全 文 ：　[ 收稿日期] 2002-05-22　　[ 修回日期] 2002-07-12
＊[ 基金项目] 国家自然科学基金项目(No.39870900);广东
省重点学科基金资助项目(No.9306);广东省科委重大科技
攻关项目(No.9622007-002)
Tel:0759-2388582-6;E-mail:hechengwei@gdmc.edu.cn
■通讯作者 0759-2388501;E-mail:ncliang@gdmc.edu.cn
[ 文章编号] 　1000-4718(2002)09-1025-04 ·论　著·
钙离子在半边旗提取物 6F的细胞毒及诱导
HL-60细胞 DNA片段化中的作用＊
何承伟1 , 　梁念慈2■ , 　莫丽儿3 , 　李金华1 , 　张　晓1
(广东医学院 1生物化学与分子生物学研究所 , 2广东省天然药物研究与开发实验室 , 3化学教研室 ,广东 湛江 524023)
　　[ 摘　要] 　目的:研究蕨类植物半边旗提取物 6F 对 HL-60 细胞内游离钙浓度([ Ca2+] i)及 Bcl-2 蛋白表达
的影响 , Ca2+与 6F细胞毒作用及诱导细胞 DNA 片段化的关系。 方法:用荧光探针 Fura-2/ AM 标记细胞内游离
Ca2+ ,在荧光分光光度计上测[ Ca2+] i;流式细胞仪检测 Bcl-2 的表达;噻唑蓝(MTT)法测定细胞成活率;二苯胺法
测 DNA 片段化形成率。结果:6F 作用后 ,HL-60 细胞内[ Ca2+] i 显著升高 , 呈明显的时间剂量效应关系;6F 降低
Bcl-2 的表达;于培养基中加 2 mmol/L Ca2+、或加 1 mmol/L EDTA 络合细胞外钙 , 或加 4 μmol/ L钙通道 A23187升高
细胞内钙浓度 ,均可增强 6F 的细胞毒作用 , 但均不影响 6F诱导细胞 DNA 片段化程度。加入 250μmol/L Zn2+可显
著降低6F 所致 DNA 片段化率 ,并可增强 6F 的细胞毒作用。结论:化合物 6F 可显著升高 HL-60 细胞[ Ca2+] i ,推
测与 6F降低Bcl-2的表达有关;6F 诱导HL-60 细胞 DNA 片段化可能是通过 Ca2+-非依赖性 DNA 酶的作用所致。
[ 关键词] 　HL-60 细胞;钙;Bcl-2;DNA;半边旗
　　[ 中图分类号] 　R363　　　　　[ 文献标识码] 　A
　　蕨类植物半边旗提取物 6F 具有强烈的细胞毒
作用并可增强多种常用抗肿瘤药物的活性[ 1 ,15] ,诱
导HL -60细胞凋亡 ,使 DNA 片段化率达 70%[ 2] 。
1984年 ,Cohen等[ 3]观察到糖皮质激素诱导的胸腺细
胞凋亡[ Ca2+] i持续升高 ,并认为 Ca2+在调控细胞凋
亡方面可能起重要作用。进一步的研究发现 ,多种
因素引起的细胞凋亡其[ Ca2+] i确有不同程度升高。
许多文献报道人为地升高[ Ca2+] i可诱导细胞凋亡。
Jiang 等用 Ca2+ -ATPase 抑制剂 thapsigargin 升高
[Ca2+] i诱导了胸腺细胞凋亡 ,并可被细胞外 Ca2+络
合剂 EGTA 及细胞内 Ca2+络合剂 BAPTA -AM 抑
制[ 4] 。而用地塞米松或拓扑异构酶 Ⅱ抑制剂 VM -
26诱导胸腺细胞凋亡却不见有[ Ca2+] i 的升高[ 5] 。
提示[Ca2+] i升高不是凋亡的普遍现象。Kluck等[ 6]
认为 ,Ca2+平衡的破坏才是钙调控细胞凋亡的方式 ,
细胞内钙池的消耗及由此而导致的细胞内外 Ca2+的
重新分布作为信号触发细胞凋亡。本研究检测化合
物6F 对HL-60细胞[Ca2+] i及 Bcl-2表达的影响 ,
升高和降低细胞内外 Ca2+对 6F 的细胞毒作用及诱
