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猫儿屎内生真菌DL06菌株的鉴定及次生代谢产物的研究



全 文 :第 15 卷 第 23 期 2015 年 8 月
1671—1815(2015)23-0087-05
科 学 技 术 与 工 程
Science Technology and Engineering
Vol. 15 No. 23 Aug. 2015
 2015 Sci. Tech. Engrg.
化学
猫儿屎内生真菌 DL06 菌株的鉴定
及次生代谢产物的研究
许 倩 马养民* 屈子睿 苗 智 王 健 闫梦茹
(陕西科技大学化学与化工学院,教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室,西安 710021)
摘 要 对猫儿屎内生真菌 DL06 菌株进行鉴定,并对其次生代谢产物进行研究,采用形态学观察以及 ITS 序列鉴定菌株
DL06为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。应用多种层析手段对其发酵产物进行分离纯化得到了 8 个化合物,结合理化性
质和波谱分析确定为 β-谷甾醇(1)、6,8-二羟基-3-甲基异香豆素(2)、单甲基硫赭曲菌素(3)、大黄素-8-甲醚(4)、2-呋喃甲酸
(5)、5-羟甲基呋喃-3-羧酸(6)、6-柠檬酸甲酯(7)和丁二酸(8),化合物(2)、(3)、(6)和(7)均为首次从产黄青霉中分离得到。
利用最小抑菌浓度法(MIC)对化合物的活性进行检测,抗菌活性表明化合物(3)具有较强的抑菌作用。
关键词 猫儿屎 内生真菌 次生代谢产物 抑菌活性
中图法分类号 O629. 5; 文献标志码 A
2015 年 4 月 7 日收到 高等学校博士学科点专项科研基金
(20116125110001)和陕西省自然科学基金(2014JZ003)资助
第一作者简介:许 倩(1989—),女,硕士研究生。研究方向:天然
产物化学。E-mail:xuqian1308@ sina. com。
* 通信作者简介:马养民(1963—),男,教授,博士生导师。研究方
向:天然产物化学。E-mail:mym63@ sina. com。
植物内生真菌是指存在于健康植物组织、器官
内,并不引起宿主植物明显病害症状的一类真菌。
内生真菌长期生活于植物特殊环境中,与宿主协同
进化,能够产生多种结构复杂的次生代谢产物[1]。
目前,人们已从内生真菌中分离得到多种具有生物
活性的代谢产物,主要有生物碱、萜类、甾体、醌类、
苯丙素类、肽类、酯类等化合物[2]。
猫儿屎(Decaisnea fargesii Franch)系木通科
(Lardiyabalaceae)猫儿屎属植物。在我国西南部和
中部,以及东喜马拉雅山脉地区均有分布。主治肺
痨咳嗽,风湿痹痛。具有清肺止咳,祛风除湿等功
效[3]。目前国内外对猫儿屎研究主要集中在其植
物化学成分上,而对猫儿屎内生真菌的研究较少,本
研究对从猫儿屎叶中分离得到并筛选出具有较强抑
菌作用的内生真菌 DL06[4]进行菌种鉴定,并且对其
代谢产物进行结构鉴定和活性测试。
1 材料
1. 1 菌株
菌株 DL06 从采自秦岭太白山的猫儿屎叶中分
离纯化得到,用 PDA斜面培养基 4 ℃保存于陕西科
技大学天然产物实验室。测试菌:2 株革兰氏阳性
菌(金黄色葡萄球菌,乳链球菌),2 株革兰氏阴性菌
(大肠杆菌,绿脓杆菌)。
1. 2 试剂
蔗糖(市售),葡萄糖(分析纯,天津市科密欧化
学试剂有限公司),NaNO3、NaCl、K2 HPO4、KCl、
MgSO4·7H2O、FeSO4(分析纯,天津市天力化学试
剂有限公司),牛肉膏、蛋白胨、琼脂 (生化试剂,北
京奥博星生物技术有限责任公司),薄层色谱硅胶 G
(青岛海浪硅胶干燥剂厂),200 ~ 300 目柱层析用硅
胶(青岛海洋化工厂分厂),Sephadex LH-20 柱色谱
凝胶(上海浩然生物技术有限公司),石油醚、乙酸
乙酯、甲醇、乙醇(分析纯,天津市河东区红岩试剂
厂)。
1. 3 仪器
DH5000B电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器
有限公司);SW-CJ-1FD 超净工作台(上海博讯实业
有限公司医疗设备厂);YX-280B 手提式压力蒸汽
灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司);XSP-
C240COIC双目光显微镜(重庆光电仪器有限公
司);BH-2 OLYMPUS 显微镜(日本 OLYMPUS 光学
株式会社);BS2202S Sartorius 电子天平(北京赛多
