全 文 :文章编号:1001 - 4829(2015)03 - 1251 - 06 DOI:10. 16213 / j. cnki. scjas. 2015. 03. 062
收稿日期:2014 - 04 - 12
基金项目:浙江农林大学人才启动项目“珍稀濒危植物长序榆
濒危机制及保护对策研究”(2011FR015);浙江农林大学人才启
动项目“牡丹体细胞胚诱导的研究”(2011FR017)
作者简介:哀建国,男,副教授,研究方向:森林培育,* 为通讯作
者:朱向涛,男,讲师,研究方向:园林植物应用,E-mail:zxt8202
@ 163. com,* 为通讯作者。
珍稀濒危植物长序榆遗传多样性的 ISSR分析
哀建国,朱向涛* ,俞 琳
(浙江农林大学暨阳学院,浙江 诸暨 311800)
摘 要:本文对采自 3 省市的 5 个居群 67 个样本开展 ISSR分子标记分析,通过用 8 个 lSSR引物对长序榆 DNA进行扩增,所得条
带经 POPGEN 3. 2 分析,结果显示:长序榆遗传多样性处于较低水平,且主要遗传分化源于居群内部。其中古田山居群(G)遗传
多样性水平最高,松阳何山头居群(H)遗传多样性水平最低。浙江省内居群间遗传多样性水平比浙江省外高。5 个长序榆居群间
各位点平均 Ht为 0. 4221,居群内平均 Hs为 0. 3262,居群间平均遗传分化系数(Gst)为 0. 2271,说明其居群间遗传变异程度达 22.
71 %;各居群间平均基因流(Nm)为 0. 7015,表明长序榆居群间的基因交流程度有限。
关键词:长序榆,居群,ISSR,遗传多样性
中图分类号:Q943 文献标识码:A
ISSR Analysis of Genetic Diversity of Rare or Endangered Species Ulmus elongata
AI Jian-guo,ZHU Xiang-tao* ,YU Lin
(College of Jiyang ,Zhejiang Agricultural and Forestry University,Zhejiang Zhuji 311800,China)
Abstract:ISSR molecular markers analyzed by 67 samples Ulmus elongata in the group of five populations come from 3 provinces in China,
using 8 primers for DNA amplification. The results showed that Ulmus genetic diversity at a low level,and is mainly due to genetic differenti-
ation among populations inside. Gutian Mountain group (G)have the highest level of genetic diversity,while the hills Songyang population
(H)genetic diversity lowest level. The genetic diversity in Zhejiang province was higher than outside Zhejiang province. The point average
Ht of five populations was 0. 4221,within population average Hs was 0. 3262,the average genetic differentiation among populations coeffi-
cient (Gst)was 0. 2271,indicating their populations between the genetic variation of 22. 71 %;the home of the average gene flow among
populations (Nm)was 0. 7015,indicating a limited degree of gene flow between populations of Ulmus.
