全 文 ：地梢瓜苷对人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制
司艳红1， 商 朝2， 祝云平1， 宋葆华2， 李卫红1， 商战平1*
(1． 泰山医学院病理生理学教研室，山东 泰安 271000;2． 内蒙古民族大学，内蒙 通辽 028041)
收稿日期:2015-04-10
基金项目:山东省教育厅课题 (03K10) ;山东高校科技计划项目 (J09LF69) ;泰山医学院重点课题 (2003ZＲ01)
作者简介:司艳红 (1978—) ，女，硕士，副教授，从事动脉粥样硬化机制研究。Tel: (0538)6225010，E-mail:zhaosixinkang@
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* 通信作者:商战平 (1960—) ，女 (满族) ，硕士，教授，从事动脉粥样硬化防治研究。Tel: (0538)6225010，E-mail:zhpshang@
126． com
摘要:目的 观察地梢瓜苷 (CG)对低氧低糖损伤的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的保护作用，并探讨相应的机
制。方法 培养 HUVEC，随机分为 5 组，即对照组，模型组及地梢瓜苷低、中、高剂量组。MTT法检测细胞存活率，
TUNEL法及 Annexin V-FITC /PI 双染法检测内皮细胞凋亡，试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶 (LDH)漏出及丙二醛
(MDA)产生，酶联免疫吸附试验检测细胞分泌内皮素 (ET)及前列环素 (PGI2)水平。结果 地梢瓜苷预孵育细
胞后，提高低氧低糖损伤的内皮细胞存活率，改善细胞凋亡。同时，地梢瓜苷减少了低氧低糖损伤的内皮细胞 LDH
漏出及 MDA产生，降低了 ET的分泌，增加了 PGI2 的分泌。结论 地梢瓜苷可通过增加血管内皮细胞的存活率、减
轻氧化应激和细胞膜通透性、调节血管活性物质的分泌从而发挥保护内皮细胞的作用。
关键词:地梢瓜苷;动脉粥样硬化;人脐静脉内皮细胞;凋亡
中图分类号:Ｒ966 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)07-1611-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 07. 039
动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)性心血管疾病严
重威胁人类健康，其发病率与死亡率均在疾病谱中排于首
位，其发生机制复杂。血管内皮细胞 (vascular endothelial
cell，VEC)位于血管内壁最外层，以往认为 VEC只是作为
一层物理屏障为血液流动提供光滑界面，随着科研发展，
已证实其还能分泌多种活性物质，以调节血管壁的张力及
氧化应激水平、白细胞的黏附及血栓形成和平滑肌细胞的
迁移及增殖［1］。目前认为，VEC 功能障碍及凋亡是 AS 发
生的起始环节，并贯穿于 AS 进展的整个过程，保护血管
壁内皮细胞是防治 AS的重要措施之一。
地梢瓜属萝摩科植物，全草和果实均有药用价值，可
治疗肿瘤、肝炎、脑血栓等疾病，能够清除氧自由基、耐
缺氧，具有较强的抗炎、抗氧化功能［2］。地梢瓜苷是地梢
瓜的重要成分之一，前期研究显示［3］，地梢瓜苷 (cynan-
chum glycoside，CG)能够抑制脂质过氧化反应，对大脑皮
层神经元具有保护作用。目前，有关地梢瓜苷对血管内皮
功能的影响尚无报道，本研究旨在探讨地梢瓜苷对低氧低
糖损伤的人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothe-
lial cell，HUVEC)的保护作用。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂 地梢瓜提取物由吉林大学化学系研制并赠
送。HUVEC细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所;
缺氧培养盒及气体混配器购于长沙长锦科技有限公司;胎
牛血清 (FBS)、胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司;DMEM 高
糖培养基购于北京索莱宝科技有限公司;四氮唑蓝 (MTT)