利斯仪器系统有限公司);HZQ-Q全温振荡器(金坛
市瑞华仪器厂);R502B型旋转蒸发仪(上海申生科
技有限公司);Bruker avance Ⅲ-400Hz 超导核磁波
谱仪(瑞士布鲁克公司);XT-5 显微熔点测定仪(北
京市科仪电光仪器厂)。
1. 4 培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯浸出液
200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 20 g,去离子水 1 000 mL,
121 ℃灭菌 25 min;察氏液体培养基:蔗糖 30 g,
NaNO3 3 g,K2HPO4 1 g,KCl 0. 5 g,MgSO4·7H2 O
0. 5 g,FeSO4 0. 01 g,去离子水 1 000 mL,121 ℃灭
菌 25 min;牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 5 g,蛋白胨
10 g,NaCl 5 g,琼脂 20 g,去离子水 1 000 mL,121 ℃
灭菌 25 min。
2 方法
2. 1 菌株 DL06 的鉴定
2. 1. 1 形态学观察
菌株 DL06经活化后,接于 PDA 平板培养基上,
于 28 ℃下培养 5 d至孢子成熟,观察记录菌落特征;
采取插片培养法,用棉兰染色,以去离子水为浮载剂
制成玻片,并在显微镜下观察孢子及菌丝的形态。
2. 1. 2 ITS序列分析
将活性菌株 DL06 接于斜面培养基上,在 28 ℃
下培养 5 d 至孢子成熟,过滤得到菌丝体。利用
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取真菌基因组
DNA并作为模板,以通用引物 ITS1 以及 ITS4 对目
标菌株进行 ITS 区域扩增[5]。PCR 反应体系为:
Template(基因组 DNA20 - 50 ng /μL)0. 5 μL,10 ×
Buffer (with Mg2 +)2. 5 μL,dNTP(各 2. 5 mmol /L)1
μL,ITS1(10 μmol /L)0. 5 μL,ITS4(10 μmol /L)0. 5
μL,加双蒸馏水至 25 mL。PCR 循环条件:94 ℃进
行预变性4 min,94 ℃变性 45 s,55 ℃退火 45 s,72
℃延伸1 min,持续 30 个循环,在 72 ℃下修复延伸
10 min,4 ℃下保存待用。凝胶电泳:取 5. 0 μL PCR
扩增产物,用 EB 染色,在 1%琼脂糖溶液,150 V、
100 mA条件下电泳 20 min,记录电泳结果。PCR产
物的序列由上海生工生物工程股份有限公司测定,
将得到的 ITS 序列在 Genbank 数据库中进行 Blast
分析,利用 MEGA5. 0(邻接法 NJ)构建系统发育进
化树。
2. 2 菌株 DL06 的发酵
将菌株 DL06 在 PDA平板培养基上活化,于 28
℃下培养 5 d,用打孔器制成 6 mm 的菌饼,按照每
100 mL 察氏培养基中接种 1 个菌饼的量,共接种
3 L,在 28 ℃、120 r /min 的摇床中培养 5 d,得到种
子液。将上述种子液按照培养基 10%的接种量加
入到灭好菌的大米培养基(大米 50 g,无糖察氏液
体培养基 60 mL)中,共发酵 200 瓶,于室温下静置
培养 30 d。
2. 3 次生代谢产物的分离与纯化
将固体发酵物晾干、粉碎后,用乙酸乙酯提取 6
次,每次 24 h,合并提取液,并用旋转蒸发仪减压浓
缩得到 150 g浸膏。采用硅胶柱色谱对粗浸膏进行
分离,以石油醚:乙酸乙酯(体积比为 1∶ 0,20∶ 1,10∶
1,10∶ 2,2∶ 1,1∶ 1,1∶ 2,0∶ 1)梯度洗脱,得到 8 个组分
(Fr. 1-8)。经放置,在 Fr. 2、Fr. 3 和 Fr. 6 中直接有
晶体析出,重结晶后分别得到化合物 1(54 mg)、化
合物 2(30 mg)和化合物 7(150 mg)。对 Fr. 4 以石
油醚∶乙酸乙酯(体积比为 1∶ 0,20∶ 1,10∶ 1,20∶ 3,5∶
1,10∶ 3,2∶ 1,0 ∶ 1)进行梯度洗脱,再经重结晶得到
化合物 5(15 mg)。对 Fr. 5 以石油醚∶乙酸乙酯(体
积比为 1∶ 0,5∶ 1,10∶ 3,5∶ 2,5∶ 3,5∶ 4,1∶ 1,0∶ 1)进行
梯度洗脱,经硅胶柱色谱和 Sephadex LH-20 凝胶柱
色谱,再经重结晶纯化,得到化合物 3(130 mg)、化
合物 4(24 mg)和化合物 8(43 mg)。对 Fr. 7 进一步
分离得到化合物 6 (350 mg)。
