全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2007,15 (2):263~267
*基金项目：国家自然科学基金项目（No.30270141）资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.教授，主要从事植物发育生物学研究。E-mail：.
收稿日期：2006-05-31 接受日期：2006-06-09
·研究论文·
蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆、
序列分析及植物表达载体的构建*
罗滟苏,宋梅芳,韩玉珍**
(中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京100094)
摘要：应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳(Toreniafournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与
衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到2个798和813bp的Tf-
PLC1基因上游序列；经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。序列分析表明它
含有类似于TATAbox和CAATbox的元件，在其远端上游区域还有多个AT富含区，而且还含有多个胚乳特异表达启动子的
元件。将该启动子全序列和5端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700，用于转化蓝猪
耳，以验证该启动子的功能。
关键词：蓝猪耳；衔接头PCR；磷脂酶C；启动子
中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006-1304(2007)02-0263-05
Clone，SequenceAnalysisandPlantExpressionVectorConstructionof
OvulePhospholipaseCGeneTfPLC1PromoterfromToreniafournieri
LUOYan-su，SONGMei-fang，HANYu-zhen*
(StateKeyLaboratoryofPlantPhysiologyandBiochemistry,ColegeofBiologicalSciences,
ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)
Abstract:ToreniafournierigenomicDNAwasdigestedbyDraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡandSmaⅠrespectively.Aspecialadaptorwas
ligatedtotheendsofthedigestedDNAfragmentsasatemplateforadaptorPCR.WiththeadaptorandTfPLC1gene-specificprimers,
bandsof798and813bpupstreamofTfPLC1wereobtainedsuccessively.Aftersequenced,blastandcombined,aTfPLC1promoter
of1432bpwasgained.TATAboxandCAATbox-likeelementswerefoundinthesequence,andATdomainswererichinthefar
upstreamofthepromoter.Andalsosomeendosperm-specificelementswerefoundinthesequence.PBI121andthepromoterwere
doubledigestedtoconstructplantexpressionvectorsPPP1326andPPP700by5deletion.Thenthevectorsweretransformedto
Toreniafournieritovalidatethefunctionofthepromoter.
Keywords：Toreniafournieri;adaptorPCR;phospholipaseC;promoter
肌醇磷脂信号途径广泛参与生物体内多种细胞
信号转导过程(Mueler-RoeberandPical,2002)。在动
物中的研究表明该信号途径在受精和早期胚胎发育
过程中起重要作用 (Miyazakietal.,1993;Carolet
al.,1997;LeeandShen,1998;Schlessinger,1997)。而
在植物中，肌醇磷脂信号途径的研究目前大多都集
中在植物对逆境信号反应方面 (Mueler-Roeberand
Pical,2002)，对PLC/IP3信号是否参与被子植物受
精过程还知之甚少。Musgraveetal.(1993)曾报道绿
藻配子在融合过程中胞内 IP3水平升高，Hanetal.
