全 文 ：31 卷 08 期
Vol． 31，No． 08
草 业 科 学
PＲATACULTUＲAL SCIENCE
1481 － 1486
08 /2014
DOI:10． 11829 \ j． issn． 1001-0629． 2013-0359
长叶点地梅的细胞悬浮培养条件
张彦妮，陈素波
(东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要:以筛选出的长叶点地梅(Androsace longifolia)淡绿色疏松的愈伤组织为试验材料，比较了不同激素、蔗糖浓
度、摇床转速等对细胞生长的影响，测定了培养过程中培养液 pH值、电导率及干质量等变化。结果表明，长叶点
地梅愈伤细胞悬浮培养的最佳激素为 6-BA，浓度为 0． 3 mg·L －1，细胞干质量达 0． 150 g。愈伤组织接种量为 1 g
时，细胞干质量较高，最佳蔗糖浓度为 2%，最佳摇床转速为 105 r·min －1。在悬浮培养过程中，培养液的 pH呈先
下降后缓慢上升的变化趋势，在培养 21 d时基本趋于稳定;随着细胞数量的增加，溶液的电导率呈先下降后上升
的趋势，在 15 d时，达到最低，根据细胞干质量的测定，筛选出悬浮培养细胞的最佳收获时间为 12 d。
关键词:细胞生长;激素;蔗糖;摇床转速;细胞干质量
中图分类号:S682． 1 + 5;Q942． 5 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2014)08-1481-06*
Incubate conditions of Androsace longifolia cell suspension culture
ZHANG Yan-ni，CHEN Su-bo
(The College of Landscape，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)
Abstract:The light green loose callus of Androsace longifolia were selected as the basic experimental materials．
The effects of different hormones，sucrose concentrations，and shaker speeds on the cell dry weight on cell suspen-
sion cultures were compared． The results showed that the optimal hormone of A． longifolia suspension culture was 6-
BA which had cell dry weight of 0． 15 g with optimal concentration of 0． 3 mg·L －1 ． Cell dry weight was higher
when the inoculation amount of the callus was 1 g． The optimal sucrose concentration and shaker speed was 2%
and 105 r·min －1，respectively． During the culturing process，the pH value decreased and then gradually in-
creased and stabilized at the day 21 of culture． Conductivity of the culture solution declined and then increased with
the increase of cell number which was lowest after 15 days culture． The optimal harvest time of the cell suspension
cultures was 12 days after culturing based on the cell dry weights．
Key words:cell growth;hormone;sucrose;shaker rotating speed;cell dry weight
Corresponding author:ZHANG Yan-ni E-mail:zhangyanni808@ 126． com
报春花科植物共 22 属，约 1 000 种，其中点地
梅属(Androsace)约有 120 种，分布于北半球温带，其
中青藏高原地区和欧洲的阿尔卑斯山脉是该属的两
个分布中心。中国有 73 个种 7 个变种，主要分布在
青藏高原，适应高纬度地区生长，有部分种类分布在
西北至内蒙古、东北以及秦岭以南各省区［1］。
