 、400mg/ L蕨麻多
736 中国兽医科技 第 35 卷
表 1　小鼠脾 T淋巴细胞和 B淋巴细胞体外增殖测定结果(n=10)
Table 1　The test results of splenic lymphocyte proliferation
组别
G roup s
蕨麻多糖浓度/(mg· L -1)
PAP concen trations
各种淋巴细胞的 D570 nm值
静息期细胞
Res tin g cell s
ConA处理细胞
T cells t reated w ith ConA
LPS处理细胞
B cel ls t reated wi th LPS
A 50 0.170±0.016 0.320±0.0261) 0.350±0.0281)
B 100 0.180±0.015 0.400±0.0232) 0.401±0.0252)
C 200 0.170±0.016 0.420±0.0202) 0.400±0.0192)
D 400 0.190±0.017 0.430±0.0212) 0.420±0.0232)
E(Cont rol) 0 0.150±0.011 0.200±0.017 0.220±0.018
1)与对照组相比 ,差异显著(P <0.05);2)与对照组相比 ,差异极显著(P <0.01)。表 2同。
1)T he data are signifi cant dif ference f rom th at in the cont rol(P <0.05);2)The data are very signifi can t dif ference f rom that in the con t rol
(P<0.01).The sam e as table 2.
糖能显著(P<0.05)促进体外培养的小鼠脾淋巴细
胞分泌 NO ,而各试验组之间无显著差异 。结果详
见表 2。
表 2　蕨麻多糖对小鼠脾淋巴细胞分泌 NO的影响(n=10)
Table 2　The ef fect of PAP on NO production of splenic lym-
phocytes
组别
G roup s
蕨麻多糖浓度/(mg· L -1)
PAP concen trations
D548 nm
A 50 0.173±0.0161)
B 100 0.177±0.0151)
C 200 0.160±0.0151)
D 400 0.176±0.0141)
E(Cont rol) 0 0.139±0.012
4　讨论
4.1　细胞增殖试验是测定免疫细胞功能的方法之
一。淋巴细胞受到各种因子刺激时会发生细胞增
殖。在细胞增殖过程中 ,细胞的代谢处于旺盛状态 。
细胞增殖需要大量的能量 ,以供合成各种大分子物
质和完成分裂过程。因此 ,细胞能量代谢的水平往
往可以间接反映细胞增殖情况 。Mosmann 根据这
一原理首创了 MT T 比色分析方法[ 8] 。本试验采用
该法测定小鼠体外 T 、B 淋巴细胞的增殖 , 灵敏
可靠 。
小鼠 T 淋巴细胞未经 ConA 刺激时处于 G 0期
(静止期)。ConA 可以诱导 T 淋巴细胞表达 IL-2
受体 ,使 T 淋巴细胞活化;也可以使 T 淋巴细胞从
G 0期进入 G1期(DNA 合成前期)。LPS 是 B 细胞
的丝裂原 ,直接刺激 B细胞发生有丝分裂 ,为 B 细
胞的多克隆激活剂[ 9] 。据梁中琴等[ 10] 报道 ,云芝多
糖能刺激人外周血淋巴细胞从 G 1期进入 S 期 ,并可
使 CD4 +细胞数量明显升高 ,CD4 +/ CD8 +细胞比例
增加。林志彬[ 11] 报道 ,灵芝多糖可通过间接激活淋
巴细胞中的 DNA 多聚酶促进 DNA 合成及 T 淋巴
细胞增殖。
本研究试验结果表明 ,蕨麻多糖(50 ～ 400
mg/ L)对未经 ConA 或 LPS 刺激的静息期细胞没
有明显的促增殖作用。然而对于 ConA 活化的小鼠
T 淋巴细胞 ,当蕨麻多糖浓度达到 50 mg/L 即能促
进增殖 ,表明两者有协同作用 。同样对于 LPS激活
的 B淋巴细胞 ,当蕨麻多糖浓度达到 50 mg/L 即能
促进细胞增殖。提示 ,蕨麻多糖对 T 、B 淋巴细胞
均具有促进有丝分裂的作用 ,是一种理想的免疫刺
激剂。
4.2　NO 是由 NO 合酶(NOS)催化 L-精氨酸(L-
A rg)末端胍基中的一个氮原子氧化而生成的 ,最初
确定为内皮细胞松弛因子 ,现已发现它为细胞内外
功能的介质 。在免疫细胞中 NO 是由诱导型 NO合
酶催化生成的 。NO 在炎症 、损伤和机体防御等方
面发挥着重要作用 ,在免疫系统中作为信号转导的
一种重要介质而起作用。正常情况下 ,哺乳动物体
内可连续产生少量 NO ,细胞因子刺激免疫细胞可
产生大量 NO。NO又可通过刺激 T 细胞不同亚群
来调节 Th细胞进一步分泌细胞因子 。NO 通过这
一网络使机体处于自稳态 。NO 的生成量不仅依赖
于 NOS ,而且依赖于底物 L-Arg 。NO 生成后能迅
速经生物膜和体液扩散到临近靶细胞 ,激活鸟苷酸
环化酶 ,进而使 cGMP 合成增加并发挥其第二信使
的化学作用 。从本试验结果可看出 ,蕨麻多糖能诱
导和激活脾淋巴细胞产生 NO ,细胞培养液中的 NO
水平明显高于对照组。提示 ,蕨麻多糖可通过刺激
免疫细胞产生 NO 增强其信号转导功能 ,并可通过
调节细胞的氧化还原状态影响细胞的生理功能 。
737第 9 期　 　 　　　　　　陈炅然等:蕨麻多糖对小鼠淋巴细胞增殖和一氧化氮分泌的影响
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