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泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选



全 文 :云南农业大学学报 (自然科学) ,2016,31 (4) :624 - 629 http: / /xb. ynau. edu. cn
Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science) E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2015 - 07 - 05 修回日期:2015 - 09 - 08 网络出版时间:2016 - 07 - 26 15:28
* 基金项目:国家科技支撑计划 (2011BAD46B01 - 3)。
作者简介:陈丽华 (1992—) ,女,云南泸西人,硕士研究生,主要从事植物病理学研究。
E-mail:951245313@ qq. com
**通信作者Corresponding author:何月秋 (1956—) ,男,湖北武穴人,博士,教授,主要从事植物病理学研究。
E-mail:ynfh2007@ 163. com
网络出版地址:http:/ /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20160726. 1528. 006. html
DOI:10. 16211 / j. issn. 1004 - 390X(n). 2016. 04. 007
泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选*
陈丽华1,张家恒1,吴毅歆2,3,何鹏飞1,3,刘 凌4,闫争亮4,何月秋2,3**
(1. 云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201;2. 云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650201;
3. 微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心,云南 昆明 650217;4. 云南省林业科学院,云南 昆明 650204)
摘要:为明确泡核桃干腐病的病原和筛选合适的化学防治药剂,从云南省楚雄州大姚县核桃病害标本中分离和
鉴定了病原菌,测定了 8种杀菌剂的毒力。通过柯赫氏法则验证,确定分离得到的该菌株能侵染泡核桃,产生
干腐症状。依据形态特征和 rDNA-ITS序列分析,将病原鉴定为茶藨子葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)。室
内毒力测定的结果表明:8种杀菌剂的 EC50从大到小依次为氟啶胺 0. 060 4 mg /L、戊唑醇 0. 169 0 mg /L、苯醚甲
环唑0. 177 8 mg /L、嘧菌酯 0. 476 9 mg /L、福美双 2. 094 7 mg /L、噻呋酰胺 3. 961 0 mg /L、异菌脲 4. 219 0 mg /L、
霜脲氰 101. 764 3 mg /L。
关键词:泡核桃;干腐病;茶藨子葡萄座腔菌;杀菌剂;毒力测定
中图分类号:S 436. 64 文献标志码:A 文章编号:1004 - 390X (2016)04 - 0624 - 06
Identification of the Pathogen Causing Canker on
Juglans sigilltata L. and Indoor Screening of Fungicides
CHEN Lihua1,ZHANG Jiahen1,WU Yixin2,3,HE Pengfei1,3,LIU Ling4,
YAN Zhengliang4,HE Yueqiu2,3
(1. College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;
2. College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;
3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains,
Kunming 650217,China;4. Yunnan Academy of Forestry Sciences,Kunming 650204,China)
Abstract:To identify the pathogen causing canker on Juglans sigilltata L. and screen fungicides,the
pathogen collected from Dayao County of Yunnan Province was isolated and identified and 8 fungicides were
tested in toxicity. By following the Kochs postulate,the pathogen was confirmed and was identified as Bot-
ryosphaeria dothidea based on its morphology and rDNA-ITS gene sequence. The toxicities in EC50 were
0. 060 4,0. 169 0,0. 177 8,0. 476 9,2. 094 7,3. 961 0,4. 219 0 and 101. 764 3 mg /L for fluazinam,te-
buconazole,difenoconazole,azoxystrobin,thiram,thifluzamide,iprodione and cymoxanil,respectively.