目前，点地梅属植物的相关研究主要集中在化
学成分的提取、药理作用、临床方面。已经从该属中
* 收稿日期:2013-07-11 接受日期:2013-09-27
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目(DL12CA17、DL12CA11)
通信作者:张彦妮(1974-) ，女，山西大同人，副教授，博士，主要研究方向为园林花卉的繁殖栽培及育种。
E-mail:zhangyanni808@ 126． com
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 31，No． 08) 08 /2014
提取了黄酮类化合物［2-4］和 11 个三萜皂苷类成
分［5-7］;在北点地梅(A． septentrionalis)中发现 11-cis-
hexadecenoic acid 和 9-cis，12-cishexade-cadienoic
acid两种植物中罕见的脂肪酸［8］。点地梅属的药理
作用主要体现在能显著提高人肝癌细胞的抗增殖活
性［9］、抑制人肺癌细胞 A549、肝癌细胞 BEL-7402 和
胃癌细胞 SGC7901 的增殖等［10］。在临床方面，主
要用于治疗咽喉炎和慢性咽喉肿痛［11］。所以点地
梅属植物具有重要的药用价值。
悬浮培养作为一种植物细胞培养技术，主要是
指愈伤组织在液体培养基中的培养过程［12］，主要应
用于获得再生植株和细胞内的次生代谢物质。长叶
点地梅(A． longifolia)又称矮葶点地梅，为点地梅属
多年生草本，叶丛生，线性，灰绿色，花冠白色，喉部
紫红色，花朵娇小，花期为 5 月，是东北地区难得的
早春花卉，更是一种不可多得的富有野趣的草坪植
物和优良地被植物。目前，仅见通过叶片对长叶点
地梅进行愈伤组织诱导及植株再生的报道［13］，要使
其快速地应用于园林绿化，就需要有大量的苗源。
本研究以长叶点地梅愈伤组织作为试验材料，对其
不同激素条件下细胞生长、培养液 pH 值、电导率的
变化、对碳源的消耗等研究，以期为其液体悬浮培养
及原生质体悬浮培养再生体系的建立提供一定的参
考，同时为点地梅属植物利用悬浮培养进行次生代
谢产物的生产奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
在培养基 MS + 1． 0 mg· L －1，2，4-D + 0． 2
mg·L －1 6-BA 上筛选出的淡绿色、疏松的愈伤组
织。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 不同浓度植物生长调节剂对悬浮细胞生长
的影响 将 1． 0 g(依据预试验结果)淡绿色、疏松
愈伤组织分别接种于加有不同浓度 2，4-D(0． 4、
0． 6、0． 8、1． 0 mg·L － 1)、或 6-BA(0． 1、0． 2、0． 3、
0． 4 mg·L － 1)的盛有 50 mL MS液体培养基(灭菌
前 pH为 5． 4)的 100 mL三角瓶中，于摇床上培养
(转速 100 r·min － 1) ，培养温度 25 ℃，光周期 16
h /8 h。比较激素种类或浓度对细胞干质量的影
响。每 3 d测一次细胞干质量，每组重复 3 次，取
平均值测至 30 d。以培养天数为横坐标，以细胞
干质量为纵坐标，绘制长叶点地梅的愈伤悬浮培
养的生长曲线。
1． 2． 2 不同蔗糖浓度下愈伤组织对碳源的消耗规律
将 1． 0 g淡绿色、疏松愈伤组织接种于蔗糖浓度分
别为 1%、2%、3%、4%的 50 mL MS 液体培养基(添
加上面试验选出的最佳激素浓度，灭菌前 pH为 5． 4)
中，于摇床上培养(转速 100 r·min －1) ，培养温度 25
℃，24 h光照下培养。利用 3，5-二硝基水杨酸法测定
还原糖，以蒽酮法测定蔗糖、果糖、葡萄糖［14］。
1． 2． 3 摇床转速对细胞生长的影响 将 1． 0 g 淡
绿色、疏松愈伤组织接种于加有上面试验筛选出的
最佳浓度的激素和蔗糖的 50 mL MS 液体培养基
(灭菌前 pH值为 5． 4)中，于不同转速(设为 75、85、
95、105、115、125 r·min －1)的摇床上培养，培养温
度 25 ℃，光照下培养。12 d 后(依据预试验结果)
测细胞干质量。
1． 2． 4 培养液 pH 值、电导率及干质量的测定 每
100 mL三角瓶盛有 50 mL 培养液(上面试验筛选出
的最佳 MS液体培养基，灭菌前 pH为 5． 4) ，接种 1． 0
g淡绿色、疏松愈伤组织，培养温度 25 ℃，24 h 光照
下培养。定期测定培养液 pH、电导率和细胞干质量。
pH测定:每隔 3 d取样一次，1 000 r·min －1离
心 4 min，用精密 pH 计测定上清液酸碱度，每个试
验重复 3 次，取平均值。
电导率的测定:每隔 3 d 取一次悬浮培养的长
叶点地梅培养液，过滤所得培养液用电导仪测定电