2. 4 代谢产物结构鉴定
采用1H-NMR和13C-NMR对 8 个化合物结构进
行解析,结合文献对照,确定化合物结构。
2. 5 抗菌活性检测
根据最小抑菌浓度法[6],将待测化合物溶于
DMSO,配制成质量浓度为 1 000 μg /mL的溶液。将
牛肉膏蛋白胨液体培养基,用移液枪取 100 μL加入
到 96 孔酶标板第一排每个孔中,再向第 1 个孔中加
入上述样品母液 100 μL混合均匀,再从第 1 个孔中
吸取 100 μL加入到第 2 个孔中混合均匀,再从第 2
个孔中吸取 100 μL加入到第 3 个孔中混合均匀,连
续稀释到第 10 个孔,从中吸取 100 μL 弃去,第 11
个孔和第 12 个孔分别留作培养基和 DMSO 溶剂阴
性对照。第 1 ~ 10 孔中化合物质量浓度依次为
500、250、125、62. 5、31. 3、15. 6、7. 81、3. 91、1. 95、
0. 98 μg /mL。将指示菌配制成 106 CFU /mL的菌悬
液,向每个孔中加 100 μL。采用硫酸链霉素作为革
兰氏阴性菌的阳性对照,青霉素钠作为革兰氏阳性
菌的阳性对照。上述样品每组设置 3 个平行试验。
将 96 孔酶标板于 37 ℃中培养 24 h 后,取出观察并
记录。
3 结果与分析
3. 1 菌株 DL06 鉴定
菌株 DL06 菌落初期为白色,渐变为蓝绿色,具
有辐射状皱纹,边缘菌丝体为白色,质地绒状,分生
孢子结构大量,有黄色渗出液,菌落反面呈浅黄褐
色;显微镜下观察发现,菌丝发达多枝,有横隔,分生
孢子梗顶端呈帚状,每个帚状枝有副枝,分生孢子密
集而且易散落,明显具有青霉属的的特征(图 1)。
88 科 学 技 术 与 工 程 15 卷
图 1 菌株 DL06 形态学特征
Fig. 1 Morphological characteristics of strain DL06
PCR扩增片段经测序表明,目标菌种的 ITS 序
列长度为 563 bp (ACCTGCGGAAGGATCATTACC-
GAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCC-
GTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCG-
CCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCG-
GGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCT-
GTCTGAAGATTGTAGTCTGAGTGAAAATATAAA-
TTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT-
CCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT-
ACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATC-
GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATT-
CCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTG-
CCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCC-
TCCGATCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCG-
GCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGG-
CTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCT-
TGCCGATCAACCCGAATTTTTATCCAGGTTGACC-
TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG-
CATATCAA),同 Genbank 中的基因序列相对比,
DL06 的 ITS序列与产黄青霉(JX996995)的同源率
达到 99%(图 2)。结合形态观察结果,将菌株 DL06
鉴定为产黄青霉(Penicillium chrysogenum),(Gen-
bank中登录号为 KP690795)。
3. 2 代谢产物的结构鉴定
从其发酵产物中分离得到 8 个化合物,分别为
β-谷甾醇(1)、6,8-二羟基-3-甲基异香豆素(2)、单
甲基硫赭曲菌素(3)、大黄素-8-甲醚(4)、2-呋喃甲
