全 文 ：• 2380 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年6月第31卷第6期 CJTCMP , June 2016, Vol . 31, No. 6
·研究报告·
漆姑草醇提物对人白血病细胞株HL-60细胞凋亡
相关蛋白表达的影响
梁冰1,2，周磊1，李淑芳1，沈祥春1,2
（1贵州医科大学药理学教研室，贵阳 550025；2环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室，
贵阳 550025）
摘要：目的：研究漆姑草醇提物（HSJ）对人白血病细胞株HL-60细胞凋亡相关蛋白表达的影响，探讨其诱
导凋亡的分子机制。方法：采用不同浓度的HSJ作用HL-60细胞后，Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡形态
变化；Western blot法检测Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：HSJ作用后HL-60细胞出现浓染致
密的颗粒状荧光及明显的核形态变化；与阴性对照组相比，凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达水平增高，
Bcl-2/Bax蛋白的比值降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：HSJ能诱导HL-60细胞凋亡，其作用可能与降
低Bcl-2/Bax蛋白的比值，增加Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平有关。
关键词：漆姑草；HL-60细胞；细胞凋亡；Caspase家族；Bcl-2家族
基金资助：贵州省教育厅自然科学研究项目[No.黔教科（2010033号）]
Effects of Herba Saginae Japonicae alcohol extract on related to apoptosis protein of
human leukemia cell line HL-60
LIANG Bing1,2, ZHOU Lei1, LI Shu-fang1, SHEN Xiang-chun1,2
( 1Department of Pharmacology Staff Room, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China; 2Key Laboratory of
Environment Pollution and Disease Control and Monitoring, Ministry of Education, Guiyang 550025, China )
Abstract: Objective: To research the effect of Herba Saginae Japonicae (HSJ) alcohol extract on related to apoptosis
protein of human leukemia cell line HL-60, and to explore mechanism underlying inductive apoptosis. Methods: HL-60 cells were
treated by different dosages of HSJ. Hoechst 33258 fluorescent staining was used to detect apoptosis morphological changes.
Western blot was used to detect the protein expression of Caspase-3, Caspase-9, Bcl-2 and Bax. Results: HL-60 cells processed
by HSJ had been stained with condensed and dense fluorescence and showed obvious nuclear morphological changes. Compared
with the control group, the expression level of apoptosis related to proteins including Caspase-3, Caspase-9 in the treatment group
was increased, while the ratio of Bcl-2 to Bax was decreased. The difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion:
HSJ could induce the apoptosis of HL-60 cells, which might be related to a decrease of the ratio of Bcl-2 to Bax and an increase of
Caspase-9 and Caspase-3 protein expression.
Key words: Herba Saginae Japonicae; HL-60 cells; Apoptosis; Caspase family; Bcl-2 family
Funding: Natural Science Research Project of Guizhou Provincial Education Bureau [No.(2010033)]
通讯作者：梁冰，贵州省贵安新区大学城贵州医科大学药理学教研室，邮编：550025，电话：0851-88174012，E-mail：bliang163@163.com
白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，在儿科恶性肿瘤
中发病率较高，化学治疗仍是该病最重要和最基本的治疗方法
和手段。白血病发病机制的研究发现，白血病的发生与细胞增
殖失控、分化障碍、凋亡受阻等有关[1-2]。其中，广泛认为白血病
细胞的恶性克隆性增殖是细胞凋亡发生异常所致，诱导白血病
细胞凋亡成为治疗白血病的新途径[3]。漆姑草为石竹科植物漆
姑草[Saginajaponica（SW1）Ohwi]的全草，是民间治疗白血病的