Keywords:Juglans sigilltata L.;canker;Botryosphaeria dothidea;fungicides;toxicity test
核桃 (Juglans s`pp.)是一种综合开发利用价值
极高的木本油料及干果树种[1]。云南泡核桃 (Jug-
lans sigilltata L.)分布于云南省 128个县 (区),产
量和质量均居全国之首[2]。云南省大姚县享有“中
国核桃之乡”的美称。但随着种植面积增加,纯林
化趋势明显,再加上粗放管理,病虫害极易大面积
传播蔓延。据报道,中国核桃种植区的常见病害主
要有黑斑病、炭疽病、果腐病[3]、基腐病[4]、干腐
病[5]、枝枯病[6]等,虽对这些病害的发展规律和防
治方法有所研究[5],但报道最多的是发生于山核桃
的病害,泡核桃病害报道较少。2014 年 4 月,一种
未知泡核桃病害在云南省楚雄州大面积爆发,以大
姚县最为严重,该病与核桃干腐病和枝枯病极为相
似,切开树皮可看到韧皮部有黑色凹陷小点,树皮
发黑开裂,严重时主干、主枝和侧枝流出如胶状黑
色液体,有酒糟气味,植株越长越矮,造成较大经
济损失。因不确定病原,从 2011年发现起至 2014年
大爆发,连续 3 年防治效果欠佳。本研究旨在确定
大姚县泡核桃干腐疑似病及其病原,筛选有效防治
药剂,为有效控制该病提供依据。
1 材料和方法
1. 1 样品采集和病原菌分离
2014年5月1日,从云南省楚雄市大姚县核桃
产区采集感病枝条和枝干部分,带回实验室立即进
行病原菌的分离和纯化。选取病枝条和树干,切取
病健交界处的组织于 70%乙醇中浸泡,表面消毒
1、2、3 min,用无菌水漂洗3次,放在灭菌的滤纸
上吸干水分,然后剪成约 5. 0 mm × 5. 0 mm大小的
组织块,置于马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PSA)平板
上,在 25 ℃恒温培养箱中培养3 d后,挑取菌落边
缘的菌丝转接培养、纯化。
1. 2 柯赫氏法则证病
将供试菌株在 PSA平板上活化培养 6 ~7 d后,
用无菌的直径为 7. 0 mm 的打孔器打取菌饼。选取
温室种植 2个月的健康泡核桃苗,用灭菌小刀将主
干和嫩枝外表皮轻微划 2个伤口,把菌饼正面贴向
伤口,用已浸湿无菌水的无菌脱脂棉保湿。设置 3
次重复,PSA 作为空白对照,跟踪观察致病结果,
若发病,则对病斑再进行组织分离,分离得到与接
种菌株培养特征一致的菌株确定为该病的病原菌。
1. 3 病原菌形态特征观察
将分离获得的病原菌在 PSA 平板上培养 5 d后,
观察菌落特征。将菌株接种到松针煎汁培养基上,
置于25 ℃光照培养箱中,每天光照12 h培养7 d后,
挑取分生孢子器制作玻片,在光学显微镜下观察病
原菌分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子等特征。
1. 4 病原菌 rDNA-ITS 序列扩增与分析
1. 4. 1 基因组 DNA 提取
将病原菌转接到 PSA平板上,于25 ℃培养3 d
后,刮取约 200. 0 mg 菌丝于 2 mL 无菌离心管中,
加入 600 μL EDTA,用灭菌铁棒捣碎,再加入
200 μL EDTA,放入 65 ℃水浴锅中水浴 1 h,期间
每隔 20 min拿出剧烈振荡 1次,共 3次;水浴完成
后加入 800 μL氯仿∶异戊醇 (体积比 24∶1)剧烈摇
晃混匀,12 000 r /min 离心 10 min,吸上清液,加
入 700 μL氯仿∶异戊醇 (24∶1)重复上一步;吸出
上清液,加入 0. 6倍体积异丙醇,放入 -20 ℃冰箱
保存 30 min 后,12 000 r /mim 离心 10 min 弃上清
液,加入400 μL 70%乙醇,12 000 r /min离心5 min
弃上清液;加入无水乙醇 250 μL,12 000 r /min 离
心 5 min弃上清液,放入 37 ℃烘箱烘干,直至无酒
精味;加入少量双蒸水溶解作为 PCR扩增模板。
1. 4. 2 rDNA-ITS PCR扩增
用真菌通用引物 IDF-F (5 - TCCGTAGGT-
