全 文 ：书华北农学报·2011，26(增刊) :1 -5
收稿日期:2011 － 04 － 11
基金项目:国家牧草产业技术体系
作者简介:任 伟(1984 －) ，男，河北井陉人，硕士，主要从事牧草分子生物学与逆境生理学方面的研究。
通讯作者:徐安凯(1959 －) ，男，吉林人，研究员，博士，主要从事牧草遗传育种领域的研究。
异苞滨藜 BADH基因启动子的分离及表达载体的构建
任 伟，王志锋，周艳春，于洪柱，徐安凯
(吉林省农业科学院 畜牧分院，吉林 公主岭 136100)
摘要:为了进一步提高转 BADH基因植株的胁迫抗性，分离强胁迫诱导型启动子，以生长在新疆北部干旱沙漠地
带的异苞滨藜(Atriplex micrantha)为研究对象，依据已经克隆的 BADH基因 cDNA序列，参照陈柏君等的方法，分离到
长为 1 509 bp的 5端上游序列(Genebank:HM230828) ，预测其转录起始位点为 T(+ 1) ，位于 ATG翻译起始位点的上
游 82 bp处，同时还发现了一段新的内含子序列(260 bp)。经 PLACE和 PLANT CARE软件分析，发现此序列具有启
动子的基本转录元件:TATA盒和 CAAT盒，包含多个抗逆调控元件:ABA 响应元件(ABRE) ，水杨酸诱导元件(－ 58
bp) ，热激(HSE)、低温(LTRE1)、干旱(DRE)、伤害诱导元件(WUN)等。并首次发现许多其他的胁迫诱导元件:铜胁
迫元件(Cu)、真菌诱导元件(AM)、糖信号转导元件(Sugar)、厌氧和低二氧化碳调控元件，植物激素响应元件(ARR1)
以及多个光调控元件(Light)和转录因子响应元件(WRKY、CBF、MYB) ，因此，推测分离到一个新的强胁迫诱导型启
动子。同时构建了 BADH-P-a-3301 和 BADH-P-b-3301 两个植物表达载体。
关键词:BADH基因;启动子;内含子;克隆
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2011)增刊 － 0001 － 05
Cloning and Construction of Expression Vectors of
BADH Gene Promotor from Atriplex micrantha
REN Wei，WANG Zhi-feng，ZHOU Yan-chun，YU Hong-zhu，XU An-kai
(Branch of Animal Husbandry，Academy of Agricultural Sciences of Jilin Province，Gongzhuling 136100，China)
Abstract:In order to further improve the tolerance of BADH transgenic plants and obtain stronger stress-in-
duced promotor，a regulatory sequence of 1 509 bp(Genebank:HM230828)was isolated from Atriplex micrantha，
which grows in arid desert Xinjiang，according to the BADH cDNA sequences and refer to the methods of Chen． The
transcription start site，which localized at 82 bases upstream of the start ATG，was predicted by soft-berry，a new in-
tron(260 bp)was found． The functional elements were analysed by PLACE and PLANT CARE programm． The pro-
motor contains lots of stress-induced elements，such as ABA response elements，salicylic acid，heat stock，low tem-
perature，drought and wounding response elements，etc． Cu-stress，AM，Sugar，Anaerobic regulatory elements，GA re-
sponse element，a number of light regulatory and transcription factor response elements(WRKY，CBF，MYB)was
discovered firstly． We speculate that it is a new strong stress-induced promoter，we also constructed two plant expres-