导DNA片段化的影响 ,以探讨 6F 抗肿瘤作用的机
制。
材　料　和　方　法
1　受试药物
　　化合物 6F(化学命名及结构见参考文献[ 1])由
本所药物化学室提纯鉴定 。
2　主要化学试剂
　　RPMI-1640培养基(Gibco 公司),小牛血清(杭
州四季青生物材料公司),噻唑蓝(MTT ,Serva公司),
二苯胺 、Fura-2/AM 及钙通道 A23187均为 Sigma 公司
产品 ,抗 Bcl-2鼠抗人单克隆抗体及异硫氰酸荧光
素(fluorescein isothiocyanate , FITC)标记的羊抗鼠二抗
为北京中山生物技术公司产品 。其它化学试剂均为
国产分析纯 。
3　细胞培养
　　HL-60细胞(购自中国科学院上海细胞生物学
研究所细胞库)在含 10%(v/v)灭活小牛血清 、
100 000 U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 RPMI -
1640完全培养基中 ,于 37℃, 5%CO2饱和湿度孵箱
内培养 。
4　受试药物的配制
　　化合物 6F 用 DMSO配制 ,分装冻存 ,临用前用
RPMI-1640培养基稀释成所需浓度 。处理细胞时 ,
DMSO的最终浓度小于0.1%(v/v),实验表明该浓度
对细胞的生长没有影响。
5　[ Ca2+] i测定
　　收集 2×106细胞 ,用培养基洗 1次 ,重悬于 0.5
·1025·中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2002 , 18(9):1025-1028
mL 含 20mmol/L Hepes(pH 7.4),20 g/L BSA的Han-
ks buffer(buffer A)中 , 加 5 μmol/L Fura -2/AM , 于
37℃孵箱中负载1 h ,用 buffer A洗涤 2次以去除细胞
外游离的 fura-2/AM ,并重悬于 2 mL buffer A 中 ,用
双波长荧光分光光度计(美国 Perkin Elmer)依次测
R、Rmax、Fs 、Rmin及 Fo 。细胞内游离 Ca2+浓度按下
式计算:[Ca2+] i =Kd×(Fo/Fs)×(R-Rmin)/(Rmax
-R)。
6　DNA片段率测定
　　于 2 ×106 细胞中加 0.5 mL 低张裂解液(10
mmol/L Tris-Cl pH 7.5 , 1 mmol/L EDTA , 2.5 g/L
Triton X-100), 13 000×g 离心 10 min(4℃),获沉淀
和上清两部分 ,沉淀加0.5mL 的低张裂解液 ,二者均
加0.125 mL 50%(v/v)三氯醋酸 , 4 ℃过夜 , 13 000×
g 离心 4 min ,去上清 ,加 0.2 mL 5%(v/v)三氯醋酸
于沉淀中 ,90℃水浴 10 min , 13 000×g 离心 4 min ,
取上清100μL , 加200μL 二苯胺试剂(二苯胺 1.5 g ,
浓硫酸 1.5 mL , 乙醛 8 μg ,溶于 100 mL冰醋酸中),
30℃水浴 16 h ,在酶标仪上测 A590。DNA片段率=
[ A590] 上清/[ A590] 上清+沉淀 ×100%。研究表明[ 7] , 此
方法所得结果与 DNA琼脂糖凝胶电泳结果相一致 ,
可用于具有DNA梯状条带特征的细胞凋亡的定量试
验。
7　细胞毒实验
取对数生长期HL-60细胞 1×108/L ,分装入96
孔板中 ,每孔 90μL ,用药组加 10μL药液 。对照组加
10μL相应溶剂[含 0.1%(v/v)DMSO的生理盐水] 。
于37℃,5%(v/v)CO2饱和湿度孵箱中保温相应时间