导率，单位为 ms·cm －1。
干质量的测定:将三角瓶中的悬浮细胞用蒸馏
水将残留的细胞培养液冲洗干净，再用滤纸将水分
吸干，将细胞于 60 ℃烘箱中烘干 72 h 后称其干质
量。每 3 d测一次细胞干质量，每次重复 3 组，取平
均值测至 30 d。
2 结果与分析
2． 1 不同植物生长调节剂对悬浮细胞生长的影响
不同浓度的 6-BA对悬浮细胞的生长均呈现先
2841
08 /2014 草 业 科 学 (第 31 卷 08 期)
升高后降低的趋势(图 1)。在前 9 d，各个浓度的
6-BA对细胞生长影响差异不大，低浓度(0． 1
mg·L －1)6-BA中细胞干质量达到峰值所需时间较
短(9 d) ，但数值小于其他 3 个浓度下的细胞干质
量。当 6-BA的浓度为 0． 3 mg·L －1时，细胞干质量
值最大(0． 153 g) ，细胞的生长最旺盛，下降速度较
为缓慢。而在 6-BA浓度升至 0． 4 mg·L －1时，细胞
干质量有所下降，而且在达到最高峰时，细胞干质量
急剧下降，可能是由于高浓度的细胞分裂素加速了
细胞死亡［15］的原因。
不同 2，4-D浓度对细胞生长的影响呈现先升高
后降低的趋势(图 1)。在培养 9 d时，2，4-D浓度为
0． 4 mg·L －1时细胞干质量开始下降，但下降速度较
为缓慢。在 12 d 时，其他 3 个浓度下的细胞干质量
均达到峰值，但 0． 6 mg·L －1时 2，4-D 的细胞干质
量最大(0． 14 g) ，1． 0 mg·L －1时细胞干质量最低，
说明 2，4-D浓度过高时，会抑制细胞增殖。
综上所述，长叶点地梅悬浮细胞培养的最佳激
素为 0． 3 mg·L －16-BA，应在 12 d 之前获取细胞材
料，以保持良好的细胞分裂能力。
2． 2 不同蔗糖浓度下对碳源的消耗规律
在 MS液体培养基中加入 0． 3 mg·L －1 6-BA，
培养 12 d时获取新鲜细胞测量干质量。液体培养
基中的蔗糖首先被迅速水解为等分子的葡萄糖和果
糖，然后被细胞吸收利用(图 2)。当蔗糖浓度为
1%时，蔗糖迅速水解，在 3 － 12 d 期间葡萄糖和果
糖等活性糖的含量不断减少，培养 12 d 时，几乎被
完全利用，易使长叶点地梅悬浮细胞处于碳源饥饿
状态，不能充分满足甚至限制细胞的生长。随着蔗
糖浓度的增加，当浓度达到 3%时，在悬浮培养 0 － 3
d，细胞生长处于迟滞期，蔗糖水解为活性多糖积累
较慢，进入 6 － 12 d，细胞生长处于对数期，活性糖的
积累较多，之后下降缓慢，但到 30 d 时活性糖的量
仍很多，说明培养基中的碳源能够很好地供细胞生
长，当蔗糖浓度达到 4%时，活性糖的积累量减少，
蔗糖水解速度减慢。
过低和过高的蔗糖浓度都不利于活性多糖的积
累，较低或较高的蔗糖浓度，影响培养液的渗透压，
致使细胞增殖率较低，这可能与长叶点地梅的细胞
内还原糖的积累和代谢水平有关。当蔗糖浓度为
2%时，细胞生长状态最佳，干质量值接近于蔗糖浓
度 3%的干质量值(图 3A) ，因此，总体来说，当接种
量为 1 g时，长叶点地梅细胞悬浮培养的最佳蔗糖
浓度为 2%。
2． 3 摇床转速对细胞生长的影响
当摇床转速为 105 r·min －1时，细胞干质量最
大(0． 150 g) ;转速为 125 r·min －1时，细胞部分死
亡，三角瓶中的液体培养基变浑浊，干质量有所下降
(图 3B)。所以，长叶点地梅愈伤悬浮培养的最佳摇
床转速为 105 r·min －1。
图 1 不同 6-BA和 2，4-D浓度对悬浮细胞干质量的影响
Fig． 1 Effects of different 6-BA and 2，4-D concentrations on cell dry weight in suspension cultures
3841
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 31，No． 08) 08 /2014
图 2 不同起始蔗糖浓度下细胞外各种糖的变化
Fig． 2 Concentration changes of different sugar outside the cell in cell suspension cultures at
various initial sucrose concentrations
图 3 不同蔗糖浓度(A)和摇床转数(B)对细胞干质量的影响
Fig． 3 Effects of sucrose concentrations (A)and shaker rate(B)on the cell dry weight in cell suspension cultures
2． 4 培养液 pH及电导率、细胞干质量的测定
MS液体培养基中附加 2%蔗糖、0． 3 mg·L －16-
BA，接种 1 g愈伤组织，摇床转速为 105 r·min －1，定
期测定培养液 pH及电导率，12 d后测细胞干质量。