sion vectors，BADH-P-a-3301 and BADH-P-b-3301．
Key words:BADH gene;Promotor;Intron;Clone
大多数植物在受到盐碱、干旱、高温、寒冷等外
界胁迫时，体内常常会合成和积聚有机物质、有机
酸、内酯等渗透调节物质来维持自身正常的生理生
化反应。甜菜碱就是其中一种无毒的小分子渗透调
节剂，对于维持细胞的正常膨压及呼吸作用和光合
作用都具有重要意义，因此受到人们的高度重视，被
认为是最好的渗透调节剂。它在植物体内由胆碱经
两步氧化生成，其中甜菜碱醛脱氢酶(Betaine alde-
hyde dehydrogenase，BADH)催化其第 2 步限速反
应，由于合成途径简单，遗传操作方便，因此 BADH
基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因，在转基因
植物的培育中广为应用［1］。
2 华 北 农 学 报 26 卷
目前，BADH 基因在很多植物中得到分离克
隆［2］，并在水稻［3］、小麦［4］、豆瓣菜［5］等多种农作物
中遗传表达，提高了转基因植株的耐盐性，但效果并
不理想。这是因为在这些转基因植物中，BADH 基
因受组成型启动子 35S(烟草花叶病毒，Cauliflower
mosaic virus)来调控表达，造成转基因植物的抗盐能
力有限。因而，为了进一步提高转基因植物的胁迫
抗性，必须分离 BADH 基因启动子，找到调控 BADH
基因表达的关键作用元件，进而使用其自身特有的
启动子来调控 BADH基因的表达。但有关这方面的
研究还比较少，只有李秋莉等［6］、刘振林等［7］和 Yin
等［8］分别在辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis)、甘菊
(Dendranthem alavandulifolium)和中亚滨藜(Atriplex
centralasiatica Iljin)中分离到不同长度的 BADH基因
启动子序列。
本研究以生长在新疆北部干旱沙漠地带的异苞
滨藜为研究对象，依据已经克隆到的 BADH 基因
cDNA序列(Genebank:EF208902) ，参照陈柏君等［9］
的方法，对该基因的启动子序列进行分离克隆。
1 材料和方法
1． 1 材料
植物材料异苞滨藜种子采自新疆北部干旱沙
漠，由北京大学生命科学学院提供，播种于蛭石中，
在温室栽培;菌种为本实验室保存;PMD18-T 载体、
各种酶、试剂和试剂盒购自 TaKaRa(大连)公司;自
行设计引物并由上海生工公司合成。植物表达载体
pCAMBIA-3301 由北京大学生命科学学院惠赠。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 DNA的提取 以新疆异苞滨藜的幼嫩叶
片为试验材料，采用 CTAB法提取总 DNA［10］，备用。
1． 2． 2 单引物 PCR 扩增 以基因组总 DNA 为模
板，用预先设计好的特异性引物(GSP1:5-TTAG-
CACGATGAGCACCAGAAGTTG-3)进行线性 PCR
扩增，产生单链扩增产物，将 PCR产物跑胶，回收 1．
3 ～ 2 kb 的片段。50 μL PCR 反应体系中含 200
mmol /L dNTPs，5 μL PCR缓冲液(10 ×) ，8 pmol 基
因特异性引物，约 3 μg 模板 DNA。反应程序为:
94℃预变性 7 min，94℃变性 30 s，59℃退火 30 s，
72℃延伸 2 min，32 个循环。
1． 2． 3 加尾反应 通过末端转移酶(TdT)的作用，
将上一步得到的单链 DNA 分子的 3＇末端加上多聚
胞嘧啶。反应体系为:回收产物 12 μL，加尾缓冲液
(5 ×)6 μL，10 mmol /L dCTP 1 μL，无菌双蒸水 10
μL。反应混合物先在 94℃保温 2 min，立即置冰上，
迅速加入 1 μL末端转移酶后，在 37℃保温 15 min，
最后在 75℃保温 10 min 以灭活末端转移酶，整个反
应可以在 PCR仪上完成。
1． 2． 4 巢式 PCR 扩增 用巢式基因特异性引物
(GSP2:5-AACCTCCACATCCTCTGCAG-3)和与多
聚 胞 嘧 啶 配 对 的 锚 定 引 物 (AAP:5-GGC-
CACGCGTCGA CTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3) ，
对加尾产物进行 PCR 扩增。反应体系与常规 PCR
反应相同。反应程序为:94℃预变性 3 min;94℃变
性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30 个循环;
72℃延伸 6 min。
1． 2． 5 PCR产物的回收、连接、转化与鉴定及 DNA
序列测定与分析 PCR 产物的回收按照琼脂糖凝