Key words:Ulmus elongata L.;Populations;ISSR;Genetic biodiversity
长序榆(Ulmus elongata L.)为榆科榆属植物,
国家二级保护珍稀濒危树种[1 ~ 2]。中国共有榆属植
物 20 种 4 变种,仅浙江、安徽和福建北部有少量分
布,浙江省天然零星分布于丽水松阳何山头、衢州开
化古田山以及杭州顺溪直源一带等海拔 700 ~ 900
m的山谷、沟边或山坡下部阔叶林中,数量极少[3]。
由于自然或人为因素干扰,长序榆生境破坏严
重、导致生殖障碍或近亲繁殖加剧、个体数目日渐稀
少。因此,对其遗传多样性状况研究迫在眉睫。目
前,基于分子标记技术的珍稀濒危植物遗传多样性
分析已广为应用,ISSR(Inter Simple Sequence Re-
peat)技术具有操作简单、稳定性高、扩增产物特异
性强等优点,已广泛应用于珍稀濒危植物夏蜡
梅[4]、云南金钱槭[5]、景东报春[6]、荷叶铁线蕨[7]、
香果树[8 ~ 9]、思茅木姜子[10]等的遗传多样性的分
析。
对长序榆研究主要集中在播种繁殖和更新方
面[11 ~ 12],但对长序榆遗传多样性的研究目前仍属空
白。因此,本研究从建立长序榆分子标记体系入手,
结合生境调查,以分子标记为手段,研究长序榆的遗
传多样性水平,从种间遗传多样性、种内遗传多样性
水平探讨长序榆濒危的原因,提出保护措施以及保
护策略,为今后长序榆种质资源保护和持续利用提
供科学依据。
1521
2015 年 28 卷 3 期
Vol. 28 No. 3
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
1 材料与方法
1. 1 试验材料
材料采集于全国 3 个省份具一定代表性的 5 个
长序榆居群,共计 67 个样品,采集地点分别为:安徽
省黄山市居群 14 个(A);浙江省杭州临安市顺溪
镇直源居群 8 个(Z);浙江省丽水市松阳县何山头
村 6 个(H) ;浙江衢州市开化县古田山居群 28 个
(G) ;福建省南平市东山头村居群 11 个 (F)。样品
于 2007 年 3 月长序榆叶片幼嫩时采集。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 长序榆 DNA 的提取 本研究采用改进
CTAB法提取长序榆总 DNA。最后将提取出的产物
用 0. 5 %琼脂糖凝胶电泳检查产量,并利用分光光
度计检测所得产物质量。 - 20 ℃保存。
1. 2. 2 PCR产物检测 用适量 1 × TE 溶解经 PCR
扩增出的 DNA,用 754 型分光光度计(上海)检测
DNA浓度和质量。PCR 反应体系为:25 μl 反应体
系中含有 ddH2O 14. 25 μl,10 × buffer 2. 5 μl,primer
2. 0 μl(2 mmol· L -1),dNTP 2. 0 μl(2 mmol·
L -1),Taq 酶 0. 25 μl(1. 25 U·L -1)(Tiangen) ,
DNA模板 2. 0 μl(2 mmol·L -1)。本实验采用 PCR
反应程序,即 94 ℃预变性 5 min,然后进行 44 个循
环:94 ℃变性 45 s,55 ℃复性 45 s,72 ℃延伸 1. 5
min;循环结束后 72 ℃延伸 10 min,最后 4 ℃保存。
用 0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物浓度。
4 μl的 DL-2000(大连宝生生物工程有限公司 Taka-
ra)做 marker,检查所得 DNA 大致分子量。 - 20 ℃
保存。PCR产物在含 5 %溴化乙锭(EB)的 1 % 琼
脂糖凝胶中电泳,以 2000 Pb Marker(DL-2000)作为
标准分子量对照,在 120 V 稳定直流电压的条件下
电泳 35 min,EPSON(Japan)紫外自动成像仪照相,
确定位点。
1. 2. 3 ISSR 引物的筛选 本研究所用 ISSR 引物
是根据加拿大 Brithsh Columbia University 公布的序
列进行设计的,并经上海生工公司合成。使用纯度
相对较好的古田山 3 号(G3)个体的 DNA 作为模
板,利用优化后的 ISSR-PCR体系从 100 个备选引物
中筛选出 8 个扩增条带较多、信号强、背景清晰且具
有多态位点的引物(表 1)。
1. 2. 4 电泳、拍照与统计分析 将电泳图谱同一位
置清晰出现的条带记为“1”,没有的条带记为“0”,
将条带信息转换成“0”和“1”组成的原始矩阵。假
设各个长序榆居群处于 Hardy-weinberg 平衡,计算
不同居群之间的遗传分化水平。采用双倍体优势分
析(Dominant diploid data),置信区间设为 95 %(P
= 0. 05),在这个置信基础上的最大拟似数(The
mumber ofsimulation for neutrality)设为 1000。利用
Popgene 32 软件对居群所有个体条带的分布状况进
行遗传分析,并分别计算其多态性位点百分数
(PPb)、等位基因数、群体总基因多样性(Ht)、群体
内基因多样性(Hs),群体间遗传分化指数(Gst)、
