全 文 ：书第 13卷 第 1期
2 0 1 5 年 3 月
生 物 信 息 学
Chinese Journal of Bioinformatics
Vol．13 No．1
Mar．，2015
收稿日期:2014－12－18;修回日期:2015－01－06．
基金项目:国家自然科学基金(No．31371685)。
作者简介:刘巧红，女，副研究员，研究方向:甜菜遗传育种与植物分子标记;E-mail:Qiaohong941@ hit．edu．cn．
doi:10. 3969 / j．issn．1672－5565．2015．01．02
甜菜属厚皮菜 SWTY-1细胞质 VNTＲs多态性分析
刘巧红1，罗成飞1，代翠红1，袁肖寒2，梁乃国1，刘天骄1，史淑芝1，于 歆1，吕星道2
(1．哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090;
2．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨 150030)
摘 要:利用数目可变串联重复序列(Variable Number of Tandem Ｒepeats，VNTＲs)微卫星标记方法，对重庆厚皮菜甜菜材料
SWTY-1群体中 100个单株的细胞质线粒体 DNA片段中 TＲ2位点 VNTＲs片段多态性进行分析。结果显示 97个单株线粒体
TＲ2位点微卫星串联重复序列均为 3拷贝，与普通糖甜菜一致;3个单株线粒体 TＲ2位点微卫星串联重复序列为 6拷贝，发现
甜菜属厚皮菜细胞质 TＲ2位点 VNTＲs存在多态性，在该群体中发现了不同于甜菜栽培种新的细胞质单株。对该群体材料
100个单株的抽薹及结籽进行观测，结果显示微卫星串联重复序列为 6拷贝的变异植株中 2个单株花期未抽苔开花，1株抽苔
晚未形成正常种子;细胞质 TＲ2位点 VNTＲs片段拷贝数为 3的植株中 2个单株未能正常抽薹，其他植株均正常抽薹结籽。
关键词:甜菜属;细胞质;雄不育;线粒体;分子标记
中图分类号:TS242．2 文献标志码:A 文章编号:1672－5565(2015)－01－009－04
Analysis for variable number of tandem repeats in cytoplasm genome of
Beta vulgaris cicla SWTY-1
LIU Qiaohong1，LUO Chengfei1，DAI Cuihong1，YUAN Xiaohan2，LIANG Naiguo1，
LIU Tianjiao1，SHI Shuzhi1，YU Xin1，L Xingdao2
(1．School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China;
2．Life Science and Biotechnique Ｒesearch Center，Northeast Agricultural University，Harbin 150090，China)
Abstract:Molecular identification for cytoplasm polymorphism of Beta vulgaris cicla L materials SWTY-1 was
conducted in this paper． Polymorphisms in mtDNA TＲ2 locus of Beta vulgaris cicla SWTY-1 were analyzed using
variable number of tandem repeats (VNTＲs)molecular markers method． The result showed that the numbers of
tandem repeats in mtDNA TＲ2 locus were three-copy array of tandem repeats in 97 single plants among the 100