胶 DNA回收试剂盒说明书进行，片段连接按 TaKa-
Ra公司 pMD18-T 载体说明书进行，重组质粒由抗
生素筛选，并用双重 PCR 进行鉴定，其中一对引物
为 AAP和 GSP2，此外还在 BADH 基因 5端的已知
序列设计一个正向引物 GSP3(5-ATGGCGTTTC-
CTATGCCTGT-3) ，用它和反向引物 GSP2 做二次鉴
定。选取最长片段送交上海生工公司完成 DNA 序
列测定。序列分析采用 DNAMAN 软件进行。启动
子元件分析采用 PLACE和 PLANT CARE软件。
1． 2． 6 表达载体的构建 根据测序后的序列设计
带 BamH I 酶切位点的上游引物 BADH-P-5(5-
GGATCCGATGAAGGAAATTTGGAGTT-3)。同时设
计两个带有 BgI II酶切位点的下游引物:BADH-P-3a
(5-ACGAAGATCTACCTCCACATCCTCTGCAGT-3)
和 BADH-P-3b (5-CCATAGATCTAGAGTCGACGAA
CAGGCAT-3) ，前者用于扩增启动子 + 内含子片
段，后者用于扩增启动子片段。以测序用菌液为模
板进行 PCR扩增，回收 PCR产物并再次与 pMD18-T
载体连接，构建中间载体。将以上中间载体和表达载
体 pCAMBIA-3301分别转入大肠杆菌 DH5α中，摇菌
后提取质粒，分别用 BamH I 和 BgI II 进行双酶切。
然后用琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段
并进行连接、转化。挑取单菌落摇菌后进行 PCR 检
测，选择阳性克隆提取质粒并进行酶切鉴定。
2 结果与分析
2． 1 启动子序列的获得及内含子的发现
如图 1 所示，通过单引物扩增，得到了清晰、连
续、明亮的弥散带，满足后续试验的要求，将 1． 3 ～
2. 0 kb的条带纯化回收，经加尾反应和巢式 PCR扩
增，用 GSP2 和 AAP 引物对阳性克隆进行 PCR 鉴
定，最终在多个阳性克隆中选取了 3 个条带清晰，片
增刊 任 伟等:异苞滨藜 BADH基因启动子的分离及表达载体的构建 3
段最长的克隆，约 1 500 bp(图 2)。由于 AAP 引物
的结构复杂多变，为了避免假阳性克隆的产生，同时
用 GSP2 + GSP3 对以上 3 个阳性克隆做进一步的
PCR鉴定，结果表明只有 3 号克隆能够扩增出清晰
的条带，约 400 bp 左右。但是 GSP2 在已克隆的
BADH基因 cDNA序列上的位置是在翻译起始位点
(ATG)之后的 131 ～ 150 bp 处，GSP3 在翻译起始位
点(ATG)之后的 1 ～ 20 bp 处，目的片段应该为 150
bp，而实际片段为 400 bp，说明 BADH基因在基因组
DNA序列中有内含子的存在，所以用 GSP2 + GSP3
对异苞滨藜的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，同样也
扩增出约 400 bp的片段(图 3)。
图 1 基因组 DNA的单引物扩增结果
Fig． 1 Single primer amplification of genomic DNA
图 2 GSP2 + AAP对阳性克隆的 PCR鉴定
Fig． 2 PCR of positive clone by GSP2 and AAP
1．模板为第 3 号阳性克隆;2．模板为基因组 DNA。
1． No． 3 positive clone sample;2． Genomic DNA sample．
图 3 GSP2 +GSP3 的 PCR扩增
Fig． 3 PCR by GSP2 and GSP3
2． 2 启动子序列分析
测序结果表明(图 4) ，分离到的片段总长 1 509
bp。用 SOFT-BERRY 软件预测出其转录起始位点
为 T(+ 1) ，位于 ATG 翻译起始位点的上游 82 bp
处，且两侧多为嘧啶碱基 C 和 T，转录起始序列为
CTCACTCT，这与通常认为的植物转录起始保守序
列 CTCATCA以及转录起始位点为 A有所差异。但
是李秋莉等［6］和 Yin等［8］的研究结果也认为 BADH
基因的转录起始位点为 T，说明我们的预测结果基
本正确，获得了 BADH 基因上游 1 018 bp 的启动子
序列，同时还发现了一段新的内含子序列，长 260 bp
(+ 193 至 + 452)。同源性对比发现，新疆异苞滨藜
BADH基因的上游调控区与辽宁碱蓬和柑橘的
BADH基因启动子序列没有同源性，但是与盐生植
物中亚滨藜有很高的同源性(91%)。用 PLACE 和
PLANT CARE 软件分析此序列，发现此序列除了具
有启动子的基本转录元件:TATA 盒(－ 30 bp)和
CAAT盒(－ 70 bp)外，还含有大量的抗逆调控元
件，其中包括 ABA 响应元件(ABRE) ，水杨酸诱导
元件(－ 58 bp) ，热激(HSE)、低温(LTRE1)、干旱