Shannon信息指数(I)、平均异合子性(h)以及遗传
相似系数(Nei)等指标[13 ~ 14]。
2 结果与分析
2. 1 长序榆 ISSR条带统计
在扩增所得总的 154 条条带中,多样性条带有
108 条。在居群水平上,古田山居群(G)含有 78. 5
%的多样性条带,为各居群之首;而安徽黄山(A)、
松阳何山头(H)、顺溪直源(Z)和福建东山头(F)居
群分别含有 72. 4 %、77. 2 %、67. 3 %和 69. 8 %的
多样性条带。
在所有多态性条带中,地理位置分布在浙江的
居群———古田山居群、顺溪直源居群和松阳何山头
居群共检测到 123 个多态位点,而分布在浙江省范
围之外的福建东山头、安徽黄山两个居群共检测到
143 个多态位点。对所有 266 个多态位点做分布频
率分析,结果显示有 116 个位点在总位点中出现的
频率达到 0. 005 以上,属于中等频率到高等频率等
位基因,占 62. 4 %;其中古田山居群所包含有 101
个中高频等位基因数,约占总体的 38 %。
中高频基因分布情况:浙江省范围内分布的长
序榆居群保存了 50. 73 %的中高频率等位基因;而
表 1 筛选出的引物及其序列
Table 1 Screened primers and sequence
引物号 引物序列 引物号 引物序列
UBC864 ATGATGATG ATG ATGATG UBC855 ACACACACACACACACY
UBC873 GACAGACAGACAGACA UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA
UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC UBC825 ACACACACACACACACT
UBC827 ACACACACACACACACG UBC892 TAGATCTGATATCTGAATTCCC
注:根据 University of British Columbia公布的通用序列,其中 Y =(C,T)。
Note:According to the general sequence of University of British Columbia announced,where Y = (C,T).
2521 西 南 农 业 学 报 28 卷
图 1 部分长序榆 ISSR扩增的结果(UBC873 + G1 ~ G17)
F ig. 1 Part of Ulmus elongata ISSR amplification(UBC873 + G1 - G17)
浙江省范围外分布的长序榆居群则保存了 49. 27 %
的中高频率等位基因。
2. 2 长序榆遗传结构及其多样性
各群体总基因多样性(Ht)、群体内基因多样性
图 2 部分长序榆 ISSR 扩增的结果(UBC828 + H1 ~
H6;A1 ~ A12;Z1 ~ Z6)
Fig. 2 Part of Ulmus elongata ISSR amplification(UBC828 + H1 -
H6;A1 - A12;Z1 - Z6)
(Hs),群体间遗传分化指数(Gst)、Shannon 信息指
数(I)、基因流(Nm)等统计结果如表 2。
表 2 各居群多样性指数平均值
Table 2 Average values of genetic variation statistics for all loci
居群 Ht Hs Gst Nm
G1 0. 3717 0. 2618 0. 2955 1. 1923
G2 0. 4434 0. 4271 0. 0368 3. 0766
G3 0. 4461 0. 4107 0. 0793 5. 8078
G4 0. 4905 0. 3815 0. 2221 1. 7511
G5 0. 4869 0. 4647 0. 0457 8. 4448
G6 0. 4772 0. 4453 0. 0670 6. 9659
G7 0. 2256 0. 1602 0. 2899 1. 2249
G8 0. 3599 0. 2805 0. 2205 1. 7678
G9 0. 4697 0. 2195 0. 5326 0. 4387
G10 0. 4120 0. 3370 0. 1819 2. 2482
G11 0. 4842 0. 2498 0. 4842 0. 5327
G12 0. 4964 0. 3817 0. 2312 1. 6627
G13 0. 4101 0. 3838 0. 0643 7. 2809
G14 0. 4396 0. 3754 0. 1461 2. 9224
G15 0. 3534 0. 2545 0. 2800 1. 2857
G16 0. 4414 0. 4039 0. 0849 5. 3918
G17 0. 4728 0. 4686 0. 0090 5. 0637
G18 0. 4537 0. 3849 0. 1517 2. 7953
G19 0. 4698 0. 4233 0. 0990 4. 5480
G20 0. 4264 0. 3650 0. 1440 2. 9721
G21 0. 3639 0. 3195 0. 1222 3. 5924