粉末购于美国 Sigma公司;乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogen-
ase，LDH)和丙二醛 (malondialdehyde，MDA)检测试剂
盒购于南京建成生物工程研究所;内皮素 (endothelin，
ET)及前列环素 (prostacyclin，PGI2)酶联免疫检测试剂
盒购于北京华安麦科生物技术有限公司;TUNEL 试剂盒购
自瑞士 ＲOCHE 公司;Annexin V-FITC /PI 细胞凋亡检测试
剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1. 2 地梢瓜苷制备［4-5］ 取地梢瓜 ［Cynanchum thesioides
(Freyn)K． Schum，内蒙古通辽本地产，由吉林大学化学
系专家鉴定］果实 5 kg ，干燥粉碎后按体积比 1 ∶ 2 加入
75%乙醇回流提取 3 次 (每次 2 h)，合并提取液，干燥后
得浸膏 320 g。将浸膏按体积比 1 ∶ 2 重悬于水中，用石油
醚、乙酸乙酯萃取后加入等体积的正丁醇萃取总苷，重复
3 次，合并萃取液，减压蒸干，制备成 6 g 地梢瓜总苷浸
膏。将提取的地稍瓜总苷在酸性溶液中与蒽酮加热，产生
绿色反应，于 620 nm波长处进行比色测定，根据标准品的
吸光度计算出浸膏中总苷含有量为 18. 4%。同时，用原子
吸收-分光光度法检测提取液中铅含有量分别为 0. 186 mg /L
和 0. 165 mg /L，均小于国家卫生法规定的 1 mg /L。用
DMEM缓冲液溶解浸膏，配制成 1 mg /mL 的地梢瓜苷原
液，过滤除菌后备用。
1. 3 低氧低糖损伤内皮细胞模型［6］ 用无血清无糖的
DMEM培养基代替含有 10% FBS 的高糖 DMEM 培养基培
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养细胞。然后，把培养板放在充满厌氧气 (成分为 95%
N2、5% CO2)的气盒中，封闭气盒，在 37 ° C、5% CO2
的湿润培养箱中培养细胞 24 h，造成细胞损伤。
1. 4 细胞培养和实验分组 HUEVC生长于含 10% FBS 的
DMEM高糖培养基中，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。
细胞生长汇合成单层后，胰酶消化并收集细胞，均匀接种
于 6 孔或 96 孔培养板中。细胞同步化处理后，随机分为 5
组，对照组，无损伤及药物干预;模型组，低氧低糖环境
损伤细胞 24 h;地梢瓜苷低、中、高剂量组，分别给予
50、100、200 mg /L的地梢瓜苷，预孵育 24 h 后于低氧低
糖环境损伤细胞 24 h。细胞干预结束后，检测相应指标。
1. 5 MTT法检测内皮细胞存活率 HUVECs 接种于 96 孔
培养板中，干预完毕后，向每孔加入含 0. 5% MTT 的培养
基 20 μL，继续培养 4 h，弃培养液，加入 150 μL二甲基亚
砜 (DMSO)液，振荡 10 min，待结晶完全溶解后，用酶
标仪于 490 nm波长处测定吸光值。实验重复 3 次，每次 3
个复孔。
1. 6 TUNEL法检测内皮细胞凋亡 通过脱氧核糖核苷酸
末端转移酶，可以把核苷酸 (地高辛标记)结合于凋亡细
胞断裂的 DNA 3-OH末端，然后地高辛抗体 (过氧化酶标
记)与地高辛结合，显色底物二甲基联苯胺 (DAB)可通
过过氧化酶显色，因此着色的细胞即为凋亡细胞，检测方
法详见试剂盒说明书。显微镜下计算每 100 个细胞内的阳
性细胞数，即为凋亡指数。
1. 7 Annexin V-FITC /PI双染检测内皮细胞凋亡 Annexin
V-FITC /PI双染法测定内皮细胞凋亡根据试剂盒说明书操
作，主要过程为细胞损伤 24 h 后，收集细胞，PBS 洗涤两
次，500 μL 反应缓冲液重悬，然后加入 5 μL Annexin V-
FITC和 5 μL PI，混匀后于室温避光放置 10 m，流式细胞
仪检测，激发波长 Ex 488 nm;发射波长 Em 530 nm。
1. 8 乳酸脱氢酶 (LDH)活性和丙二醛 (MDA)含有量
的检测 各组细胞培养液离心后，取上清，根据试剂盒说
明书操作，最后采用紫外分光光度计检测。
1. 9 内皮素 (ET)及前列环素 (PGI2)水平的检测 各
组细胞培养液中的 ET 及 PGI2 水平采用酶联免疫吸附法
(ELISA法)检测，主要过程为用纯化的 ET或 PGI2 抗体包