酸(5)、5-羟甲基呋喃-3-羧酸(6)、6-柠檬酸甲酯(7)
和丁二酸(8)。
化合物 1 无色针状晶体(氯仿),mp. 128 ~
130 ℃,浓硫酸-乙醇显色剂显色为紫色。1 H-NMR
(400 MHz,CDCl3)δ:5. 36(1H,s,6-H),3. 55(1H,
m,3-H) ,1. 01(3H,s,19-H) ,0. 93(3H,d,J = 6. 5
Hz,21-H) ,0. 68(3H,s,18-H) ;13 C-NMR(100 MHz,
CDCl3)δ:140. 74(C-5),121. 73(C-6) ,71. 80(C-3) ,
56. 75(C-14) ,55. 02(C-17) ,50. 10(C-9) ,45. 80(C-
24) ,42. 28 (C-13) ,39. 75 (C-4) ,37. 24 (C-12) ,
36. 49(C-1) ,36. 14(C-10) ,33. 92(C-20) ,31. 90(C-
22) ,31. 88(C-7) ,31. 64(C-8) ,29. 11(C-2) ,28. 25
(C-25) ,26. 01(C-16) ,24. 30(C-23) ,23. 04(C-15) ,
21. 07(C-28) ,19. 83 (C-11) ,19. 40 (C-26,27) ,
19. 02(C-19) ,18. 77(C-21) ,11. 98(C-18) ,11. 86
(C-28)。经与文献[7]对照,确定化合物 1 为 β-谷
甾醇。
化合物 2 无色固体(甲醇),mp. 146 ~ 148 ℃,
浓硫酸-乙醇显色剂显色为暗红色。1 H-NMR(400
MHz,DMSO-d6)δ:10. 96(1H,s,8-OH),10. 85(1H,
s,6-OH) ,6. 48(1H,s,4-H) ,6. 34(1H,s,5-H) ,6. 31
(1H,s,7-H) ,2. 21(3H,s,3-CH3);
13 C-NMR(100
MHz,DMSO-d6)δ:165. 59 (C-1),165. 43 (C-6) ,
162. 64(C-8) ,154. 08(C-3) ,139. 67(C-4a) ,104. 17
(C-4) ,102. 35(C-5) ,101. 28(C-7) ,97. 84(C-8a) ,
18. 82(-CH3)。经与文献[8]对照,确定化合物 2 为
6,8-二羟基-3-甲基异香豆素。
化合物 3 淡黄色晶体(甲醇),mp. 188 ~190 ℃,
浓硫酸-乙醇显色剂显色为橘红色。1 H-NMR(400
MHz,DMSO-d6)δ:12. 97 (1H,s,2-H),10. 26
(1H,s,5-H) ,6. 91(1H,d,J = 2. 0 Hz ,6-H) ,6. 71
(1H,d,J = 2. 0 Hz,4-H) ,6. 40 (1H,br,s,
3-H) ,6. 27 (1H, br, s, 5-H ) ,3. 64 (3H,
s,-COOCH3),3. 63(3H,s,8-H) ,3. 34(3H,s,9-H) ,
图 2 基于 ITS序列基础上的菌株 DL06 系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of strain DL06 based on ITS sequence
9823 期 许 倩,等:猫儿屎内生真菌 DL06 菌株的鉴定及次生代谢产物的研究
2. 27(3H,s,7’-H);13 C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)
δ:199. 37(C-8’),165. 79(C-7) ,163. 19(C-2’) ,
160. 73(C-6’) ,158. 06(C-5) ,156. 58(C-3) ,148. 01
(C-4’) ,127. 91(C-1) ,125. 76(C-2) ,110. 03(C-
1’) ,109. 97(C-3’) ,107. 09(C-6) ,103. 49(C-5’) ,
103. 11(C-4) ,55. 90(C-8) ,55. 86(C-9’) ,52. 12(-
OCH3),21. 85(C-7’)。经与文献[9]对照,确定化
合物 3 为单甲基硫赭曲菌素。
化合物 4 橘红色晶体(甲醇),mp. 281 ~282 ℃,
浓硫酸-乙醇显色剂显色为砖红色。1 H-NMR(400
MHz,DMSO-d6)δ:13. 26(1H,s,1-OH),11. 29(1H,
s,6-OH) ,7. 44(1H,s,4-H) ,7. 22(1H,d,J = 1. 8
Hz,5-H) ,7. 14(1H,s,2-H) ,6. 86(1H,d,J = 1. 8 Hz