G22 0. 4300 0. 1242 0. 7112 0. 2030
G24 0. 4992 0. 4444 0. 1097 4. 0589
G25 0. 4943 0. 4673 0. 0546 8. 6655
G26 0. 4237 0. 1782 0. 5794 0. 3630
G27 0. 3569 0. 2279 0. 3614 0. 8834
G28 0. 4840 0. 2313 0. 5220 0. 4578
35213 期 哀建国等:珍稀濒危植物长序榆遗传多样性的 ISSR分析
续表 2 Continued table 2
居群 Ht Hs Gst Nm
A1 0. 3815 0. 3232 0. 1530 2. 7689
A2 0. 4984 0. 4928 0. 0111 4. 4249
A3 0. 4836 0. 4620 0. 0446 0. 7140
A4 0. 4023 0. 3639 0. 0953 4. 7453
A5 0. 3370 0. 2973 0. 1177 3. 7471
A6 0. 2214 0. 2055 0. 0719 6. 4570
A7 0. 4916 0. 0657 0. 8664 0. 0771
A8 0. 4411 0. 3629 0. 1774 2. 3184
A9 0. 4741 0. 3627 0. 2349 1. 6285
A11 0. 4128 0. 3453 0. 1634 2. 5605
A12 0. 4974 0. 2961 0. 4047 0. 7355
A13 0. 4997 0. 3312 0. 3373 0. 9824
A14 0. 4765 0. 2170 0. 5445 0. 4182
F1 0. 3086 0. 2733 0. 1143 3. 8742
F2 0. 3206 0. 1990 0. 3794 0. 8179
F3 0. 4990 0. 4702 0. 0577 8. 1703
F4 0. 3154 0. 1898 0. 3982 0. 7555
F5 0. 4970 0. 3001 0. 3961 0. 7623
F6 0. 4616 0. 2296 0. 5027 0. 4947
F7 0. 0359 0. 0348 0. 0299 6. 2221
F8 0. 4369 0. 3307 0. 2430 1. 5576
F9 0. 4205 0. 3942 0. 0625 7. 4967
F10 0. 4623 0. 4497 0. 0273 7. 8275
F11 0. 4463 0. 4053 0. 0918 4. 9457
F12 0. 4526 0. 4297 0. 0506 9. 3909
F13 0. 4226 0. 3605 0. 1470 2. 9022
F14 0. 3435 0. 3253 0. 0531 8. 9134
H1 0. 4128 0. 3001 0. 5027 0. 7623
H2 0. 4970 0. 3453 0. 2221 1. 2634
H3 0. 4616 0. 4928 0. 0111 2. 5605
H4 0. 4902 0. 3512 0. 3961 0. 4947
H5 0. 4905 0. 2296 0. 2835 1. 7511
H6 0. 4984 0. 3815 0. 1634 4. 4249
Z1 0. 4053 0. 3307 0. 1168 2. 2346
Z2 0. 4226 0. 3988 0. 2343 2. 1543
Z3 0. 4205 0. 3546 0. 1865 0. 7876
Z4 0. 4158 0. 3421 0. 2245 2. 9032
Z5 0. 4222 0. 3498 0. 1923 3. 9534
Z6 0. 4235 0. 3457 0. 1123 1. 7323
Z7 0. 4186 0. 3126 0. 2156 1. 2622
Z8 0. 4178 0. 3096 0. 2213 2. 5805
Species 0. 4221 0. 3262 0. 2271 0. 7015
经条带统计和软件分析得,浙江省 3 个居群的 各项遗传多样性指标平均值分别为:古田山居群
4521 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 3 各居群位点遗传多样性指数平均值
Table 3 Summary of genic variation statistics for all koci
居群 Na Ne h I
G 1. 9818 1. 6170 0. 3493 0. 5177
A 1. 9091 1. 5927 0. 3343 0. 4931
Z 1. 8364 1. 5428 0. 3074 0. 4542
H 1. 7455 1. 5523 0. 3056 0. 4430
F 1. 8545 1. 5939 0. 3344 0. 4895
注:Na为平均每位点等位基因数;Ne为平均每位点有效等位基因数。
Note:Na is the average number of alleles per locus;Ne is the average effective number of alleles per locus.