在整个生长周期中，长叶点地梅细胞培养液的
pH呈先下降后缓慢上升的变化趋势(图 4A) ，曲线
近似“V”字形变化。灭菌前培养基的 pH为 5． 4，可
能由于灭菌过程中培养基中的水分散失的原因，灭
菌后 pH下降到 5． 32。在细胞悬浮培养的 0 － 12 d，
细胞生长处于延滞期，pH由起始的 5． 32 降至4． 01，
在 13 － 21 d时，pH 开始回升，之后 pH 虽呈波动性
变化，但总体上基本保持稳定，可能细胞自身的调节
能力起到一定作用，这种调节作用是有限的，超过这
个限度就会对细胞分裂生长起到抑制作用，不利于
细胞生长。一方面 pH 的“V”形变化可能与植物细
胞对离子的吸收先后有关，植物细胞优先利用培养液
4841
08 /2014 草 业 科 学 (第 31 卷 08 期)
中的 NH4
+，使 pH迅速下降，随后再利用 NO3
－，导致
pH逐渐回升，另一方面细胞在从培养液中吸收营养
物质的同时，还会释放出一些代谢产物，如生物碱、氨
基酸等，这些都会导致培养液 pH呈波动性变化。由
于 pH值的升降影响了细胞质膜的电位、通透性及细
胞内外物质的交换，从而控制了细胞的生长［16］。
电导率可在一定程度上反映出液体培养基中的
离子总量，因此，从溶液电导率的升降程度可以了解
营养物质消耗的情况及细胞生长状态。在 0 － 15 d，
细胞悬浮培养过程中随着细胞数量的增加，溶液的
电导率呈下降趋势。在 15 d左右，培养液的电导率
达到最低(图 4B)。
图 4 不同时期细胞悬浮培养液 pH值(A)和电导率(B)变化
Fig． 4 Variations of pH values (A)and conductivity (B)in cell suspension cultures during different cell growing period
长叶点地梅细胞悬浮生长的干质量曲线近似
“S”形，开始的 0 － 3 d，细胞生长处于迟滞期，分
裂速度较慢，加之细胞对新环境的适应，可能有小
部分死亡，细胞干质量下降;4 － 12 d 细胞处于对
数生长期，生长速度和细胞数量大幅度提高;12 d
以后，细胞干质量开始呈下降趋势，导致这种现象
的原因可能是蔗糖的消耗和次级代谢物质中有害
物质的积累，不利于细胞生长，导致细胞开始死
亡，在 30 d 时，细胞已经大量死亡，干质量下降
(图 5)。因此，长叶点地梅悬浮细胞的最佳获得
时间为 12 d左右。
图 5 细胞悬浮培养不同生长时期细胞干质量的变化
Fig． 5 Changes of cell dry weight in suspension
cultures during cell growing period
3 讨论
植物材料在同等条件下的液体培养基和固体培
养基中的生长状态不同。在液体培养基中细胞能与
营养物质的接触面积更充分，但气体交换能力相对
固体培养较弱，因此，对愈伤组织质量、接种量、激素
浓度、蔗糖浓度、摇床转速等要求不同。本研究表
明，低浓度碳源虽有利于加快细胞增殖的速度，但不
能使细胞达到最佳状态，高浓度的碳源会抑制细胞
的增殖，长叶点地梅愈伤悬浮培养的最佳蔗糖浓度
为 2%。不同的植物种类悬浮培养所用的激素种类
和浓度差异很大，夜香牛(Vernonia cinerea)在基本
培养基中加 3%的蔗糖、1． 0 mg·L －1NAA和 0． 1 mg
·L －1 BA时培养 4 周后获得的生物量最高(9． 85
g)［17］。本研究比较了 2，4-D 和 6-BA，0． 3 mg·L －1
的 6-BA更有利于细胞增殖。新鲜愈伤在液体培养
基中进行悬浮培养时，细胞的分散程度与摇床的转
速有关，摇床的转速也会对细胞的增殖产生影响，转
速太慢细胞不能够形成均匀的分散系，转速过快摇
床产生的剪切力会破坏细胞，因此，适宜的转速也是
影响细胞生长的因素之一。但不同植物细胞对摇床
转速要求不同，如石榴悬浮培养摇床转速 110 r·
min －1［18］。摇床的转速影响了细胞增殖，但相对其
5841
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 31，No． 08) 08 /2014
他因素，其作用效果很小，一般转速控制在 90 ～ 120
r·min －1［19］，但有的植物要求转速较低，如野生草
珊瑚(Sarcandra globra)的悬浮细胞在 100 r·min －1
速度下几乎不能存活，最佳的摇床转速为 40 r·
min －1［20］。长叶点地梅细胞悬浮培养的最佳摇床转
速为 105 r·min －1。
长叶点地梅悬浮细胞培养体系的研究为进一步
完善点地梅再生体系建立、次生代谢生产和逆境因
子研究等奠定了基础，同时，为利用生物工程技术从
点地梅属植物中获取有效药用成分、缓解天然资源
压力提供新的研究思路。
参考文献
［1］ 何希瑞，魏桂芳，姚宏，常育，徐磊，张春玲． 点地梅属植物化学成分与药理活性研究进展［J］． 中国实验方剂学杂志，