被微孔板，依次加入标本或标准品、生物素化抗体、辣根
过氧化物酶 (HＲP)标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底
物 (TMB)显色。酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度，计
算样品浓度。
1. 10 统计学处理 实验结果以均数 ±标准差 (x ± s)表
示，数据处理应用 SPSS 12. 0 软件包进行单因素方差分析，
均数间的两两比较采用最小显著差异法 (LSD 法) t 检验，
P ＜ 0. 05 说明有统计学意义。
2 结果
2. 1 地梢瓜苷提高低氧低糖损伤的内皮细胞存活率 内皮
细胞经低氧低糖损伤 24 h后，细胞活性降低了 38%，地梢
瓜苷预孵育可显著逆转此抑制效应 (P ＜ 0. 01)，对 HU-
VECs起到保护作用，见图 1。
注:与对照组比较，##P ＜ 0. 01;与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 1 地梢瓜苷对细胞存活率的影响
2. 2 地梢瓜苷改善低氧低糖诱导的内皮细胞凋亡 低氧低
糖处理 HUVEC细胞 24 h后，TUNEL染色阳性细胞 (早期
凋亡细胞)数明显增加 (P ＜ 0. 01) ，与空白对照组相比升
高了 5. 77 倍，而用地梢瓜苷预孵育 24 h后，可明显减少低
氧低糖诱导的内皮细胞凋亡 (P ＜ 0. 01) ，且干预效果呈剂
量依赖性，见图 2。Annexin V-FITC /PI 双染后通过流式细
胞仪分析细胞凋亡的结果与 TUNEL染色一致，也显示地梢
瓜苷干预后明显减轻低氧低糖诱导的内皮细胞凋亡，见
图 3。
注:与对照组比较，##P ＜ 0. 01;与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 2 TUNEL法检测地梢瓜苷对 HUVECs凋亡指数的影响
2. 3 地梢瓜苷减少低氧低糖损伤的内皮细胞 LDH 漏出及
MDA产生 模型组细胞培养液中 LDH 活性明显升高，为
正常对照组的 2. 5 倍 (P ＜ 0. 01)。地梢瓜苷预孵育后可明
显降低细胞培养液中 LDH 活性 (P ＜ 0. 01)，与模型组相
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注:左下象限为正常细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡和坏死细胞，左上象限为坏死细胞
图 3 Annexin V-FITC/PI双染检测内皮细胞凋亡
比，地梢瓜苷低、中、高剂量组 LDH 活性分别降低了
33%、49%及 41%。同时，低氧低糖损伤细胞 24 h还引起
了 HUVEC细胞培养液中 MDA水平明显升高 (和对照组相
比，P ＜ 0. 01)，这说明细胞处于较严重的氧化应激状态。
地梢瓜苷低、中、高剂量预孵育细胞 24 h均可显著降低培
养液中 MDA水平 (P ＜ 0. 01) ，见表 1。
表 1 地梢瓜苷对低氧低糖损伤内皮细胞 LDH 漏出及
MDA的影响 (x ± s)
组别
剂量 /
(mg·L －1)
LDH/
(U·L －1)
MDA /
(nmol·mL －1)
对照组 － 24. 45 ± 5. 95 1. 39 ± 0. 54
模型组 － 60. 07 ± 6. 27## 9. 43 ± 0. 35##
地梢瓜苷低剂量组 50 40. 29 ± 6. 89＊＊ 4. 12 ± 0. 41＊＊
地梢瓜苷中剂量组 100 30. 46 ± 5. 03＊＊ 3. 86 ± 0. 54＊＊
地梢瓜苷高剂量组 200 35. 27 ± 7. 03＊＊ 1. 95 ± 0. 46＊＊
注:与对照组比较，##P ＜ 0. 01;与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
2. 4 地梢瓜苷减少低氧低糖损伤内皮细胞 ET 的分泌，增
加 PGI2 的分泌 与对照组相比，低氧低糖环境使内皮细胞
分泌 ET明显增多 (P ＜ 0. 01);与模型组相比，地梢瓜苷
低、中、高剂量预孵育 HUVECs 后可使培养液中 ET 水平
明显降低 (P ＜ 0. 01)，且效果呈剂量依赖性，见表 2。
本实验采用 ELISA法通过检测细胞培养液中 PGI2 稳定
代谢产物 6-酮-前列环素 F1α (6-keto-prostaglandin F1α，6-