GAACCTGCGG - 3)和 IDF-R (5 - TCCTCCGC
TTATTGATATGC - 3)进行 PCR 扩增,预计扩增
片段大小为 750 bp。PCR 反应体系 (总体积
30. 0 μL) :ddH2O 20. 7 μL,10 × EasyTaq Buffer
(Mg2 +)3. 0 μL,dNTPs (2. 5 mmol)2. 4 μL,引物
IDF-F /R (10 mmol /μL)各 1. 5 μL,TaqDNA 聚合
酶 (5 U/μL)0. 3 μL,DNA 模板 0. 6 μL。PCR 扩
增程序:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 1 min;
60 ℃退火 50 s;72 ℃延伸 1 min,共 30 个循环;
72 ℃保温 10 min。加入花青素,于 1. 0%琼脂糖凝
胶电泳 (90 V,40 min)检测。
1. 4. 3 PCR产物的胶回收纯化、连接和转化
在紫外灯下切取目的条带,用 DNA胶回收试
剂盒 (上海生工生物工程技术服务有限公司)回
收 PCR产物,具体操作步骤见试剂盒说明书。连
接载体使用 pMD18-T vector,反应体系 9. 5 μL:
Solution1 3. 5 μL,pUCm-T vector 0. 5 μL,纯化后
的 PCR产物 5. 5 μL,16 ℃连接过夜。把全部连
接产物转化到 TG1 大肠杆菌 (Escherichia coli)
感受态细胞中,通过菌液 PCR 法检测重组克隆,
引物改用 M13。检测后的阳性克隆菌液送上海华
大生物技术有限公司测序。
1. 4. 4 测序后的序列处理
用 BioXM 2. 2 软件去除载体序列后,将序列
输入 NCBI数据库,用 BLAST 比对,选取相似度
526第 4 期 陈丽华,等:泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选
高的菌株,用 MEGA 5. 0 进行 Clustal W比对后构
建系统发育树。
1. 5 室内杀菌剂筛选
1. 5. 1 供试药剂
98%氟啶胺、98%异菌脲、98%霜脲氰 (江
西施普润农化有限公司提供) ;96% 嘧菌酯、
95%苯醚甲环唑、95. 4%噻呋酰胺 (浙江威尔达
化工有限公司提供) ;97%戊唑醇、98%福美双
(河北益海安格诺公司提供)。
1. 5. 2 药剂浓度的初步筛选
以丙酮溶解氟啶胺、异菌脲和苯醚甲环唑,
以乙醇溶解戊唑醇,以 N -甲基吡咯烷酮溶解霜
脲氰、嘧菌酯、噻呋酰胺和福美双选用溶剂为 N-
甲基吡咯烷酮。
药剂浓度范围初步筛选:设 3 个梯度,将溶解
的药剂加入 100 mL PSA培养基,使培养基中药剂质
量浓度分别达到 0. 625、10、160 mg /L,并补足溶剂
保持溶剂体积一致,以不含药剂但含相同体积溶剂
的处理为正对照,PSA培养基为空白对照。将菌株
先在 PSA平板上培养 5 d 后,在同一圆周上制取菌
饼 (Φ =7 mm)接种到含不同浓度供试药剂的平板
中央,每处理重复 3 次,25 ℃黑暗条件下培养 4 d
后,观察菌株生长情况,初步确定药剂的最高抑菌
浓度,为下一步设定浓度范围提供依据。
1. 5. 3 离体抑菌活性测定
根据 1. 5. 2节试验筛选的各药剂质量浓度,按
梯度设置 6 ~ 8 个质量浓度,将药剂溶解加入
200 mL PSA 培养基中,配制成所需质量浓度的含
农药培养基,同时补足溶剂,以不含药剂但含相同
体积溶剂的 PSA 为对照。菌饼制作、接种方法及
培养条件与 1. 5. 2节一致,每处理重复 5 次,培养
4d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径,取平
均值计算抑制率:
抑制率 = 对照直径 -处理直径
对照直径 -菌饼直径
×100%。
以药剂质量浓度对数为横坐标,抑菌率概率
值为纵坐标,用 DPS软件绘制毒力曲线,求得毒
力回归方程和相关系数,计算 EC50和 EC90,对不
同杀菌剂的毒力大小进行比较。
2 结果与分析