2012，18(11) :296-299．
［2］ 李承花，殷志琦，黄晓君，王磊，叶文才．点地梅的化学成分［J］．中国天然药物，2008，6(2) :123．
［3］ 雷军，肖云川，王文静，席贞，余敏，黄静．点地梅中的黄酮苷成分［J］．中国中药杂志，2011，36(17) :2353．
［4］ 王文静，雷军，肖云川，席贞，余敏，黄静．点地梅中双黄酮类化学成分的分离和鉴定［J］．华西药学杂志，2011，26(5) :
420．
［5］ Dong W，Liu X，Li X，Yang D，Ding L． A new triterpene saponin from Androsace intega［J］． Fitoterapia，2011，82(5) :782-785．
［6］ Park J，Kwak J，Khoo J，Park S，Kim D，Ha D，Choi S，Kang S，Zee O． Cytotoxic effects of triterpenoid saponins from Androsace
umbellata against multidrug resistance(MDＲ)and non-MDＲ cells［J］． Archives of Pharmacal Ｒesearch，2010，33(8) :1175-
1180．
［7］ Wang Y，Zhang D，Ye W，Yin Z，Fung K，Zhao S，Yao X． Triterpenoid saponins from Androsace umbellata and their anti-prolifera-
tive activities in human hepatoma cells［J］． Planta Medica，2008，74(10) :1280-1284．
［8］ Zhang D，Wang Y，Tang M，Chan Y，Lam H，Ye W，Fung K． Saxifragifolin B from Androsace umbellata induced apoptosis on hu-
man hepatoma cells［J］． Biochemical and Biophysical Ｒesearch Communications，2007，362(3) :759-765．
［9］ 黄先丽，王晓静，贾献慧．点地梅的挥发油成分分析［J］．食品与药品，2009，11(3) :37．
［10］ 李朋军，沈伟哉，叶文才，张冬梅，孙艳．点地梅提取物 saxifragifolin B 体外抗实体瘤活性研究［J］．中国病理生理杂志，
2011，27(5) :838．
［11］ 栾宏庆．点地梅治疗咽喉炎 72 例［J］．甘肃中医学院学报，1994，11(4) :28．
［12］ 林顺权．植物细胞工程［M］．厦门:厦门大学出版社，2000:40．
［13］ 张彦妮，陈素波．长叶点地梅愈伤组织诱导和植株再生［J］．草业科学，2012，29(6) :931-936．
［14］ 夏启中．棉花悬浮细胞系的建立及其培养细胞的程序性死亡的观察研究［D］．武汉:华中农业大学，2005
［15］ 吕华，赵群华，曹日强，夏仲豪． 固定化培养和产物释放促进剂对硬紫草细胞代谢的影响［J］． 植物生理学报，1995，
21(2) :111-116．
［16］ Meiger E，Broughton W． Ｒegeneration of whole plants from hypocotyl-，root-，and leaf-derived tissue cultures of the pasture leg-
ume Stylosanthes guyanensis［J］． Physiologia Plantarum，1981，52(2) :280-284．
［17］ Maheshwari P，Songara B，Kumar S，Jain P，Srivastava K，Kumar A． Alkaloid production in Vernonia cinerea:Callus，cell sus-
pension and root cultures［J］． Biotechnology Journal，2007，2(8) :1026-1032．
［18］ 程江华．石榴愈伤组织的诱导和细胞悬浮培养体系的建立［D］．合肥:安徽农业大学，2009．
［19］ Lee W，Chan L． Establishment of Orthosiphon stamineus cell suspension culture for cell growth［J］． Plant Cell，Tissue and Organ
Culture，2004，78:101-106．
［20］ 涂艺声，王碧琴，江洪如，奚昕，丁建南．不同色光、温度、pH 对草珊瑚愈伤组织的培养效应［J］． 江西科学，1994(2) :
85-89．
(责任编辑 武艳培)
6841