(DRE)、伤害诱导元件(WUN)等，这与已有的研究
结果相类似［6 － 8］。首次发现在 BADH基因启动子序
列中存在许多新的胁迫诱导元件:铜胁迫元件
(Cu) ，真菌诱导元件(AM) ，糖信号转导元件(Sug-
ar) ，厌氧和低二氧化碳调控元件，植物激素响应元
件(ARR1)以及多个光调控元件(Light)和转录因子
响应元件(WRKY、CBF、MYB) ，有关这些调控元件
还未在 BADH基因上游调控序列中报道，所以我们
分离到的调控序列是一个新的强胁迫诱导启动子。
同时，我们也注意到在这段调控序列中未发现盐诱
导调控元件，Yin X 等［8］在对中亚滨藜 BADH 启动
子研究中也未发现盐诱导调控元件，这可能是滨藜
属植物区别于其他盐生植物的独特之处。
2． 3 表达载体的构建
为了进一步研究这段启动子以及内含子的调控
功能，在 pCAMBIA-3301 载体(图 5)的基础上，替换
掉原有的 35 S组成型启动子，分别构建了 BADH-P-
a-3301(图 6)和 BADH-P-b-3301(图 7)两个植物表
达载体，前者用于将启动子和内含子整体全部转入
植物体，后者仅仅包含启动子调控序列，目前已经得
到这两个载体的农杆菌转化子，下一步将 pCAMBIA-
图 5 pCAMBIA-3301 载体图谱
Fig． 5 pCAMBIA-3301 vector
4 华 北 农 学 报 26 卷
3301、BADH-P-a-3301和 BADH-P-b-3301 同时转化烟 草，来研究它们调控 GUS基因表达的差异性。
图 4 BADH基因启动子序列分析
Fig． 4 The sequence analysis of BADH promoter
3 讨论
启动子作为基因表达调控的重要顺式作用元
件，是植物感知和抵御外界胁迫信号传递途径的重
要枢纽，了解其结构、功能和作用机制，对深入了解
植物的抗逆机制、培育转基因抗逆新品种均有着重
要意义［11］。摒弃表达效率低下的组成型启动子，改
用植物自身的逆境诱导型启动子来驱动功能基因在
转基因作物中的表达中已然成为目前的研究热点。
然而，当下能应用于转基因研究的诱导型启动子却
很少，主要是没有简便、高效、低廉的克隆已知 DNA
片段侧翼序列的方法。较早的基因组文库筛选法基
于构建文库及同位素标记探针，由于操作复杂而较
少应用，近期的 PCR法由于受到内切酶消化及连接
增刊 任 伟等:异苞滨藜 BADH基因启动子的分离及表达载体的构建 5
反应的限制，或是随机引物的不确定性，应用也不广
泛。本研究在陈柏君等方法的基础上，稍加改进，很
顺利的分离到新疆异苞滨藜 BADH 基因约 1． 5 kb
的上游序列，在更改了反应体系和增加循环次数的
基础上，在第一步的单引物 PCR扩增阶段就可以得
到清晰明亮的弥散带，使得后续步骤更具有目的性，
避免了不必要的重复和浪费，为今后启动子的分离
克隆提供了一条可供参考的新途径。
图 6 BADH-P-a-3301 载体图谱
Fig． 6 BADH-P-a-3301 vector
图 7 BADH-P-b-3301 载体图谱
Fig． 7 BADH-P-b-3301 vector
已有的研究结果表明，不同植物种间 BADH 基
因编码区序列的长度差异不大，氨基酸序列的同源
性也较高，在 63%以上，而在漫长的进化过程中，非
编码区则呈现出相对较大的变异程度，尤其是启动
子序列，即使是属内的不同植物也会有不同的结
果［2］。正如本研究的分析结果，新疆异苞滨藜
BADH基因的上游调控区与辽宁碱蓬和柑橘的
BADH基因启动子序列没有同源性，虽与同属的盐
生植物中亚滨藜有很高的同源性，但是却首次发现
了许多其他的调控元件，说明不同的植物种在外界
胁迫环境的作用下，启动子的顺式调节元件除了一
些共有的保守序列外，通常还具有种属特异的调节
序列［12］。正如本研究中新发现的丛枝菌根调控元
件(AM) ，糖信号转导元件(Sugar) ，植物激素响应元
件(ARR1)以及多个光调控元件(Light) ，说明当新
疆异苞滨藜遭遇外界逆境胁迫时，BADH 基因可能
参与了体内真菌、糖、激素以及光的信号转导过程，
从而在细胞整体水平上提高了自身的抗逆性。此外
发现的转录因子响应元件(WRKY、CBF、MYB) ，厌
氧和低二氧化碳调控元件，也很好的解释了新疆异
苞滨藜不仅能够在干旱的荒漠中生存，而且还能够
在在沼泽湿地等缺氧条件下正常生长的生物学特
性。同时，我们还发现了一个铜胁迫元件(Cu) ，说
明 BADH基因的表达可能会提高新疆异苞滨藜自身
的铜胁迫抗性，而有关 BADH 基因这些方面的研究
还未见报道，值得做进一步的研究论证。由此看来，
努力寻找植物自身特有的强胁迫诱导启动子是高效
表达抗逆功能基因的关键，为转基因植物的培育以
及有效地利用大量荒芜的盐碱地和干旱地，节省淡
水资源，提高单位面积的粮食产量提供了新途径。
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