表 4 基于 Nei’s的遗传距离与遗传一致度分析
Table 4 Nei's original measures of genetic identity and genetic distance
pop ID G A Z H F
G - 0. 9083 0. 8262 0. 8087 0. 8249
A 0. 0962 - 0. 8510 0. 8582 0. 7839
Z 0. 1910 0. 1613 - 0. 8219 0. 7713
H 0. 2123 0. 1529 0. 1961 - 0. 7709
F 0. 1925 0. 2435 0. 2597 0. 2601 -
(G)Shannon信息指数 I = 0. 5177,群体内基因多样
性 Hs = 0. 3493,群体总基因多样性 Ht = 0. 3486;顺
溪直源居群(Z)I = 0. 4542,Hs = 0. 3074,Ht = 0.
3145;松阳何山头居群(H)I = 0. 4430,Hs = 0. 4056,
Ht = 0. 3854;另外两个居群的各项遗传多样性指标
平均值分别为:安徽黄山居群(A)I = 0. 4931,Hs =
0. 4230;Ht = 0. 3484;福建东山头居群(F)I = 0.
4895,Hs = 0. 3445;Ht = 0. 3375。
表 3 结果显示,长序榆 5 个自然居群内的 shan-
non信息指数(I)变化范围为 0. 4430 到 0. 5177 之
间.其中遗传多样性水平最高的为古田山居群(G),
而松阳何山头长序榆居群(H)的遗传多样性水平表
现为最低。
5 个长序榆居群间各位点总的遗传变异 Ht 平
均为 0. 4221,居群内的遗传变异 Hs为 0. 3262,居群
间的遗传分化系数 Gst = 0. 2271,表明居群间遗传变
异程度达到了 22. 71 %,而存在于居群内的变异程
度则达到了 77. 29 %,各居群间平均的基因流 Nm
= 0. 7015,小于 1,表明居群间的基因交流程度有
限。由此认为长序榆遗传变异主要存在于居群内,
这和后面所论及的大部分长序榆省外居群的遗传变
异来自于长序榆居群内部的遗传分化是一致的,这
也说明了另一现状,就是目前绝大部分长序榆居群
(特别是省外居群)的进化动力还是源于其居群内
部相对丰富的遗传分化。
用 Popgene3. 10 软件计算 Nei’s 遗传距离(D)
和遗传一致度(I),其中表 4 分隔符上方数据是指居
群间遗传一致度,分隔符下方数据是指居群间遗传
距离。图 3 是利用 popgene 软件绘制的基于 UPG-
MA的长序榆居群 Nei’s遗传距离图。由图 3 可见,
安徽黄山(A)和古田山居群(G)的遗传距离最近,
遗传一致度也最大,达 90. 83 %(表 3),顺溪直源居
群与古田山居群和安徽黄山居群亲缘关系较近,何
山头居群与以上 3 个居群的亲缘关系较为疏远。福
建东山头居群和浙江、安徽居群亲缘关系最为疏远。
在 Popgene分析中(表 4),将 5 个居群依据行
政区域划分为浙江居群组和非浙江居群组 2 个群组
(Group)。总结比较在浙江境内分布的长序榆居群
与非浙江分布的居群之间的遗传多样性的差异。结
果显示,与其他居群相比,浙江境内分布的 3 个居群
(G、H、Z)Shannon多样性信息指数(I)为 0. 5774,Ht
值和 Hs值分别为 0. 4029 和 0. 3208;浙江省外居群