后 ,加 20μL 12mmol/L MTT 试剂 ,孵箱中反应5 h ,再
加含 200 g/L(十二烷基磺酸钠 ,SDS)及 50%(v/v)二
甲基甲酰胺的甲月赞溶解液 ,37℃保温 3 h 至 5 h 后 ,
用酶标仪(Bio-Rad M450)测定吸光度(A),测定波
长是 570 nm ,参考波长是 450 nm 。
8　Bcl-2蛋白表达水平的测定
1.5×106 细胞固定于 1 mL 100%(v/v)冷甲醇
中 ,置-20℃至少 10 min。细胞用不含钙 、镁的 PBS
洗1次 ,再用 50μL含 1 g/L 牛血清白蛋白及 1%(v/
v)牛血清的 PBS封闭 30 min 。加入 50 μL 抗 Bcl-2
鼠抗人单克隆抗体 ,冰上反应 30min ,用PBS洗 2次 ,
加50 μL FITC 标记的羊抗鼠二抗 ,冰上避光 30 min ,
PBS洗 2次后 ,在流式细胞仪上分析 FITC(对数值)
对细胞数的直方图 ,并得出阳性表达率 。
结　　果
1　6F显著升高 HL-60细胞内[ Ca2+] i
　　58 nmol/L 6F 作用细胞20 h[Ca2+] i是对照组的
1.6倍(P<0.05),231 nmol/L 6F 作用 8 h[ Ca2+] i 是
对照组的 1.7倍(P<0.05), 6F 升高[Ca2+] i 呈时间
和剂量依赖关系(表 1 ,表 2)。在所测试的时间和剂
量范围内 ,坏死细胞比例小于 3%,可排除死细胞对
[Ca2+] i 测定的影响 。462 nmol/L 6F 作用细胞 10
min内 , [Ca2+] i无明显改变。
表 1　不同浓度的化合物 6F 作用 20 h HL-60细胞内[ Ca2+] i
Tab 1　[ Ca2+] i in HL-60 cells treated with different concentration
of compound 6F for 20 h( x±s.n=3)
Treatment(nmol/L) [ Ca2+] i(nmol/L)
Control 119.7±14.8
29 139.3±27.3
58 190.5±26.5＊
116 242.1±26.3＊＊
173 360.2±26.3＊＊
231 547.8±5.6＊＊
　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs control.
表 2　231 nmol/ L 6F作用不同时间 HL-60 细胞内[ Ca2+] i
Tab 2　[ Ca2+] i in HL-60 cells treated with 231 nmol/ L of
compound 6F for different time( x±s.n=3)
Treatment(h) [ Ca2+] i(nmol/L)
0 96.4±17.1
4 107.1±10.8
8 159.4±11.8＊＊
12 229.60±7.55＊＊
16 356.1±10.9＊＊
20 594.2±22.4＊＊
　＊＊P<0.01 vs 0 h.
2　化合物 6F对 HL-60细胞 Bcl-2表达的影响
　　58 nmol/L , 116 nmol/L及 231 nmol/L 6F 作用HL
-60细胞 12 h 后 , Bcl-2蛋白表达水平分别是对照
组的 58.9%, 48.1%及 22.2%(图 1)。
Fig 1　Bcl-2 expressing level in HL-60 cells treated with com-
pound 6F for 12 h.
A:Control;B:58 nmol/ L;C:116 nmol/ L;D:231 nmol/L.