2. 1 病害症状
该病害主要危害核桃主干,中幼龄核桃树受侵
染最为严重,始发生于树干的中下部。发病初期可
看到主干树皮有隆起大包 (图 1A) ,切开隆起部位
看到韧皮部有黑色凹陷小点,即病菌的子实体 (图
1B) ,伴随病害的扩展,树皮发黑开裂 (图 1C) ,
严重时主干、主枝和侧枝流出如胶状黑色液体 (图
1D) ,病菌继续侵入木质部,使木质部变黑,直达
髓心 (图 1E) ,有酒糟气味。植株越长越矮,尤其
对即将挂果核桃树危害较大,无法结果,或者因养
分无法输送,导致果实无法成熟,只剩空壳。
2. 2 病原菌致病性确定
通过对感病样品的分离,获得菌株 (编号为
HTGF) ,在回接试验中,该菌株在泡核桃嫩枝上
比在主干上发病快,接种后 1 周,嫩枝接种部位
出现明显症状,接种部位完全变黑 (图 2B) ,病
斑向周围扩散蔓延,接种培养基的对照无变化
(图 2A)。接种后 2 周,主干出现明显病斑,变
黑,中央干枯向下凹陷 (图 2D) ,对照无病变
(图 2C) ,接种发病症状与田间症状类似。从接种
发病枝干上分离的菌株,再次重复上述接种过程,
核桃枝干再次产生相同症状,接种菌株初步确定
为病原菌。
626 云南农业大学学报 第 31 卷
2. 3 病原菌形态特征
菌株 HTGF 在 PSA 培养基上长势良好。在
25 ℃黑暗条件下培养 4 d,菌丝几乎布满平板
(Φ = 9 mm)。菌丝初期白色,气生菌丝绒毛
状,菌落中间有墨绿色色素 (图 3A 为在 PSA
上 5 d 的菌落形态) ,菌丝布满平板后色素不断
积累,整个培养皿背面逐渐变为墨绿色或黑
色,菌丝变为灰色。在松针煎汁培养基上诱导
产生分生孢子器,挑取分生孢子器在载玻片上
挤压,置于光学显微镜下观察。结果显示:在
分生孢子器壁附近散布着许多无色、无隔、椭
圆形、顶部钝圆、基部比顶部稍尖的大分生孢
子 (图 3B、3D) ,分生孢子梗简化为产分生孢
子细胞 (图 3C) ,100 个分生孢子长和宽平均
值为 21. 7 μm × 7. 12 μm,范围为 (17. 6 ~
25. 6)μm × (5. 6 ~ 8)μm。
2. 4 rDNA-ITS 序列分析
依据测序结果,HTGF 的 rDNA-ITS 序列扩增
片段长度为 541 bp。于 GenBank 数据库中进行同
源性搜索,菌株 HTGF 的 ITS 序列与登录号为
JF441087、JQ663991 和 JX 275786 的茶藨子葡萄
座腔菌 Botryosphaeria dothidea 序列的相似度达
100%,与 GenBank 库中相关序列间的系统进化
树见图 4。
2. 5 防治药剂室内筛选
供试 8种药剂对核桃干腐病菌均表现出一定的
毒力,但毒力差异较大 (表 1)。氟啶胺对病菌的抑
制作用最强,EC50最小,仅为 0. 060 4 mg /L,EC90为
726第 4 期 陈丽华,等:泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选
0. 271 0 mg /L;其次是戊唑醇,EC50为 0. 169 0 mg /L,
EC90为 2. 593 9 mg /L;苯醚甲环唑对核桃干腐病菌也
有很强的抑制作用,EC50为 0. 177 8 mg /L,EC90为
7. 379 4 mg /L;霜脲氰抑制效果最差,EC50 为
101. 764 3 mg /L。另外,嘧菌酯、福美双、噻呋酰
胺、异菌脲对核桃干腐病菌也有一定抑制效果,
EC50 分 别 为 0. 476 9、 2. 094 7、 3. 961 0、
4. 219 0 mg /L,但噻呋酰胺 EC90为 210. 914 1 mg /L。
表 1 8 种不同杀菌剂对核桃干腐病菌菌丝生长的抑制作用
Tab. 1 Inhibitory effect of 8 fungicides against mycelial growth of J. sigilltata
药剂
fungicide
毒力回归方程
toxicity curve
相关系数
correlation coefficient
EC50 /
(mg·L -1)
EC90 /
(mg·L -1)