(A、F)平均 Shannon多样性信息指数(I)为 0. 5899,
Ht值和 Hs值分别为 0. 4063 和 0. 3343。由此可见,
在浙江省内分布的居群比浙江省外分布的居群间遗
传多样性水平相比要高,这可能是长序榆在浙江分
布数量众多,居群分布地比较集中的原因,加上各个
居群之间的地理位置较接近,群体间基因流动频繁;
G 古田山居群
A 安徽黄山居群
Z 顺溪直源居群
H 松阳何山头居群
F 福建东山头居群
图 3 基于 UPGMA的 Nei’s遗传距离图
Fig. 3 Dendrogram based on Nei's(1978)genetic distance by UPGMA
55213 期 哀建国等:珍稀濒危植物长序榆遗传多样性的 ISSR分析
表 4 浙江居群和非浙江居群群组间遗传多样性指标比较
Table 4 The genetic diversity index comparison between Zhejiang populations group and others
群组 组成居群 Ne h I
浙江居群 G /Z /H 1. 7096 0. 3961 0. 5774
非浙江居群 A /F 1. 7203 0. 4052 0. 5899
群组 组成居群 Ht Hs Gst
浙江居群 G /Z /H 0. 4029 0. 3208 0. 2038
非浙江居群 A /F 0. 4063 0. 3343 0. 1771
与此同时,浙江省外长序榆居群由于居群分布点较
少且分散,因此他们的进化动力还是主要依赖于群
体内的遗传变异,导致居群内部遗传性较高。长距
离的地理隔离也导致居群间的遗传变异程度不如其
内部的遗传变异显得丰富。
3 讨 论
造成长序榆濒危原因十分复杂,不能一概而论,
更不能以偏概全,但遗传多样性低也是导致珍稀物
种长序榆濒危的主要原因之一。从某种意义上因为
长序榆对环境的变化的适应能力以及潜力,依赖于
它的遗传多样性。随着人类活动加剧,长序榆生境
破碎化,造成近亲繁殖严重,基因流水平下降,遗传
多样性指标(如 GST、shannon 指数)值普遍偏低,这
导致了长序榆遗传变异水平的下降,尤其是在其居
群水平上体现出来。
本试验对采自全国 3 省市的 5 个居群 67 个样
本开展 ISSR分子标记分析,通过用 8 个 lSSR 引物
对长序榆 DNA 进行扩增,所得条带经 POPGEN 32
分析,结果显示:长序榆遗传多样性处于较低水平,
且主要遗传分化源于居群内部。但这种源于内部的
进化动力也将随着长序榆生境的进一步破碎化、地
理隔离因素的深化隔离导致群落内部近亲繁殖现象
加剧而逐渐消竭。
根据长序榆居群水平的遗传多样性较低以及分
布地理位置较为零散等特点,在对长序榆的保护中,
不能运用单一的手段和简单的方法,应采取综合措
施,要对长序榆物种及其遗传多样性进行有效保护,
实施有效的解危措施,必须查明其致濒因子,这有赖
于基础研究的加强。如查明长序榆的种群动态、繁
育系统、极端环境压力下的抗逆性、人为干扰对物种
的影响等,可以揭示长序榆生活史的薄弱环节,区分
致濒的内在机制和外部原因,为物种保护、人工栽培
或驯化提供科学依据[15]。
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(责任编辑 李 洁)
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