plants of Swiss chard，which was consistent with sugar beet． Six-copy VNTＲs in mtDNA TＲ2 locus were found in 3
single plants among the population． Two plants could not bolt among the three plants whose VNTＲs copy numbers
were six． One plant bolting late could not form normal seeds among the three plants whose VNTＲs copy number
were six． Only two plant among the 97 plants with three-copy in TＲ2 locus failed to bolt normally and others bolt
normally and form seeds．
Keywords:Beta;Cytoplasm;Male sterility;mt DNA;Molecular markers
甜菜(Beta vulgaris)是重要的糖料作物之一，属
于典型的异交作物［1］。由于甜菜开花器官的特殊
结构，大规模人工去雄很难操作，因此不育系亲本材
料选育是甜菜杂种生产的主要支柱。在甜菜杂交育
种中选育不育系是一项费时费力而又花费较大的工
作［2－3］。目前所有杂交栽培甜菜种子的生产都依赖
于 Owen发现的雄不育甜菜材料(CMS)细胞质，种
质单一，各国研究者一直试图寻找利用新的不育系
血缘［4］．近几年，国外研究者主要发现了起源于巴基
斯坦野生甜菜的 S2 型细胞质不育系 1－12CMS(3)
和起源于法国野生沿海甜菜的 S3 型细胞质不育系
CMS 2 种新材料，研究者正在对新发现材料的线粒
体 DNA序列多态性及育性机理进行研究，试图补充
Owen学说，并作为新的候选 CMS 种质材料应用到
甜菜生产中，研究者正在积极发掘新的甜菜属细胞
质类型补充甜菜种质资源的研究［5］。
数目可变串联重复序列(Variable Number of
Tandem Ｒepeats，VNTＲs) 又 称 小 卫 星 DNA
(Minisatellite DNA) ，为 10 到几百核苷酸，拷贝数
10～1 000 不等，在动物细胞线粒体中广泛存在，被
子植物物种中目前只在甜菜中检测到 VNTＲs 的存
在［6］。2000年日本研究人员 Nishizawa S 等首次报
道在甜菜细胞质线粒体 DNA中不相关连的 4 个 TＲ
位点存在数目可变的串联重复序列，分别为 TＲ1、
TＲ2、TＲ3、TＲ4位点;糖用栽培甜菜和沿海甜菜群体
中线粒体 TＲ1 位点 32 bp 的串联重复序列分别为
3～13拷贝不等，其中糖甜菜 Owen 型不育系、保持
系、普通受粉系 TＲ1 位点的 VNTＲs 分别为 4 拷贝、
13拷贝和 6 拷贝;沿海甜菜(B．maritima )中出现 2
拷贝，5拷贝，7 拷贝，8 拷贝;在 TＲ3 和 TＲ4 位点串
联重复序列也出现不同拷贝数的多态性，但这些材
料在 TＲ2位点均为 3拷贝，未发现多态性［7］。本研
究利用 VNTＲs 标记，针对中国甜菜属厚皮菜(Beta
vulgaris Linn． var． cicla L)材料 SWTY-1 群体中 100
个单株的线粒体 DNA中 TＲ2位点 VNTＲs片段进行
分析，试图寻找新的细胞质类型并在田间对其抽薹
结籽现象进行观察。叶用甜菜厚皮菜又名牛皮菜，
甜菜属(Beta) ，藜科(Chenopodiaceae)的一种，二年
生草本植物，原产欧洲地中海沿岸，以幼苗或叶片作
蔬菜用，尤其在西方烹调中被广泛应用［8］。期望通
过对该材料的研究，为甜菜属新型细胞质种质资源
的利用提供理论基础，为甜菜属不育植株不育机制
的解释提供新的研究材料与数据，同时丰富甜菜属
细胞质资源的分子数据。
1 材料和方法
1．1 试验材料
甜菜属厚皮菜材料群体 SWTY-1为叶用甜菜种
子材料，由哈尔滨工业大学食品科学与工程学院甜
菜育种研究室提供。
1．2 试验方法
1．2．1 单株叶片总 DNA 的提取