,7-H) ,3. 91 (3H,s,8-OCH3),2. 40 (3H,s,3-
CH3);
13 C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:186. 32(C-
9),182. 29(C-10) ,164. 42(C-6) ,163. 40(C-8) ,
161. 66(C-1) ,146. 62(C-3) ,136. 76(C-4a) ,131. 99
(C-2) ,119. 10(C-4) ,114. 33(C-9a) ,112. 58(C-
8a) ,106. 89(C-5) ,104. 93(C-7) ,56. 30(-OCH3),
21. 34(C-3)。经与文献[10]对照,确定化合物 4 为
大黄素-8-甲醚。
化合物 5 无色晶体(氯仿),mp. 120 ~ 122 ℃。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7. 66(1H,s,5-H),
7. 35(1H,d,J = 3. 5 Hz,3-H) ,6. 58(1H,dd,J = 3. 5,
1. 8 Hz,4-H) ;13 C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:163. 51
(2-COOH),147. 46(C-5) ,143. 78(C-2) ,120. 19(C-
3) ,112. 31(C-4)。经与文献[11]对照,确定化合物
5 为 2-呋喃甲酸。
化合物 6 黄色晶体(甲醇),mp. 140 ~ 142 ℃。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ:9. 13(1H,s,6-
COOH),8. 02(1H,d,J = 1. 8 Hz,2-H) ,6. 34(1H,s,
4-H) ,5. 78(1H,t,7-OH) ,4. 30(2H,d,J = 5. 48 Hz,
7-H) ;13 C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:173. 97(6-
COOH),169. 06(C-5) ,145. 59(C-3) ,139. 30(C-2) ,
109. 79(C-4) ,59. 39(7-C)。经与文献[12]对照,确
定化合物 6 为 5-羟甲基呋喃-3-羧酸。
化合物 7 无色晶体(甲醇),mp. 150 ~ 152 ℃。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12. 32(2H,s,1,5-
H),5. 50(1H,s,3-OH) ,3. 62(3H,s,7-H) ,2. 78,
(2H,d,J = 15. 4 Hz,4-H) ,2. 63(2H,d,J = 15. 4 Hz,
2-H) ;13 C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:173. 37(C-
6),171. 07(C-1,5) ,72. 87(C-3) ,51. 94(C-7) ,
42. 93(C-2,4)。经与文献[13,14]对照,确定化合
物 7 为 6-柠檬酸甲酯。
化合物 8 无色晶体(甲醇),mp. 179 ~ 181 ℃。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12. 16(s,-COOH),
2. 42(s,-CH2-);
13 C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:
173. 60(-COOH),28. 68(-CH2-)。经与文献[15,
16]对照,确定化合物 8 为丁二酸。
3. 3 化合物抑菌活性
采用最小抑菌浓度法,对分离得到的化合物进
行抑菌活性测试。从表中可以看出:化合物(2)、
(3)、(4)和(6)对测试菌均具有一定的抑菌作用,
其中化合物 3 的活性最好,对大肠杆菌的最小抑菌
浓度为 7. 81 μg /mL。本试验中,设置的牛肉膏蛋白
胨液体培养基和 DMSO 溶剂阴性对照组中测试菌
株均正常生长。
表 1 化合物 1 ~ 8 的最小抑菌浓度
Table 1 Minimum inhibitory concentration of eight
different compounds against different test bacteria
化合物
MIC /(μg·mL -1)
大肠杆菌 G - 绿脓杆菌 G - 金黄色葡萄球菌 G + 乳链球菌 G +
