全 文 ：1　材料和方法
1.1　试验材料
1.1.1　大豆品种:大豆品种 1211、124 取自黑龙江省克山农
场;大豆品种 Osumi由欧盟西班牙塞维利亚大学提供。
1.2　土壤:采自黑龙江省富裕县和克山县。主要特点是:1 号
土壤采自富裕县 ,大豆产量 20kg ,前茬玉米;2 号土壤采自富裕
县 ,盐碱地 , 大豆产量 30—35kg , 前茬大豆;3 号土壤同 2 号土
壤 ,前茬玉米;4 号土壤采自富裕县 , 大豆产量 100kg;5 号地采
自克山县 ,大豆产量 120—150kg;6 号土壤采自克山县 ,大豆产
量 100kg。
1.3　培养基配方
1.3.1 　YMA:甘露醇 10.0g , K2HPO4 0.25g , KH2PO4 0.25g ,
MgSO4 0.20g , NaCl 0.10g , CaCO3 3.00g , 琼脂粉 15g , 蒸馏水
1000ml , pH 调至 6.8-7.0。
1.3.2　Fahraeus 无氮营养液(mg·L-1):Na2HPO4 150 , KH2PO4
100 ,MgSO4·7H2O 120 , CaCl2 100 , Fecitrate 5 , pH 6.5。
1.3.3　微量元素溶液(g·L-1):H3BO3 2.86 ,MnSO4·H2O 2.08, ZnSO4·7H2O 0.22 , CuSO4·5H2O 0.08 , Na2MoO4 0.11 , 加无菌水
至 1000mL ,使用时按 1.0 mg·L-1加入无氮培养基中。
2　试验方法
2.1　制作培养容器:内装蛭石的 500ml塑料杯 , 在杯底钻孔 ,
穿一条长约 10-15cm 的棉纱 , 然后在杯中装满蛭石 , 用牛皮
纸将杯口封好 ,置罐头瓶上使蛭石充分吸水后 ,将塑料杯和罐
头瓶一起放入灭菌锅中灭菌(1.5kg cm2 , 2.5h)备用。
2.2　种子催芽:选取饱满的豆种 ,经升汞和乙醇消毒后 , 用无
菌水洗涤 4—5遍 , 置无菌培养皿中 , 25℃下催芽。取上述备用
培养容器 ,用无菌刀割开牛皮纸封口 , 每个培养容器播种 1 粒
萌发的种子。
表 1　土样养分分析表
编号 pH值 速效氮(mg kg)
速效磷
(mg kg)
速效钾
(mg kg)
全氮
(g kg)
1 8.1 172.40 3.37 99.70 2.22
2 8.6 158.76 11.52 135.59 2.19
3 8.2 147.42 10.46 161.51 2.01
4 7.9 159.52 3.32 104.69 2.20
5 5.9 226.80 13.52 200.00 2.25
6 6.1 253.26 10.07 222.40 2.51
2.3　接种土壤悬液:称取 10g土样 , 倒入 90mL无菌水 , 振荡均
匀后制成 10 -1浓度的土壤悬液 , 用移液管吸取 10mL 土壤悬
液 ,加入另一个 90mL无菌水中 , 制成 10-2浓度的土壤悬液 , 依
此类推制成 10-3 、10-4 、10 -5共五个浓度梯度土壤悬液 ,分别加
入已经种好的豆种上 ,每个培养容器接种 1mL ,每个稀释度重
复 3次。
2.4　管理及结果观察:将培养容器放入温室中 , 保持罐头瓶
子随时有水。播种约 60d 后 , 将蛭石从培养容器中轻轻取出 ,
将大豆根部用水洗涤干净 , 观察根部的结瘤状况。
3　结果与讨论
首先分析了供试土壤的养分情况 , 分析结果见表 1。
在上述土样状况的基础上 , 共分 3 个试验组 , 即大豆品种
1211、124和 Osumi , 分离 6个土壤样品中的大豆根瘤菌。结果
是:Osumi 分离的大豆根瘤菌种类和数量明显高于 1211 和
124 , 现将上述 3个品种分离 6 个土壤样品的试验结果总结列