(2002)通过显微注射实验表明三磷酸肌醇信号能诱
导蓝猪耳胚囊中央细胞胞质钙浓度提高。这些工作
初步表明肌醇磷脂信号途径在植物受精和发育过程
中也可能起重要作用。本实验室以蓝猪耳胚珠为材
料，克隆到了2个磷脂酶C基因 (分别命名为Tf-
PLC1和TfPLC2)，初步分析表明TfPLC1在胚珠中
表达量比较高。由于启动子是基因表达调控的重要
顺式元件，因此为全面分析TfPLC1基因的表达及
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
调控，以深入了解TfPLC1基因在胚珠发育和受精
中的作用，应用衔接头PCR方法，从蓝猪耳基因组
DNA中成功地克隆到一个 TfPLC1基因上游的 1
432bp启动子片段。目前胚珠特异表达启动子的研
究还不多，有研究报道了水稻和小麦胚珠特异启动
子，并分析了其功能区段，验证了特异元件的作用
(Yoshiharaetal.,1996;Wuetal.,2000;苗红梅等，
2004)。在双子叶植物，还未见胚珠特异启动子功能
元件分析的报道。本研究对克隆到的启动子序列进
行分析，表明该启动子具有启动子的特征序列及胚
珠特异表达启动子的特征元件。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 25℃，16h光照/8h黑暗的条件
下温室培养约60d的蓝猪耳(Toreniafournieri)。
1.1.2 主要试剂 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α
和根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404
均由本实验室保存；PBI121植物表达载体由中国农
业大学植物分子遗传实验室董江丽老师惠赠；LA
TaqDNA聚合酶、PCR产物克隆载体 pMD18-T
vector、限制性内切酶和T4连接酶均购于宝生生物
工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和高保
真TaqDNA聚合酶均购于天根生化(北京)科技有
限公司；DNAMarker购于晶美生物工程公司和天
根生化(北京)科技有限公司；衔接头和PCR引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成；测序工
作由北京三博远志生物技术有限公司完成。
1.1.3 衔接头和引物 衔接头序列：
衔接头长链：5-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCC
GCCCGGGCAGGT-3；
衔接头短链：5-ACCTGCCC-3。
衔接头引物：
衔接头引物1(AP1)：5-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3；
衔接头引物2(AP2)：5-AATAGGGCTCGAGCGGC-3。
基因特异引物：
基因特异引物 1(GSP1)：5-GCTTGGCGATGTGGTGCCGCTTCT
GC-3；
基因特异引物2(GSP2)：5-CCTCCTTCACATCTTGGGTAGGC-3。
基因特异引物1(GSP1)：5-CCACAGATTGCTCGTTGCGT3；
基因特异引物2’(GSP2’)：5-CCGATAACAAGCGAACCAAG-3。
载体构建用带酶切位点引物：
正义引物1(SP1)：5-GCAAGCTTAACAAGATTGGGCCATTCT-3；
HindⅢ
正义引物2(SP2)：5-GCAAGCTTTTGAACAACGCTTCGAAC-3；
HindⅢ
反义引物(AP)：5-GAGGATCCGCTCCCCATTTTCTCTCAA-3。
BamHⅠ
1.2 方法
1.2.1 蓝猪耳基因组DNA的提取 将蓝猪耳种子
种于温室里，生长 2个月以后，取 50~100mg幼嫩
的蓝猪耳叶片，液氮速冻研磨成粉末后，用2mL离
心管分装，每管加入700μLCTAB提取缓冲液[2%
CTAB,2.8mol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl(pH8.0),
10mmol/LEDTA(pH8.0),室温保存；β-巯基乙醇
133μL/200mL，颠倒混匀。65℃水浴40~60min。取
出离心管，冷却至室温后加入700μL氯仿∶异戊醇
(24∶1)混匀,4℃12500r/min离心15min，转移上
清，重复抽提1次，取上清至干净离心管，加入等体
积异丙醇，混匀，–20℃沉淀 30min。4℃ 12500
r/min离心 15min,弃上清,75%酒精洗涤 1次，沉
淀干燥后,溶于 50μLddH2O中。取 2~3μL进行
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
1.2.2 蓝猪耳基因组DNA的酶切和连接 取1~2
μg蓝猪耳基因组DNA，分别用平端酶DraⅠ、EcoR
Ⅴ、PvuⅡ和SmaⅠ进行单酶切、纯化并回溶于20
μL去离子水中。衔接头长链和短链均单独配成50
μmol/L的浓度，取等体积的长链和短链溶液，混匀，
以程序94℃2min，1.5℃/s降到25℃，25℃2min