图1　化合物 6F作用HL-60细胞 12 h后 Bcl-2的表达水平
·1026·
3　改变细胞内外 Ca2+浓度对 DNA片段化及 6F细
胞毒作用的影响
　　于培养基中加 2 mmol/L CaCl2 或加 1 mmol/L
EGTA络合细胞外钙 ,或加 4 μmol/L 钙通道 A23187升
高细胞内钙离子浓度 ,均不影响 6F 诱导 HL-60细
胞DNA片段化程度(P>0.05),但可增强6F 对HL-
60细胞的杀伤作用 。加入 ZnSO4 可显著抑制 6F 所
致DNA片段化 ,并具有一定的浓度依赖关系 , ZnSO4
也可增强 6F的细胞毒作用(图 2 ,图3)。
Fig 2　DNA fragmentation of HL-60 cells treated with 231 nmol/ L
of 6F alone(1), or combined with 2 mmol/L Ca2+(2), 1
mmol/ L EGTA(3), 4μmol/L A23187(4), 250μmol/ L Zn2+
(5), respectively.＊＊P<0.01 vs 6F alone. x±s.n =4.
图2　改变细胞内外 Ca2+浓度对 6F所致 HL-60 细胞 DNA
片段化的影响
Fig 3　Cytotoxicity of HL-60 cells treated with 116 nmol/ L of 6F
alone(1), or combined with 2 mmol/ L Ca2+(2), 1 mmol/
L EGTA(3), 4μmol/ L A23187(4), 250 μmol/ L Zn2+(5),
respectively.＊P <0.05 , ＊＊P<0.01 vs 6F alone. x ±s.
n=4.
图 3　改变细胞内外 Ca2+浓度对 6F细胞毒作用的影响
讨　　论
Ca
2+是细胞内重要的信号分子 ,参与细胞生长 、
增殖 、死亡等生理和病理过程[ 8] 。钙信号调节细胞
功能的机制非常复杂 ,升高的细胞内 Ca2+既是细胞
运动 、受精等功能活动所必需 ,又可导致细胞坏死或
诱导细胞凋亡。但是什么样的钙信号如何调节细胞
的功能活动 、或决定细胞存活与死亡 ,或选择性地导
致凋亡与坏死 ,目前仍知之甚少 。越来越多的证据
表明 ,钙信号是以复杂的时间 、空间及振幅(浓度)的
形式进行编码 ,以决定其不同功能的[ 9] 。细胞内游
离Ca2+浓度的显著升高是细胞内钙池(内质网)的释
放和细胞外 Ca2+内流造成的。通常情况下 ,细胞受
刺激因素的作用 ,激活肌醇磷脂信号系统 ,生成三磷
酸肌醇(IP3), IP3 与内质网膜上的 IP3 受体结合 ,开启
钙通道 ,释放Ca2+ ,进而引起细胞外钙的内流 ,以补
充钙池内Ca2+的消耗 ,前者是 Ca2+显著升高的直接
原因[ 10] 。内质网 Ca2+的释放 ,细胞浆 Ca2+的升高 ,
使线粒体内 Ca2+水平升高 ,并导致细胞色素 C 的释
放 ,最后诱导细胞凋亡[ 11] 。抗凋亡蛋白 Bcl-2分布
在内质网 、线粒体及核膜上 , Rimpler 等的研究表明 ,
Bcl-2可通过稳定内质网及线粒体内 Ca2+水平 ,抑
制细胞色素 C的释放及 caspase 的激活 ,从而抑制细
胞凋亡[ 12] ,其详尽的机制尚未明了。本研究证实 ,半
边旗提取物 6F 显著抑制 HL -60细胞 Bcl-2 的表
达 ,并显著升高细胞内Ca2+水平 ,前者发生的时间早
于后者 ,推测6F升高Ca2+水平与其抑制Bcl-2的表
达有关 。结果表明 ,6F 不能瞬时影响细胞内 Ca2+水
平。
　　6F 诱导细胞凋亡的程度[ 2]与其升高 Ca2+的程
度是一致的 。出现梯状 DNA 条带(DNA ladder)是 6F
诱导细胞凋亡的典型特征 。凋亡细胞DNA有规律的
断裂是由于激活了核酸内切酶使DNA在核小体间断
裂而形成 180至 200 bp的片段 。使凋亡细胞DNA片
段化的核酸内切酶可分为 3种类型:1.Ca2+ ,Mg2+依
赖型 , 如 DNase Ⅰ , DNase X , DNase gamma 及
DNAS1L2等;2.Ca2+ ,Mg2+非依赖型 ,如 DNase Ⅱ;3.