于表 2。
表 2　大豆品种 1211 、124和Osumi
分离供试土壤样品中根瘤菌情况表
土壤编号 每克土壤中的活菌数
1211 124 Osumi
1 4.2＊102 -5.1＊103 2.6＊102-3.7＊103 4.5＊103-4.1＊104
2 4.2＊104 -5.1＊105 2.7＊104-3.5＊105 3.1＊105-3.8＊106
3 4.2＊103 -5.1＊104 5.2＊103-4.8＊104 4.6＊104-6.1＊105
4 1.2＊104 -1.5＊105 2.4＊104-1.9＊105 4.2＊105-5.1＊106
5 3.1＊105 -3.8＊106 5.6＊105-4.9＊106 1.2＊106-1.5＊107
6 4.2＊103 -5.1＊104 4.6＊103-6.3＊104 1.2＊105-1.5＊106
　　在分离土壤中根瘤菌种质资源时 , 常常因为土壤的干扰
和大豆品种与根瘤菌的共生匹配问题而将很大一部分根瘤菌
遗漏掉[6 ,7] ,具有一种抗土壤干扰能力强 、与根瘤菌结瘤范围
广的大豆品种 , 成为从事研究的重要条件。通过本试验的研
究表明:Osumi与不同土壤中大豆根瘤菌的共生匹配性明显好
于对照大豆品种 , 可以分离出一般大豆品种不能分离出的大
豆根瘤菌 , 其分离的大豆根瘤菌种类和数量高于对照大豆品
种 1-2个数量级 , Osumi可以高效地分离土壤中大豆根瘤菌
种质资源。
参考文献:
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川八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究
郭仕平 ,蒋斌 ,苏莹珍 ,刘仕平 ,张玲琪(云南大学生命科学学院 ,云南 昆明 650091)
摘要:目的:从川八角莲中分离到产抗癌药物鬼臼毒素类似物的内生真菌。方法:采用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法
(HPLC)对内生真菌的发酵产物进行分析检测。结果:分离到 16 株内生真菌 , 其中一株真菌(2BNO1)产鬼臼毒素类似物 , 经鉴定
该真菌为牵连青霉(Penicillium implication)。结论:川八角莲个别内生真菌能产抗癌药物鬼臼毒素类似物。
关键词:川八角莲;内生真菌;牵连青霉;鬼臼毒素
中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)02-0055-03
收稿日期:2003-03-26;修回日期:2003-09-11
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39860005)
作者简介:郭仕平(1978-),男 ,江西万载人 , 硕士生 ,研究方向:微生
物制药。
　　鬼臼毒素及其类似物是合成多种抗癌药物的前体 , 其来
源多是从小檗科(Berberidaceae)鬼臼亚科(Podophylloideae)鬼臼
类植物中提取 ,但植物所含的抗癌活性物质在其体内含量一
般很低[ 1 , 2] , 靠采挖天然植物获取这些物质 , 不仅受到地理环
境和生态条件等因素的限制 , 而且过度采挖还可能导致该物
种的灭绝。而鬼臼毒素及其类似物的化学合成步骤较多[ 3] ,
合成难度大 ,全合成很不经济[ 4] 。到目前为止 ,细胞组织培养
法生产鬼臼毒素也尚未处于研究阶段 ,未能成功应用于生产。
因此 ,寻找鬼臼毒素及其类似物新的产生途径成为一个亟待
解决的问题。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重