氟啶胺 fluazinam y = 7. 395 6 + 1. 964 9x 0. 921 3 0. 060 4 0. 271 0
戊唑醇 tebuconazole y = 5. 834 2 + 1. 080 6x 0. 959 1 0. 169 0 2. 593 9
苯醚甲环唑 difenoconazole y = 5. 594 1 + 0. 792 0x 0. 987 7 0. 177 8 7. 379 4
异菌脲 iprodione y = 3. 607 5 + 2. 227 2x 0. 984 0 4. 219 0 15. 871 3
嘧菌酯 azoxystrobin y = 5. 207 2 + 0. 644 1x 0. 959 9 0. 476 9 46. 565 0
福美双 thiram y = 4. 6983 + 0. 939 5x 0. 973 9 2. 094 7 48. 436 4
噻呋酰胺 thifluzamide y = 4. 556 2 + 0. 742 4x 0. 961 6 3. 961 0 210. 914 1
霜脲氰 cymoxanil y = 2. 981 1 + 1. 005 6x 0. 958 6 101. 764 3 1 914. 142 5
3 讨论
与泡核桃病害研究缺乏不同,山核桃病害的研
究较多。山核桃干腐病又叫溃疡病、墨汁病、墨水
病[7]。对于山核桃干腐病的研究早在 1988 年就有
报道,在湖南等地发生严重,病原为 Physalospora
juglandis Syd et Hara,无性世代为 Maerophoma
sp.[8]。2011年首次报道山核桃干腐病病原菌为
Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr. )Ces. & De
Not,属子囊菌门葡萄座腔菌科 (Botryosphaeriace-
ae)的葡萄座腔菌属 (Botryosphaeria)[9]。王璇
等[10]从浙江和安徽等地山核桃干腐病发病组织上
分离得到 3种葡萄座腔菌属真菌,其中优势菌株为
B. dothidea致病性最强,而 B. fabicercianum和 B.
obtusa也可导致发病,但分离频率较低,致病性较
弱。本试验从云南省楚雄州大姚县发病泡核桃组织
上分离得到 1株葡萄座腔菌属真菌 HTGF,依据形
态观察和 ITS序列结果,鉴定为 B. dothidea,没有
发现 B. fabicercianum 和 B. obtusa,与张传清、田
甜等的研究结果一致[5,11]。本文首次报道了 B. do-
thidea可引起云南省大姚县泡核桃产区干腐病的发
生。Botryosphaeria 是重要的子囊菌,其无性型包括
Diplodia, Dothiorella, Fusicoccum, Lasiodiplodia,
Sphaeropsis等,是形态分类中最困难的真菌类群之
一[12]。本研究仅对云南省大姚县的部分病株进行
分离,而该病的大面积爆发是仅由这一个病原菌引
起,还是还存在其他病原菌尚不能确定。
Botryosphaeria 真菌是多种林木及果树溃疡病的
致病真菌[13],具有寄主多样性、地理广泛性、病害
症状复杂性的特征[14]。Botryosphaeria 真菌能引起杨
树溃疡病、松树枯梢病、桉树溃疡病等多种树木枝
干溃疡病[15],引起苹果、梨树、桃树等果树轮纹、