制作双链衔接头备用。连接反应体系为：10×连接反
应缓冲液2.5μL，酶切的基因组DNA8μL，衔接头
(25μmol/L)4μL，50%PEG4μL，连接酶1μL，总
体积为25μL；16℃连接过夜。
1.2.3 PCR组分和反应条件 参照王新国等(2001)
的方法，PCR体系组分为：10×PCR缓冲液2.5μL，
DNA连接产物3μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，AP1
(10μmol/L)1μL，GSP1/1，(10μmol/L)1μL，LATaq
DNA聚合酶 0.25μL，ddH2O13.25μL，总体积为
25μL。反应条件为：94℃预变性6min；94℃1min，
67.5℃，8min，35个循环；72℃，15min。将上述
PCR产物稀释50倍，取2μL作模板进行第二轮
PCR。PCR体系组分为：10×PCR缓冲液2.5μL，稀
释 DNA2μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，AP2(10
μmol/L)1μL，GSP2/2，（10μmol/L)1μL，LATaq
DNA聚合酶0.25μL，ddH2O14.25μL，总体积为25
μL。反应条件为：94℃预变性 5min；94℃50s，
59/53℃45s，72℃5min，32个循环；72℃10min。
1.2.4 PCR产物的克隆和序列分析 PCR产物电
泳后切取目标条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，
回收产物克隆到pMD18-Tvector中，转化至大肠杆
菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。测序结果与已知序
列末端部分进行blast比较分析、拼接得到1432bp
的启动子序列,并对其进行序列分析。
1.2.5 植物表达载体的构建 根据扩增到的启动
子序列设计含酶切位点的正义引物(含HindⅢ酶切
位点)2条,反义引物(含BamHⅠ酶切位点)1条，用
264
第2期 罗滟苏等:蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
高保真 TaqDNA酶分别从蓝猪耳基因组 DNA扩
增启动子 710和 1336bp2个片段，克隆到
pMD18-TSimpleVector上，将其分别命名为PP710
和PP1336。PP710和PP1336经HindⅢ和BamHⅠ
双酶切后,分别与相同消化的植物表达载体PBI121
连接，转化大肠杆菌,菌液PCR检测筛选阳性克隆
并测序鉴定，分别获得重组质粒载体，命名为
PPP700和PPP1326，通过液氮冻融法转化至根癌农
杆菌LBA4404中。菌液PCR检测阳性转化子用于
植物转化。
2 结果
2.1蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的
PCR扩增
以消化DNA和衔接头的连接产物为模板，衔
接头引物 AP1、AP2和基因特异引物 GSP1、GSP2
(分别在起始密码子ATG下游212和52bp处)经过
2轮巢式PCR后,扩增到1条798bp特异条带 (图
1)，该条带是由DraⅠ酶切的连接产物作模板扩增
出来的。测序和blast分析显示该片段3端序列与
TfPLC1基因起始密码子附近序列完全一致，表明该
序列可能是TfPLC1基因的启动子部分。
根据已得到的798bp序列，在其远离起始密码
子的区域分别设计另2条基因特异反义引物GSP1
和GSP2，与衔接头引物AP1和AP2配对巢式扩增
得到以PvuⅡ酶切连接产物作模板的1条813bp片
段(图2)。测序和blast分析显示该片段3端与先前
得到的798bp片段5端序列完全一致 (52bp序列
完全相同)。拼接后，得到1条1432bp片段(图3)，
推测其为蓝猪耳TfPLC1基因的启动子部分。
图1.798bpPCR
产物电泳谱带
Fig.1.Agarosegel
electrophoretogramforPCR
productof798bp
1,PCRproducts;2,PCRmarker.
2.2 启动子序列分析
对1432bp片段序列分析表明，在起始密码子
ATG上游-59和-83处各有一个类似于TATA-box
的元件，它 们 的 序 列 分 别 为 TATTATA和
TATAAATA；在-239处有 1个类似于 CAAT-box
的元件，在5上游序列中还发现多个AT富含区,这
些都是启动子的特征元件。另外还有一些胚乳特异
的固定序列或元件，如 AACA为种子特异元件，
GCN4为胚乳特异启动子特征序列，G盒为种子贮
藏蛋白基因保守序列，其中心序列能与bZIP转录因
子结合，胚乳盒能够被基本区域/螺旋-桶-螺旋蛋
白识别，醇溶蛋白盒为种子贮藏蛋白基因保守序列
(Yoshiharaetal.,1996;Wuetal.,2000;苗红梅等,
2004)(图3)。
图2.813bpPCR
产物电泳谱带
Fig.2.Agarosegel
electrophoretogramforPCR
productof813bp
1,PCRproducts;2,PCRmarker.