要影响 , 一些真菌甚至会直接产生和其寄主相同或相似的生
理活性成分[5 ,6] 。近年来云南大学张玲琪教授所做的研究[ 7 ,8]
也证实了这一点。另一方面 , 真菌易于培养 , 生长周期短 , 可
以通过育种和优化培养条件等措施来提高其有效成分的含
量。故利用内生真菌发酵产抗癌药物前景十分广阔。作者从
川八角莲(Dysosma Veitchii)内生真菌的分离 、筛选及发酵产物
的分析方面进行初步探索 , 为今后利用内生真菌生产抗癌药
物提供基础。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　试剂与材料
新鲜川八角莲植株采自云南嵩明县 , 鬼臼毒素标准品购
自 SIGMA 公司。
1.1.2　培养基[ 9]
第 14卷第 2 期:55
2004 年 4 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.2:55
Apr.2004
马铃薯葡萄糖培养基(PDA), 查氏培养基 , 改良基本培养
基。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离
按常规无菌操作 ,取川八角莲地下茎 , 按下列程序表面消
毒:自来水冲洗※75%酒精漂洗(3 ～ 5s)※无菌水冲洗 4 次※
0.1%升汞漂洗(3～ 5min)※无菌水冲洗 5 次。
将上述处理过的茎段在超净工作台上剥除本质部 , 再剪
切成 0.5cm×0.5cm 小片 , 种植于 PDA平皿上 , 置 28℃温箱培
养 3～ 7d 后 , 即可见样品边缘有菌丝长出 , 经纯化后转接到
PDA斜面备用。
图 1　2BNO1的菌落形态
图 2　2BNO1的个体显微摄影图
图 3　2BNO1发酵产物与标准品鬼臼毒素HPLC色谱图
虚线———标准品鬼臼毒素;实线———2BNO1发酵产物
为了检查表面消毒是否彻底 , 做了对照实验。将上述同
样条件处理过的茎段不作切割直接种植于 PDA 平皿上 , 置相
同条件下培养。结果对照的茎段周围无任何菌长出 , 多次重
复均如此 ,证明所分到的菌是韧皮部的 , 而不是表面的附生
菌。
1.2.2　内生真菌的液体培养
液体培养基为改良基本培养基。 将 100mL改良的基本培
养基装于 250mL 的三角瓶中 , 每个菌号装 3 瓶 , 共 300mL , 灭
菌 ,挑适量菌丝或孢子接种于三角瓶中 , 置于 28℃摇床(108r
min)培养7d , 待菌丝体长好后进行提取。
1.2.3　产物的提取方法
将发酵液过滤 ,分别收集菌丝和滤液 , 然后将菌丝冷冻数
10min , 待凝固后充分研磨 、捣碎 , 以便菌丝内的物质充分释放
出来 , 再将已捣碎的菌丝加入到滤液中混合 , 加等量氯仿 , 萃
取过夜 ,取有机溶剂层蒸馏浓缩至 2mL左右 , 置于洁净的密封
小瓶中备用。
1.2.4　产物的薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)检测
薄层层析预制板购自青岛海洋化工厂。采用 V(氯仿):V
(乙酸乙酯)=8:2 作展开剂。显色剂采用 V(浓硫酸):V(乙
醇)=1:1 , 100-105℃, 5min。
HPLC检测之前 , 先将样品纯化。将制备好的提取物及标
准样品各点样在两张相同的薄层层析板上 ,同时进行 TLC , 但
只对标准品进行显色 , 将标准品显色的相对应位置处的样品
层析板上的硅胶刮下 , 再用氯仿萃取 , 滤去硅胶粉后 ,蒸馏至
2mL左右备用。
HPLC分析 , 仪器:Waters207 型高效液相色谱仪 , 紫外分光
检测器(UV—481);色谱条件:色谱柱(10μm , 300mm×3.9mm i.