每个试验单株取 0．05 g 叶片，参照文献［9－10］方
法，应用提取缓冲液(0．5 mol·L－1 NaCl ，50 mmol·L－1
EDTA，100 mmol·L－1 Tris－HCI ，10 mmol·L－1 巯基乙
醇)和氯仿．异戊醇(24 ∶ 1)进行 DNA提取实验，分别
获得群体中每个单株材料的总 DNA。0．8% 琼脂糖
凝胶电泳检测提取的 DNA 质量，模板 DNA 终浓度
调至 20～25 ng·μL－1。
1．2．2 单株 TＲ2位点 VNTＲs片段多态性 PCＲ检测
参照 Nishizawa S等的文献报道，根据甜菜细胞
质中线粒体 TＲ2 位点微卫星串联重复序列两端的
保守序列设计合成上游引物和下游引物序列［5］． 进
行聚合酶链式反应(PCＲ)反应。每个单株的 PCＲ
反应体系为 20 μL。反应组成为:模板 DNA 20 ～
30 ng;上游和下游引物分别为 0． 30 μmol·L－1;
dNTPs 0．2 mmoI·L－1，MgCl22．5 mmol·L
－1，Taq 酶
0．8 U。引物序列片段由上海生物工程公司合成。
dNTP 、Taq酶、DL2000购自 TaKaＲa 公司。PCＲ扩
增程序为:94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，50 ℃
退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，25 个循环，72 ℃延伸
7 min。PCＲ扩增产物用 1． 2%琼脂糖凝胶电泳检
测，电压 90 V，电泳适当距离后取出，在紫外灯下拍
照记录。
1．2．3 VNTＲs片段的回收与测序
特殊的 VNTＲs PCＲ 片段使用 BioSpin Gel
Extraction Kit回收试剂盒进行回收，具体操作步骤
参照试剂盒说明书进行，回收片段的测序工作由上
海英骏生物技术有限公司完成。根据测序结果确定
不同于对照特殊单株 TＲ2位点的拷贝数。
1．2．4 试验材料的抽薹结实特性田间观察
经冬季低温春化处理后的植株于次年春季栽于
田间，待抽苔开花时，根据是否正常抽苔结籽观测单
株的育性特点。
2 结果与分析
2．1 甜菜属厚皮菜 TＲ2 位点 VNTＲs 片段多态性
检测结果及细胞质类型分析
从甜菜属厚皮菜群体中随机取样 100个单株进
行细胞质 DNA TＲ2位点 VNTＲs片段多态性标记检
测。琼脂糖凝胶电泳时，在 DNA Marker 旁边的泳
道分别点入测序鉴定后的 3 拷贝对照 PCＲ 产物及
测试样品 PCＲ 产物。图 1 为对照及待测单株 TＲ2
位点 VNTＲs片段多态性检测 PCＲ 产物琼脂糖凝胶
电泳图片。参照文献［7］，TＲ2 位点 3 拷贝 PCＲ 产
物序列为 362 bp，6 拷贝为 461 pb。3 个单株 PCＲ
产物琼脂糖凝胶电泳明显不同于 3 拷贝单株 PCＲ
产物，回收测序结果显示微卫星序列串联重复 6次，
为 6 拷贝，PCＲ 产物序列为 461 bp。100 个单株的
线粒体 TＲ2位点 VNTＲ 片段 PCＲ 产物测序结果统
01 生 物 信 息 学 第 13卷
计后得出的微卫星串联重复序列拷贝数结果见
表 1。
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图 1 线粒体 TＲ2位点 VNTＲs多态性 PCＲ产物电泳图谱
Fig．1 PCＲ product electrophoretogram for
VNTＲs polymorphism on mitochondrion TＲ2 locus
注:M:DL2000 分子量标准;1:3拷贝对照;2－8:3拷贝 VNTＲs单株;
9－10:6拷贝 VNTＲs单株。
Notes:M:DL2000 DNA marker． No．1:3 copies CK． No．2 ～ 8:3 copies
VNTＲs sing plant． No．9 ～10:6 copies VNTＲs sing plant．
表 1 TＲ2位点 VNTＲs片段拷贝数及育性特点