草药，分布于贵州、江苏、四川、湖南、湖北、云南等地。临床曾
有以其水煎剂为主治疗急慢性白血病获得良好治疗效果的研
究报道[4]，但其相关基础研究鲜有报道。本课题组前期研究发
现，其能抑制人慢性髓细胞性白血病急变期细胞株K562细胞
的增殖和诱导该细胞的凋亡[5]。在此基础上，为进一步观察漆
姑草对人急性白血病细胞株的影响，本研究以人早幼粒急性白
血病细胞株HL-60为研究对象，观察漆姑草是否能诱导该细胞
凋亡并探讨其作用的分子机制，为漆姑草的研究开发及临床应
用提供实验依据和理论指导。
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材料
1．药品与试剂 漆姑草：购于贵阳市药材市场，经贵州医
科大学龙庆德教授鉴定后，以全草入药；HL-60人白血病细胞
株，购于中科院上海细胞库；RPMI1640培养基和胎牛血清，
BCA蛋白定量试剂盒、兔抗人Caspase-3 、Caspase-9、Bcl-2、
Bax多克隆抗体均为美国Bioworld公司产品。
2．主要仪器 XP-75型倒置荧光显微镜（OLYMPUS，日
本）；Gel Doc 2000凝胶成像分析系统（美国Bio-RAD公司）
方法
1．漆姑草醇提物（HSJ）醇提物的制备 取适量漆姑草药
材，打成粉末，95%的乙醇浸润过滤，水浴法蒸馏成一定量的液
体，乙酸乙酯萃取，将所得液体过柱。得到液体在烘箱中烘干，
得到深褐色固体物质。取适量配成20mg/mL母液，经0.22μm微
孔滤膜过滤，-20℃贮存备用。用前用无血清培养基稀释至所
需浓度。
2．HL - 60细胞的培养、分组及给药 以10 4/mL浓度将
HL-60细胞接种于96孔培养板中，受试药物组分别加入HSJ，药
物终浓度分别为4、20、100μg/mL，同时设不含药物的阴性对
照组和等体积的培养基空白对照组，每组设3个复孔。
3．Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡 HL-60细胞经
HSJ作用48h后，离心收集细胞，加入0.5mL固定液固定10min，
2 000r/min离心5min，PBS漂洗两遍，Hoechst 33258染色5min，PBS
洗两遍，滴加适量的抗荧光淬灭封片液，置于倒置荧光显微镜
上，激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，观察并拍照[5]。
4．Western blot检测凋亡相关蛋白的表达 HL-60细胞经
HSJ作用48h后，收集各组细胞，离心，PBS漂洗，加入蛋白提取
缓冲液裂解细胞，离心收集蛋白，测定蛋白浓度。取在100℃
下灭活变性的蛋白用12%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS -
PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白转移至PVDF膜上，
用含有5%脱脂奶粉的TBST在摇床上封闭1.5h。分别置于封闭
过的PVDF膜于1∶500稀释的Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2
单克隆抗体中，4℃摇床过夜。TBST洗膜3次，每次10min；然后
将PVDF膜放入1：10 000稀释的通用型二抗中，室温振荡孵育
1.5h；TBST洗膜，每次10min，洗3次；ECL化学显色，以β-actin
为内参照。应用Image-Lab图像分析系统，分析上述Caspase-3、
Caspase-9、Bax、Bcl-2的Western blot条带的阳性信号，取积分光
密度（IOD）值，分别与内参β-actin条带的阳性信号的积分光密
度值对比，分别取两者的比值，所得数据进行一元方差分析。
5．统计学方法 应用统计软件SPSS 17.0，计量资料多组
间比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1．HSJ对HL-60细胞凋亡形态的影响 经Hoechst 33258荧
光染色后，镜下可见阴性对照组细胞核形态规则且染色均匀，
而HSJ各剂量组细胞胞核固缩，可见浓染致密的颗粒状荧光及
明显的核形态变化，见图1。䱤ᙗሩ➗㓴 վࡲ䟿㓴ѝࡲ䟿㓴 儈ࡲ䟿㓴
图1 HSJ对HL-60细胞凋亡形态的影响（Hoechest 33258荧光
染色法×400）
阴性对照组 HSJ低剂量组
HSJ中剂量组 HSJ高剂量组
2. HSJ对凋亡相关蛋白表达的影响 与阴性对照组相比，
HSJ高、中、低剂量组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平显著
增加（P<0.05），HSJ高、中剂量组Bcl-2/Bax蛋白比值显著降低
（P<0.05），见表1，图2。䱤ᙗሩ➗㓴 վࡲ䟿㓴 ѝࡲ䟿㓴 儈ࡲ䟿㓴
17.35KD Caspase-3
45KD β-actin
1 2 3 4
1 2 3 4䱤ᙗሩ➗㓴 վࡲ䟿㓴 ѝࡲ䟿㓴 儈ࡲ䟿㓴
48KD Caspase-9
45KD β-actin
1 2 3 4䱤ᙗሩ➗㓴 վࡲ䟿㓴 ѝࡲ䟿㓴 儈ࡲ䟿㓴
26KD Bcl-2
45KD β-actin
1 2 3 4
17.35KD
48KD
26KD
24KD
45KD
45KD
45KD
45KD
Caspase-3
Caspase-9
Bcl-2
Bax
β-actin
β-actin
β-actin
β-actin
䱤ᙗሩ➗㓴 վࡲ䟿㓴 ѝࡲ䟿㓴 儈ࡲ䟿㓴
24KD Bax
45KD β-actin
图2 HSJ对Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响
注：1. 阴性对照组；2. HSJ低剂量组；3. HSJ中剂量组；4. HSJ高
剂量组。
表1 HSJ对Caspase-3，Caspase-9和Bcl-2/Bax蛋白
表达水平的影响（x-±s，n=3）
组别 Caspase-3 Caspase-9 Bcl-2/Bax
阴性对照组 0.54±0.09 0.51±0.15 1.23±0.07
HSJ高剂量组 1.12±0.18* 1.08±0.15* 0.24±0.07*
HSJ中剂量组 0.84±0.06* 0.92±0.28* 0.55±0.06*
HSJ低剂量组 0.79±0.16* 0.81±0.14* 1.01±0.05
注：与阴性对照组比较，*P<0.05。