keto-PGF1α)间接反应其水平。实验结果显示，与对照组相
比，低氧低糖损伤能够明显降低细胞培养液中 6-keto-PGF1α
含有量 (P ＜ 0. 01) ，这可能与内皮细胞膜上合成 PGI2 的
前体物质花生四烯酸遭到破坏引起 PGI2 合成减少有关;与
模型组相比，地梢瓜苷预孵育后可使细胞培养液中 6-keto-
PGF1α水平呈剂量依赖性升高，其中低剂量组效果无统计学
意义 (P ＞ 0. 05) ，而中、高剂量组效果具有显著性差异
(P ＜ 0. 01) ，这提示地梢瓜苷可促进血管内皮细胞合成
PGI2，见表 2。
表 2 地梢瓜苷对低氧低糖损伤内皮细胞分泌 ET 和 PGI2
的影响 (x ± s)
组别
剂量 /
(mg·L －1)
ET /
(pg·mL －1)
6-keto-PGF1α /
(pg·mL －1)
对照组 － 21. 14 ± 4. 76 165. 19 ± 24. 76
模型组 － 66. 59 ± 5. 12## 107. 24 ± 20. 98##
地梢瓜苷低剂量组 50 49. 21 ± 7. 15＊＊ 128. 65 ± 19. 18
地梢瓜苷中剂量组 100 22. 43 ± 5. 89＊＊ 175. 63 ± 14. 84＊＊
地梢瓜苷高剂量组 200 26. 88 ± 3. 42＊＊ 197. 27 ± 17. 42＊＊
注:与对照组比较，##P ＜ 0. 01;与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3 讨论
血管内皮细胞损伤和功能障碍与 AS 的发生发展密切
相关。内皮细胞数量减少或结构改变均可引起内皮屏障功
能降低，通透性升高，从而使血液中过多的脂质及单核细
胞易于沉积到内皮下，并进一步转变为泡沫细胞和 AS 斑
块。此外，已有研究证明，AS进展过程中血管内皮依赖性
舒张反应降低或消失与 AS 时内皮细胞分泌活性物质失调
有关，即舒血管物质分泌减少或者缩血管物质分泌增
多［7］。因此，内皮细胞功能障碍及其数量减少可启动 AS
的形成及发展，最终造成心血管疾病的发生，保护和改善
血管内皮功能对 AS的防治具有重要意义。
地梢瓜主要生长于温带、热带地区，果实的形状如瓜，
富含大量乳汁，营养价值较高。性苦、凉，功能可清“协
日”，止腹泻，是一种很好的天然药品。我们前期研究采
用原代培养的大脑皮层神经元细胞，观察了地梢瓜苷对过
氧化氢及谷氨酸引起的细胞损伤的保护作用，结果发现地
梢瓜苷明显逆转了损伤的神经元细胞凋亡，并降低了神经
元细胞内的 MDA水平，这提示地梢瓜苷能够抗氧化，对神
经系统有保护功能［3］。在本实验中我们观察了地梢瓜苷对
低糖低氧损伤的 HUVEC 细胞的影响，发现: (1)地梢瓜
苷升高了损伤的内皮细胞的存活率，降低了细胞凋亡指数;
(2)地梢瓜苷减少了细胞培养液中的 MDA 水平，对低氧
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低糖诱导的脂质过氧化有拮抗作用; (3)地梢瓜苷减少了
受损的内皮细胞 LDH 漏出，对细胞膜损伤有保护作用;
(4)地梢瓜苷降低了培养液中缩血管因子 ET 水平，升高
了舒血管因子 PGI2 的水平，对内皮细胞分泌血管活性物质
具有调节作用。这些发现为地梢瓜苷的药理作用提供了新
内容。
氧化应激可通过多种途径损伤血管内皮细胞。自由基
可直接损伤内皮细胞，改变其形态结构，使细胞完整性破
坏;脂质过氧化可引起细胞的转运能力和酶的活性降低，
造成细胞内钙离子水平改变;氧自由基可引起细胞内蛋白
和核酸变性，引起细胞坏死和凋亡［8］。与以往报道一致，
在本实验中亦发现低氧低糖诱导内皮细胞产生脂质过氧化
物 MDA增多，而地梢瓜苷可减少细胞培养液中 MDA水平，
这可能与地梢瓜苷抗氧化、减少自由基作用密切相关。细
胞膜发生脂质过氧化，以及低氧低糖环境中 ATP 缺乏，均
可引起细胞膜形态结构破坏，通透性升高，这样可造成细
胞内乳酸脱氢酶外漏。本实验结果显示，地梢瓜苷可通过
保护内皮细胞，减少细胞培养液中 LDH水平。
ET与 PGI2 均是调节血管张力的活性物质。ET 与其受
体结合后，一方面可激活磷酸肌醇途径，使胞外钙离子内
流和胞内肌浆网释放钙离子增加，从而引起胞浆钙离子水
平迅速升高;另一方面，还可引起胞膜去极化，诱导电压
依赖性钙离子内流使胞内钙离子水平升高，最终引起血管
强烈收缩［9］。ET不仅引起血管收缩，还可引起血管平滑肌
细胞增殖和结构重建。这些均促进了 AS 的发生发展。与