Table 1 Copy number of VNTＲs on TＲ2 locus and fertility trait
单株序号 VNTＲs拷贝数 育性特点 单株个数
1～15 3 正常抽薹结籽 15
16 3 未抽苔 1
17～36 3 正常抽薹结籽 20
37 3 未抽苔 1
38～67 3 正常抽薹结籽 30
68 6 未抽苔 1
69～72 3 正常抽薹结籽 4
73 6 抽薹晚 1
74～87 3 正常抽薹结籽 14
88 3 未抽薹 1
89～100 3 正常抽薹结籽 12
表 1中看出，甜菜属厚皮菜群体所检测的 100
个单株 TＲ2位点 VNTＲs片段分别为 3 拷贝和 6 拷
贝，出现多态性，其中 97 个植株中线粒体 TＲ2 位点
VNTＲ片段为 3拷贝，与 Nishizawa S 等报道的糖用
栽培甜菜 TＲ2 位点的细胞质类型一致，3 个植株中
线粒体 TＲ2位点 VNTＲ片段为 6拷贝，线粒体 TＲ2
位点出现 6 拷贝现象的单株数在该试验群体中占
3%。根据 Satsuki Nishizawa 等的报导［6］，在研究的
甜菜属不同糖甜菜栽培种和沿海甜菜群体中线粒体
DNA TＲ2 位点中未发现多态性，均为 3 拷贝。本实
验在叶用甜菜厚皮菜群体的单株中检测到线粒体
DNA TＲ2位点串联重复序列(VNTＲs)出现 6 拷贝
单株，存在多态性，发现了甜菜属新的细胞质单株。
实验结果表明叶用甜菜－厚皮菜群体中细胞质多样
性比糖用栽培甜菜更为广泛，TＲ2位点出现多态性。
2．2 100个单株的田间育性观测结果分析与讨论
从幼苗至繁茂期，对群体植株的农艺性状进行
观察，该群体中 100 个植株的田间生长形态及株型
并无明显差异。100个单株的抽薹结籽特性并不完
全相同。田间花期抽薹及植株育性调查结果见
表 1。该群体 100 个单株中 TＲ2 位点 VNTＲs 片段
分子标记检测结果拷贝数为 3 的群体中 95 个植株
能够正常抽薹结籽属于正常可育材料，2 个单株未
能抽薹结籽;TＲ2 位点 VNTＲs片段拷贝数为 6 的植
株中 2个单株不能正常抽苔开花，1 个植株抽薹晚，
获得的种子粒小，种仁干瘪，不能萌发形成幼苗。新
发现的 TＲ2位点 VNTＲs片段拷贝数为 6 的 3 个植
株个体均不能正常结籽，此现象出现的原因有待进
一步解释与研究，该试验鉴定结果并不能完全证明
线粒体 DNA中 TＲ2位点微卫星串联数目的改变直
接与甜菜属植株的育性变化相关，因为植株数量少
有待更多群体的验证，而且细胞质 TＲ2 位点 VNTＲs
片段拷贝数为 3的 2 个单株也不能正常抽薹，对于
引起单株抽薹异常不能正常形成可育种子的原因和
机理有待深入探讨，将成为本课题组下一步研究的
目标之一。
3 结 论
100个 甜菜属厚皮菜单株的线粒体基因组 TＲ2
位点的微卫星串联序列重复次数(VNTＲs)的分子
检测结果表明，甜菜属厚皮菜群体中 97%个体的细
胞质 TＲ2 位点的微卫星串联序列重复次数与
Nishizawa S等报导的糖甜菜栽培种和其他沿海甜菜
细胞质一样，TＲ2 位点 VNTＲs 拷贝数均为 3 拷贝;
厚皮菜群体中 3%个体的细胞质中线粒体 DNA 上
TＲ2位点的 DNA序列发生改变，微卫星串联序列重
复次数由 3拷贝变异为 6拷贝，出现多态性，首次发
现了 TＲ2位点 VNTＲs为 6拷贝的新的细胞质单株。
微卫星串联重复序列为 6拷贝的植株中 2个单株花
期未抽苔开花，1株抽苔晚未形成正常种子，线粒体
DNA中一些位点微卫星串联数目的改变与甜菜属
植株的育性变化是否具有相关性有待更深入的研究
及大量单株材料线粒体 DNA 序列的分子鉴定与田
间育性调查的相结合。本实验在叶用甜菜厚皮菜
SWTY-1群体的单株中首次检测到了线粒体 DNA
TＲ2位点串联重复序列(VNTＲs)出现 6 拷贝多态
性。说明叶用甜菜群体中细胞质多样性较糖用甜菜
11第 1期 刘巧红，等:甜菜属厚皮菜 SWTY-1细胞质 VNTＲs多态性分析
更为广泛。该特殊的多态性细胞质材料的发现为甜
菜属植物育性机理的进一步深入探索提供了新的植
物种质资源研究材料。
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