从序列分析结果可以看出，该序列具有启动子
特征，且存在多个胚乳特异启动子的元件，表明该启
动子可能与胚珠或种子发育相关。由于上述分析的
胚乳特异启动子特征元件均来自单子叶植物小麦和
水稻，而克隆到的启动子来自双子叶植物蓝猪耳的
胚珠，说明单子叶植物和双子叶植物的胚珠或种子
发育基因的表达调控具有保守性。
2.3 用高保真TaqDNA聚合酶从基因组DNA扩
增700和1326bp片段
根据 1438bp序列分别在 ATG的–1326bp
和–700bp位置设计带HindⅢ酶切位点正义引物
SP2和SP1，在ATG位置处设计带BamHⅠ酶切位
点反义引物AP，以蓝猪耳全基因组DNA为模板，
用高保真TaqDNA聚合酶分别扩增2段启动子序
列，普通TaqDNA聚合酶加A后直接用于TA克
隆，分别得到710和1336bp片段(图4，5)。将该产
物克隆到pMD18-Tsimplevector后筛选阳性克隆
并测序，将测序结果与衔接头PCR结果进行序列比
对，相似性为100%，表明该序列确实为TfPLC1基
因的上游序列。阳性克隆用于下一步的载体构建。
2.4 植物表达载体的构建
阳性克隆和 PBI121双酶切消化后连接转化
DH5α，Kan抗性筛选阳性克隆，菌液PCR检测重组
子；扩增出的目标条带经回收，克隆到测序载体后测
序；测序结果经与启动子序列比对后证明重组子即
为构建好的植物表达载体，并分别命名为PPP700
265
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
图3.TfPLC1启动子序列分析
Fig.3.AnalysisofTfPLC1promotersequence
TATA，TATA-box；CAAT，CAAT-box；AT，AT富含区，广泛存
在于植物启动子中，起增强子的作用；AACA，种子特异元件；
GCN4，序列为TGAGTCA，胚乳特异启动子特征序列；G盒，
序列为CACGTG，中心序列为ACGT，种子贮藏蛋白基因保守
序列，其中心序列能与 bZIP转录因子结合；胚乳盒，序列为
TGAAAAAG,能够被基本区域/螺旋-桶-螺旋蛋白识别；醇
溶蛋白盒，序列为TGAAAT,为种子贮藏蛋白基因保守序列。
TATA，TATA-box；CAAT，CAAT-box；AT，ATrichregion,ex-
istinplantpromoterdifusely,actasenhancer；AACA，seed-spe-
cificmotif；GCN4，thesequenceisTGAGTCA,endosperm-specif-
icpromotercharacterizedsequence;G-box，thesequenceis
CACGTG,centralsequenceisACGT,seedstorageproteingene
conservedsequence,anditscentralsequencecancombinewith
transcriptional factor；endosperm-box，the sequence is
TGAAAAAG,canberecongnizedbybasicregion/helix-pail-helix
protein；Prolamin-box，thesequenceisTGAAAT,seedstorage
proteingeneconservedsequence.
图4.高保真710bp
PCR产物电泳谱带
Fig.4.Agarosegel
electrophoretogram
forPCRproductof710bp
1,PCRmarker;2,PCRproduct.
图5.高保真1336bpPCR产
物电泳谱带
Fig.5.Agarosegel
electrophoretogramofPCR
productof1336bp
1,PCRproduct;2,PCRmarker.
图6.重组质粒PPP700的菌液PCR鉴定
Fig.6.DetectionoftherecombinantplasmidPPP700byPCR
1,PCRmarker;2,CK;3,CK-;4~8,PCR
图7.重组质粒PPP1326的菌液PCR鉴定
Fig.7.DetectionoftherecombinantplasmidPPP1326byPCR
1,PCRmarker;2,CK;3,CK-;4~9,PCR
266
第2期 罗滟苏等:蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
和PPP1326，菌液PCR结果分别如图6,7所示。
3 讨论
王新国等(2001)通过衔接头 PCR方法从胡萝
卜中分离到一个新的Ⅱ型转化酶基因的启动子，对
已知序列附近的未知序列的分离提供了一个有效简
便的方法,尤其是对未知启动子的克隆提供了实验
依据。本实验根据该方法克隆到了在蓝猪耳胚珠表
达的TfPLC1基因的启动子，唯一不同的是设计的
衔接头短链3端没有加氨基，但是也同样扩增到了
启动子片段，相比这个方法更经济。实验也进一步证
明了衔接头PCR是一种高效，准确，快速的分离已
知序列附近未知序列的好方法。
通过衔接头 PCR方法分离了蓝猪耳胚珠 Tf-
PLC1基因启动子1432bp序列。分析表明,该序列
具有启动子的特征元件，并且还含有多个胚乳启动
子特征元件。同时,克隆到的启动子片段还具有连续
的17个T碱基，这种现象在已报道的其它启动子
序列中非常少见,至于具有什么功能尚需进一步分
析。TfPLC1启动子的克隆及载体构建为研究 Tf-
PLC1基因的表达调控及功能提供基本资料。
参 考 文 献
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