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讨论
随着医疗技术的进步, 曾被认为是“不治之症”的白血病在
治疗方面取得了较大的突破与进展。其中，利用凋亡相关基因
在凋亡过程中的不同作用来设计新的治疗方案或药物成为白
血病治疗学的热点之一。荧光染色是细胞凋亡形态学检测方法
之一。Hoechst 33258是一种特殊的荧光染料，它能够穿透细胞
膜对DNA进行染色，并且发出强烈的蓝色荧光，而坏死细胞不
被染色[6]。本研究观察到，经Hoechst33258荧光染料染色后，阴
性对照组细胞的胞核形态规则且染色均匀，而经漆姑草作用后
的细胞胞核发生固缩，可见浓染致密的颗粒状荧光和明显的核
形态变化，提示漆姑草能够诱导HL-60细胞凋亡。
Caspase家族与Bcl-2家族是细胞凋亡过程中的重要调控因
素[7-8]，二者在调控细胞凋亡的过程中又互相调节。Caspase家族
是促细胞凋亡的酶类，其家族成员中的Caspase-3和Caspase-9
分别是凋亡级联反应的执行者和起始者。细胞凋亡的途径中，
起始因子虽各不相同，但最终都会在Caspase-3会合而引起细
胞结构蛋白质水解，导致细胞凋亡的发生。因此Caspase-3通
常被认为是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Caspase-9
是Caspase家族中另外一个很重要的成员，主要参与细胞凋
亡的线粒体途径。Caspase-9酶原经蛋白酶水解成大小亚单
位后，在细胞色素C以及凋亡因子1（Apaf-1）、dATP的参与下
形成有活性的多聚体，并促使Caspase -9进一步激活其他的
Caspase。Caspase-9的出现常被认为是导致细胞不可逆死亡的
关键环节。本研究Western blot结果显示，漆姑草醇提物作用
48h后，Caspase-3和Caspase-9蛋白表达增加，表明漆姑草诱导
HL-60细胞凋亡与Caspase家族有关，通过激活Caspase-9，增加
Caspase-9的活性，进而促进Caspase-3的活化，使得半胱氨酸蛋
白酶级联反应增强，引起HL-60细胞凋亡。
在细胞凋亡中，Bcl-2和Bax是重要的调节凋亡的基因蛋白[9-10]，
其中Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促进凋亡并起抑制Bcl-2的作用，
二者的比例决定细胞接受凋亡信号后的存活与否。Bcl-2和Bax
也是Caspase途径上游的调控机制，二者的表达水平能有效调
节Caspase-9和Caspase-3的激活和细胞凋亡。Bcl-2和Bax可以
以同源二聚体形式存在，也可以以异源二聚体形式存在，其中
异源二聚体与抑制凋亡作用密切相关。Western blot结果显示，
HL-60细胞经漆姑草作用后Bcl-2/Bax比率减小，提示漆姑草醇
提物能使Bcl-2/Bax异源二聚体的形成减少，从而发挥促细胞凋
亡的作用。
综上所述，漆姑草具有诱导HL-60细胞凋亡的作用，其作
用与激活Caspase-3和Caspase-9蛋白以及下调Bcl-2/Bax蛋白比
值有关。本研究为漆姑草的创新药物研制及临床应用提供了实
验依据。
参 考 文 献
[1] Roy S,Banerjee B,Vedasiromoni J R.Cytotoxic and apoptogenic
effect of Swietenia mahagoni (L.)Jacq.leaf extract in human
leukemic cell lines U937,K562 and HL-60.Environ Toxicol
Pharmacol,2014,37(1):234-247
[2] Rubio V,Calviño E,García-Pérez A,et al.Human acute
promyelocytic leukemia NB4 cells are sensitive to esculetin
through induction of an apoptotic mechanism.Chem Biol Interact,
2014,220C:129-139
[3] Dive C,Evans C A,Whetton A D.Induction of apoptosis-new targets
for cancer chemotherapy.Semin Cancer Biol,1992,3(6):417-427
[4] 薛惠彰.漆姑草为主治疗急性非淋巴细胞M2b白血病型1例.
中国中西医结合杂志,1994(12):717
[5] 梁冰.王雷鸣,周磊,等.漆姑草诱导人白血病细胞株K562凋亡
的实验研究.中华中医药杂志,2014,29(2):571-573
[6] 魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学.4版.北京:人民卫生
出版,2010:264-265
[7] Huber K L,Ghosh S,Hardy J A.Inhibition of caspase-9 by stabilized
peptides targeting the dimerization interface.Biopolymers,
2012,98(5):451-465
[8] Ku B,Liang C,Jung J U,et al.Evidence that inhibition of BAX
activation by BCL-2 involves its tight and preferential interaction
with the BH3 domain of BAX.Cell Res,2011,21(4):627-641
[9] Chen J H,Cao J L,Chu Y L,et al.T-2 toxin-induced apoptosis
involving Fas,p53,Bcl-xL,Bcl-2,Bax and caspase-3 signaling
pathways in human chondrocytes.J Zhejiang Univ Sci B,
2008,9(6):455-463
[10] Joslyn K B,Anthony L.Control of mitochondrial apoptosis by the
Bcl-2 family.Cell Sci,2009,122(4):437-441
（收稿日期：2015年1月28日）