1 >500 250 250 >500
2 31. 3 15. 6 62. 5 62. 5
3 7. 81 15. 6 15. 6 15. 6
4 62. 5 31. 3 62. 5 31. 3
5 >500 >500 >500 >500
6 15. 6 31. 3 31. 3 62. 5
7 >500 >500 >500 >500
8 >500 >500 >500 >500
硫酸链霉素 7. 81 7. 81 - -
青霉素钠 - - 3. 91 3. 91
注:“ -”为未设置实验。
4 结论
猫儿屎内生真菌 DL06 鉴定为产黄青霉(Peni-
cillium chrysogenum)。从其发酵代谢产物中分离得
到 8 个纯品化合物,分别为 β-谷甾醇(1)、6,8-二羟
基-3-甲基异香豆素(2)、单甲基硫赭曲菌素(3)、大
黄素-8-甲醚(4)、2-呋喃甲酸(5)、5-羟甲基呋喃-3-
羧酸(6)、6-柠檬酸甲酯(7)和丁二酸(8),其中化合
物(2)、(3)、(6)和(7)为首次从产黄青霉中分离得
到。最小抑菌浓度测试结果表明,化合物单甲基硫
赭曲菌素(3)对测试菌均有很强的抑制作用。因
此,产黄青霉菌为抗菌药物提供了新的资源。
参 考 文 献
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09 科 学 技 术 与 工 程 15 卷
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Identification and Secondary Metabolities of Endophytic Fungus
Strain DL06 from Decaisnea Fargesii
XU Qian,MA Yang-min* ,QU Zi-rui,MIAO Zhi,WANG Jian,YAN Meng-ru
(Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry,Ministry of Education,
Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,P. R. China)
[Abstract] The endophytic fungus DL06 strain from Decaisnea fargesii and its secondary metabolites were stud-
ied. The strain DL06 was identified as Penicillium chrysogenum by morphological observation and ITS sequence a-
nalysis . The fermentation products were isolated and purified by manifold chromatography methods,and their
structures were elucidated by physicochemical properties and spectral analysis . Eight compounds were obtained and
determined to β-sitosterol(1),6,8-dihydroxy-3-methylisocoumarin(2) ,monomethylsulochrin(3) ,Questin(4) ,2-
furoic acid(5) ,5-hyroxymethyl furfuran-3-carboxylic acid(6) ,3-hydroxy-3-(methoxycarb onyl)pentanedi-oic
acid(7)and succinic acid(8) ,Compound(2) ,(3) ,(6) ,and (7)were isolated from the fermentation products
of Penicillium chrysogenum for the first time. An MIC method was used in antibacterial activity test,the result show
compound (3)has a strong antibacterial activity.
[Key words] Decaisnea fargesii endophytic fungus secondary metabolities antimicrobial activity
1923 期 许 倩,等:猫儿屎内生真菌 DL06 菌株的鉴定及次生代谢产物的研究