ET功能相反，PGI2 则是强有力的血管舒张剂。低糖低氧可
导致人脐静脉内皮细胞前列环素分泌减少，这一方面可引
起前列环素抗细胞凋亡的作用减弱;另一方面，PGI2 对 ET
的合成有负反馈调节作用，PGI2 减少可反射性引起 ET 分
泌进一步增多［10］。在本实验中，地梢瓜苷促进了 HUVEC
细胞分泌 PGI2，抑制 HUVEC细胞分泌 ET，这提示地梢瓜
苷具有调节血管功能、抑制 AS进展的作用。
实验发现，地梢瓜苷 100、200 mg /L 对内皮细胞的保
护作用比较明显，以往研究亦显示，地梢瓜苷 100 mg /L对
神经细胞的保护效果较显著［3］，这提示100 mg /L左右可能
是地梢瓜苷发挥其疗效的最佳血药浓度。
综上所述，地梢瓜苷可通过增加血管内皮细胞的存活
率，降低凋亡指数，减轻氧化应激和细胞膜通透性，调节
血管活性物质的分泌，从而起到保护内皮细胞的作用，这
些研究结果将为地梢瓜苷防治心血管疾病提供新线索，为
其临床应用提供实验基础。随着生活水平的提高和自我保
健意识的增强，地梢瓜苷作为一种天然药物，其应用将不
断推广。
参考文献:
［1］ Ｒajendran P，Ｒengarajan T，Thangavel J，et al． The vascular
endothelium and human diseases［J］． Int J Biol Sci，2013，9
(10):1057-1069．
［2］ 阿拉探巴干． 蒙药材地梢瓜现代研究进展［J］． 北方药学，
2012，9(9) :33-34．
［3］ 商战平，王德兴，商 朝，等． 地梢瓜甙对神经细胞脂质
过氧化反应和 DNA损伤的保护作用实验研究［J］． 哲里木
畜牧学院学报，2000，10(4) :8-10．
［4］ 张云香，杨志孝，尹迎春，等． 泰山蜂胶的提取方法及总
黄酮含量的测定［J］． 实用医药杂志，2005，22(10):
915-916．
［5］ De Lange D W，Van Golden P H，Scholman W L，et al． Ｒed
wine and red wine polyphenolic compounds but not alcohol in-
hibit ADP-induced platelet aggregation［J］． Eur J Intern Med，
2003，14(6) :361-366．
［6］ 陈仕奇，陈龙浩，蒋琳兰． 银杏叶提取物和茶多酚联用对
缺氧环境中内皮细胞的影响［J］． 安徽农业科学，2012，40
(23) :11549-11550．
［7］ Dave T，Ezhilan J，Vasnawala H，et al． Plaque regression and
plaque stabilisation in cardiovascular diseases［J］． Indian J En-
docrinol Metab，2013，17(6) :983-989．
［8］ Yang T C，Chen Y J，Chang S F，et al． Malondialdehyde me-
diates oxidized LDL-induced coronary toxicity through the Akt-
FGF2 pathway via DNA methylation［J］． J Biomed Sci，2014，
21:11．
［9］ Galan-Moya E M，Treps L，Oliver L，et al． Endothelial secre-
ted factors suppress mitogen deprivation-induced autophagy and
apoptosis in glioblastoma stem-like cells［J］． PLoS One，2014，
9(3) :e93505．
［10］ Liu Q，Xi Y，Terry T，et al． Engineered endothelial progenitor
cells that overexpress prostacyclin protect vascular cells［J］． J
Cell Physiol，2012，227(7) :2907-2916．
4161
2016 年 7 月
第 38 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2016
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