d),流动相 V(CH3CN):V(H2O)=50:50 ,流速 1.0mL min , 检测
波长 254nm。
2　结果与讨论
2.1　川八角莲内生真菌 2BNO1 的形态特征
从川八角莲地下茎中分离到 16 株真菌 ,其中菌株 2BNO1
的发酵产物中含有鬼臼毒素类似物 , 该菌株经鉴定[ 10 , 11] 为牵
连青霉(Pencillium implication)。 2BNO1的菌落在查氏培养基上
质地致密 , 绒状;菌丝无色;培养基呈深红褐色;分生孢子梗主
要由基部生出 , 短 ,大多在 100μm 以下 ,直径 2-2.5μm ,帚状枝
单轮;分生孢子小梗密集 , 大小为 10-15×2-2.5μm;分生孢
子椭圆至亚球形 ,大小为 2.5-3.5×2-2.5μm。 2BNO1 的菌
落形态和个体显微摄影图分别如图 1 和图 2。
2.2 菌株 2BNO1 发酵产物中鬼臼毒素类似物的测定结果
通过 TLC 分析 ,发现 2BNO1 发酵产物与标准品鬼臼毒素
有相同的 Rf值。为进一步核实所得结果 ,对 2BNO1 的发酵产
物进行 HPLC 检测 ,结果见图 3。图 3 表明 2BNO1 发酵产物在
前述色谱条件下与标准品鬼臼毒素在同一保留时间处出现相
同的波峰 ,进一步说明 2BNO1 发酵产物中含有鬼臼毒素类似
物。
2.3　川八角莲内生真菌产鬼臼毒素或其类似物的机制的可
能性分析
内生真菌与其宿主植物由于长期的共同生活 , 因而关系
十分密切。它们具有内共生理论认为 , 次生代谢过程中生物
化学途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中 , 其基
本的生化过程信息有时还会传递到其它生物中去 , 在共生体
内 , 一旦次生代谢中有用生化途径出现 ,它就能被其它生物利
用 , 表现出相互作用和“ 协同进化”(Co-evolution)[12] 。 因此 ,
宿主植物体内个别内生真菌产生与宿主相同或相似的生理活
性成分可能是由于两者长期共生关系导致宿主将其遗传物质
或信息传递给其内生真菌 , 使之具有与宿主相同或相似的代
谢途径。
从测定结果看 , 菌株 2BNO1 的液体培养物中含有鬼臼毒
素类似物 , 但其含量很低。今后 , 我们将着手纯化代谢产物 ,
以便用质谱做进一步鉴定 , 同时 , 还将深入探索菌株的发酵条
件和工艺。
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假单胞菌发酵液提高原油采收率的研究
窦春梅1 , 2 ,李清心2 ,张惠殊1 , 2(1.大庆油田有限责任公司第四采油厂 ,黑龙江 大庆 163511;2.山东大学微生物技术国家重点实验室 , 山东 济南 250100)
摘要:筛选得到了一株假单胞菌 D-1 , 其发酵液具有很高的表面活性 , 浓度为 10%的发酵液的表面张力为 45mN m 左右 , 则
将其发酵液作为一种生物表面活性剂。经实验确定了发酵培养基的最适配方。在室内条件下 , D-1 的发酵液不仅能提高实验
岩芯内原油的采收率 10%左右 , 而且对原油 2的防蜡率可以达到 60%左右 , 因此 , D-1 在油田应用中会有很大的潜力。
关键词:假单胞菌;发酵液;表面活性;提高原油采收率
中图分类号:TE355.9　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)02-0057-02
收稿日期:2003-07-19;修回日期:2003-11-27
作者简介:窦春梅(1969-),女 ,硕士生 ,工程师 ,从事三次采油研究及
现场试验工作。
　　传统的一次 、二次采油后 , 仍然有大量的石油贮藏于地
下[ 1] 。三次强化采油技术中使用的化学合成表面活性剂 , 价
格昂贵且不可生物降解。而生物表面活性剂不但具有表面活
性剂的性质 ,且无毒 、可生物降解[ 2] , 因此 , 利用微生物产生的
表面活性剂提高原油采收率有很好的应用前景[3] 。
有关生物表面活性剂菌株的筛选及生物表面活性剂的分
离纯化已有报道[ 3 ,4] , 将分离纯化后的生物表面活性剂用于提
高采收率 ,不利于节约成本。将菌体的发酵液作为一种生物
表面活性剂直接使用 , 既方便又经济。作者简单介绍了一株
产生生物表面活性剂菌株的分离 、培养基确定以及在室内条
件下其发酵液提高原油采收率的研究情况。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种来源:分离于长期被原油污染的土壤中的一株假
单胞菌 D-1(Pseudomonas sp.D-1)。原油为某油田不同区块
原油 ,标号分别为 1 、2、3 ,粘度分别为 67.6、85.0、120mPa·s。
1.1.2　种子培养基:LB培养基[ 5] 。
1.1.3　筛选培养基:参照文献[ 6] , 并加以修改:葡萄糖 20g , 蛋
白胨2g ,羊血 5g , Na2HPO4 2g , KH2PO4 2g ,MgSO4 0.5g , CaCl2 0.