干腐[16]、流胶病[17],危害核果类果树桃、樱桃、李
和梅等[18]。大姚县属亚热带季风气候,气候湿润、
温和,适宜各种林果的生长,1994 年该县约有苹果
树 60多万棵,品种主要以‘金帅’为主,水蜜桃树
50多万棵,这些经济果树均为 Botryosphaeria 真菌的
寄主。但早在 1992年,昆明苹果园已有干腐病的发
生,‘金帅’品种病情指数达 30[19],大姚县虽无该
病发生情况的报道,但当地林业部门每年都对农民
进行苹果轮纹病和桃流胶病防治技术指导。TANG
等[16]确定苹果轮纹病病原为 Botryosphaeria dothidea
(Moug.)Ces. Et De Not,对于桃流胶病病原的研究,
也普遍认为由 B. dothidea 侵染引起,由此推断,该
县核桃干腐病的发生,可能是从发病苹果、桃等寄
主传播而来。因此,在果园布置上,应避免核果类
果树与苹果、梨、松树、桉树等种在同一区域,以
减少病害爆发时造成的损失。
据近 3年的观察,该病害每年 3、4 月始发,4
月中下旬以及 9月中旬为发病高峰期,降雨之后大
面积爆发,土壤贫瘠、干旱的山头发病较重。前一
年气候条件恶劣,高温、干旱、晚霜、雨水缺乏,
后一年雨水充沛时发病较重。有报道 Botryosphaeria
真菌所致树木溃疡病是典型的寄主主导性病害,病
菌一般从修枝、日灼、冻害、动物和昆虫危害等留
下的伤口或自然孔口侵入植株组织[20]。在有伤或
条件适宜下,病菌侵入后可导致严重发病。且该菌
存在潜伏浸染现象,树木生长健壮,病原菌侵入后
暂不发病;当树木遭受各种逆境时,树势衰弱,潜
伏在组织中的病原菌即表现出致病性,造成严重的
826 云南农业大学学报 第 31 卷
损失[13]。张璐璐等[21]认为核桃干腐病在开始投产
前后的中龄树木 (10 ~ 30 年生)危害最严重;当
树木的郁闭度较高时,树木受病菌的感染和侵袭的
机会减少,病情减弱;产量相对较高的地区,病害
发生比较严重;土壤酸性越强,病害发生越重。据
此推断,可能由于大姚县气候条件、土壤肥力、人
为及虫害伤口等因素有利于病菌进入,导致该病严
重发生。
在药剂筛选中,氟啶胺有较强抑菌效果,EC50
仅为 0. 060 4 mg /L。氟啶胺是由日本石原株式会社
自主研制开发的 2,6 -二硝基苯胺类低毒广谱性
杀菌剂。药理研究表明,在较低的浓度下,通过阻
断病菌能量 (ATP)的形成,导致病菌死亡[22]。
对辣椒疫病[23]、马铃薯晚疫病[24]、马铃薯疮痂
病[22]、大白菜根肿病[25]等有很好的防治效果。在
核桃干腐病防治研究中,杨淑贞等[26]研究结果表
明:在 8—9 月该病病原菌入侵山核桃木质部时,
在刮除病斑或在病斑上深划线后再用 80%乙蒜素
乳油、80% 402抗菌剂和95%硫酸铜晶体中的任何
一种杀菌剂的 1∶100 ~ 1∶500 倍溶液进行喷雾防治,
15 d后均可见明显的防治效果。张传清等[5]采用
“涂干 +喷雾”的防治技术,结果表明戊唑醇和腐
霉利都有较好的防治效果。本文首次发现氟啶胺对
核桃干腐病菌有很强抑制作用,但具体田间施药方
法和防病效果还有待进一步试验。
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926第 4 期 陈丽华,等:泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选