Mg2+依赖型:半胱天冬氨酰酶激活的 DNase(caspase
-activated DNase , CAD),也称作 CPAN或 DFF40 ,该
酶于 1998年由 Enari 等发现 ,其活性不依赖 Ca2[ 13] 。
以上 3者的活性均可被 Zn2+抑制。本结果显示外加
2 mmol/L CaCl2、或加 4μmol/L钙通道A23187升高细胞
内钙离子浓度 ,或加 1 mmol/L EGTA络合细胞外钙
抑制钙内流 ,均不影响 6F 诱导 HL-60细胞 DNA 片
段化程度 ,而 Zn2+可显著抑制 6F 诱导的 DNA 片段
化 ,提示化合物 6F作用HL-60细胞后激活了 DNase
Ⅱ ,或作用于线粒体 ,释放细胞色素 C ,通过 caspase
家族的级联反应 ,激活 caspase-3 ,再激活 CAD引起
DNA的断裂[ 14] 。确切的机制需进一步研究 。另外 ,
升高的 Ca2+还可通过改变染色质结构使其易于被核
酸内切酶切割。本研究还观察到 ,高浓度的 CaCl2 ,
A23187 ,EGTA 可直接诱导 HL-60细胞凋亡。改变细
胞内外Ca2+水平虽然不影响 6F诱导HL-60细胞凋
亡 ,却可显著增强 6F 的细胞毒作用 ,显然这是通过
促进 6F直接杀死细胞而实现的。
·1027·
[ 参　考　文　献]
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Role of calcium ion in the cyotoxicity and DNA fragment induction
in HL-60 cells by 6F isolated from Pteris semipinnata L .
HE Cheng-wei1 , 　LIANG Nian-ci2 , 　MO Li-er3 , 　LI Jin-hua1 , 　ZHANG Xiao1
(1 Institute of Biochemistry and Molecular Biology , 2Guangdong Key Laboratory
for Research and Development of Natural Drugs , 3Department of Chemistry ,
Guangdong Medical College , Zhangjiang 524023 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To investigate the changes of cytosolic free calcium concentration([Ca2+] i)and expres-
sion of Bcl-2 in HL-60 cells treated by 6F isolated from Pteris semipinnata L.(PSL), and to discuss the relations be-
tween calcium ion and cytotoxicity and DNA fragment induction effects of 6F.METHODS:HL-60 cells were used as
in vitro model.[Ca2+] i was measured on fluorescent spectrophotometry using Fura-2/AM as Ca2+ indicator.Bcl-2
expressing level was measured by flow cytometry.Tetrazolium salt(MTT)and diphenylamine staining methods were ap-
plied for cytotoxicity assay and DNA fragmentation detection , respectively.RESULTS:[ Ca2+] i increased obviously in a
dose and time dependent manner after treated HL -60 cells with 6F.6F decreased the expressing level of Bcl-2.
Adding 2 mmol/L Ca2+ to the medium , or 1 mmol/L EDTA to chelate Ca2+ , or 4 μmol/L calcium ionophore A23187 to
increase the concentration of cytosolic Ca
2+ , the DNA fragment induction by 6F was not affected , whereas the cytotoxici-
ty of 6F was enhanced.250μmol/L Zn2+ attenuated the DNA fragment induction , and the cytotoxicity of 6F against HL
-60 cells was enhanced significantly.CONCLUSION:It was speculated that the decreased expressing of Bcl-2 by
compound 6F was related to increased [Ca2+] i in HL-60 cells , and DNA fragment induction was possibly catalyzed by
Ca2+-independent DNase.
　　[ KEY WORDS] 　HL-60 cells;Calcium;Bcl-2;DNA;Pteris semipinnata L.
·1028·