005g , pH 7.2 ,用蒸馏水定容至 1L。
1.1.4　实验仪器承德产 JYZ-200 型表面张力仪。
1.2　方法
1.2.1　菌种筛选:取土样 , 稀释后用涂平板或平板划线的方法
接种于筛选培养基中 ,置于 30℃的条件下培养 2-3d 后 , 观察
菌落周围是否出现溶血圈 , 取溶血圈较大的菌落做进一步实
验。
1.2.2　生物表面活性剂性能的检测:将菌体接种于发酵培养
基中培养后 ,取发酵液于 5000r min 离心 10min ,取上清液用蒸
馏水稀释 10倍后 , 再用表面张力仪检测发酵液的表面张力。
1.2.3　室内岩心驱油实验[7] :人工制得的岩芯用原油饱合后 ,
记下饱合油体积A 、A , 再将岩芯置于 45℃条件下 , 先用 pH 6.
5 左右的 1000ppm NaCl 溶液驱至岩芯出口驱出液含水量为
50%,此时实验岩芯改注稀释的发酵液代替水驱 , 而对照岩芯
仍继续用水驱 ,分别记下此时的注入压力 P , P ,在整个实验过
程中适当改变注入压力 , 以保证岩芯出口处液体的流量为
1mL h。当实验岩芯的驱出液含水量为 99%时 , 记下驱出的油
量 B、B , 同时记下结束时的注入压力 P1 , P1 。则 D-1 提高
原油采收率为(B A-B A )×100%, 注入压力的降低率为
(P P- P1 P1)×100%。
2　结果
2.1　菌种的筛选结果
从长期被原油污染的土壤中取样 , 稀释后接种于筛选培
养基上进行筛选 , 得到了 20 余株有溶血圈的菌株 , 选取溶血
圈直径与菌落直径之比最大的菌株 D-1做进一步实验。 D-
1 在 LB 琼脂培养基上培养 24h 后的菌落形态为圆形 、半透明 、
表面光滑 、略有凸起 、边缘整齐 、无色素 、菌落大小约为 1.4 ～
1.7mm ,显微镜观察此菌为杆状。此菌在 pH 值为 4.5-9.0 之
间生长良好 , 淀粉水解酶 、过氧化氢酶 、细胞色素氧化酶阳性 、
明胶反应阳性 、甲基红反应阳性 、吲哚 、尿酶反应阳性 、不产生
H2S 、能够利用甘露糖 、葡萄糖 、乳糖和果糖 ,初步鉴定为假单
胞菌属(参照《简明第八版伯杰氏细菌鉴定手册》)。
2.2　D-1 在发酵培养基中培养时 ,其发酵液表面张力的变化
将 D-1接种于发酵培养基中 ,置于 30℃、120r min 的摇床
上培养 , 每隔 2h取样检测发酵液的表面张力变化(图 1)。
图 1　D-1在生长过程中发酵液表面张力的变化
图 2　培养基的初始 pH 对发酵液表面张力的影响
图 3　培养基的装液量对发酵液表面张力的影响
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BIOTECHNOLOGY
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