全 文 ：大叶栎 ISSR扩增体系的优化
梁文汇 1, 2 ,谭健晖 1 ,黄寿先1＊ ,梁 机1 ,谢素平 1 ,刘光金 1 ,黄 婷 1 ,周传明 1　
(1.广西大学林学院 ,国家林业局中南速生材繁育重点实验室 ,广西南宁 530004;2.广西林业科学研究院 ,广西南宁 530001)
摘要　[目的 ] 探讨影响大叶栎ISSR扩增效果的因素 ,建立大叶栎ISSR扩增的优化体系。 [方法 ] 以新嫩的大叶栎叶片为试材 ,采用改
良CTAB法提取大叶栎叶片基因组 DNA,并将DNA浓度稀释到 30ng/μl,采用单因素试验设计测试DNA模板、PCR缓冲液和TaqDNA
聚合酶的用量以及底物dNTP终浓度和引物终浓度对ISSR扩增的影响。 [结果] 大叶栎的ISSR扩增的最优反应体系为:总体积 20 μl
中含有DNA模板 60ng、PCR缓冲液 10×bufer为 2.0μl,底物dNTP终浓度为 0.25mmol/L,引物终浓度为 0.3μmol/L,TaqDNA聚合酶
为 1U。在该体系下 ,能够扩增出清晰、多态性高的条带 ,能够满足大叶栎种群ISSR多样性分析的要求。 [结论] 建立了大叶栎 ISSR扩
增的优化体系 ,为研究广西的大叶栎种群遗传多样性提供了技术基础。
关键词　大叶栎;ISSR;反应体系;优化
中图分类号　S792.18　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)22-10424-02
OptimizationofISSRAmplificationSystemofCastanopsisfissa
LIANGWen-huietal　(ColegeofForestry, GuangxiUniversity, KeyLaboratoryofFast-growingTreeBreedinginCentralSouthChinaof
StateForestryAdministration, Nanning, Guangxi530004)
Abstract　[ Objective] ThestudyaimedtodiscussfactorsthatafectedISSRamplificationefectofCastanopsisfissaandestablishoptimized
systemofISSRamplificationforC.fissa.[ Method] WithtenderleavesofC.fissaastestedmaterials, genomicDNAofC.fissawasextracted
withmodifiedCTABmethodandtheDNAconc.wasdilutedto30ng/μl.Single-factorexperimentwasdesignedtotesttheefectofthedosa-
gesofDNAtemplate, PCRbuferandTaqDNApolymerase, aswellasthefinalconc.ofsubstratedNTPandprimersonISSRamplification.
[ Result] TheoptimizedsystemofISSRamplificationforC.fissawasasfolows:thetotal20μlreactionvolumecontainedDNAtemplateof60
ng, PCRbufer10×buferof2.0μl, thefinalsubstratedNTPconc.was0.25μmol/L, thefinalprimerconc.was0.3μmol/LandTaqpol-
ymerasedosagewas1U.Inthesystem, theclearbandswithhighpolymorphismcouldbeamplified, whichcouldmeettherequirementsofIS-
SRdiversityanalysisforC.fissa.[ Conclusion] TheoptimizedsystemofISSRamplificationforC.fisawasestablishedandprovidedthetech-
nicalfoundationforstudyingthepopulationgeneticdiversityofC.fissapopulationinGuangxiProvince.
Keywords　Castanopsisfisa;ISSR;Reactionsystem;Optimization
基金项目　广西自然科学基金(桂科字 0542024);广西 “十五 ”林业科
技项目(林科字 2002[ 18] )。
作者简介　梁文汇(1981-),男 ,广西兴业人 , 硕士研究生 ,研究方向:
林木遗传改良。＊通讯作者 , E-mail:huangshouxian@163.com。
收稿日期　 2009-04-07
　　大叶栎(Castanopsisfisa)属壳斗科栲属 ,为南亚热带常
绿阔叶速生树种 [ 1] 。在广西的桂东地区主要作为中密度纤
维板原料林培育 [ 2] 。据詹怀宇等的研究 ,大叶栎也是一种优
良的造纸原料 [ 3] 。广西仅在桂东地区有较大面积的大叶栎
连续分布 ,其他地区多为小面积零散分布。因而了解广西区
内的大叶栎种群的遗传多样性 ,对叶栎种质资源保护和利用
具有重要的理论和现实意义。ISSR(简单序列重复区间)标
记技术结合了 RAPD标记技术和 SSR标记技术 ,具有许多优
点:实验操作简单 、高效;遗传多态性高 ,重复性好;模板 DNA
用量少 ,实验成本低。因而在种群遗传多样性研究中被广泛
应用。但不同物种 PCR扩增的最适反应条件需要摸索 [ 4] 。
笔者对影响大叶栎 ISSR扩增效果的因素进行试验分析 ,以
期找到适合大叶栎 ISSR扩增的优化体系 ,为研究广西大叶
栎种群的遗传多样性提供技术基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料　用硅胶干燥法保存样品 ,采 5 ～ 10 g新嫩
大叶栎叶子放到自封袋中 ,加入样品质量 10倍的硅胶 ,摇动
袋子使硅胶与叶子充分接触。叶子应在 12h内完全干燥 ,一
旦发现硅胶变粉红色要及时更换 ,干燥的材料在常温下
保存。
1.2　DNA模板提取与检测　采用改良 CTAB法 [ 5] ,并做
适当改良。用 BioPhotometer核酸蛋白测定仪检测 DNA模板
的浓度和纯度 ,并把 DNA的浓度调整到 30 ng/μl,储存于
-20 ℃的冰箱中备用 。
1.3　扩增反应　扩增反应在 TGgradient96PCR仪上进行 ,
反应程序:94℃预变性 5min, 94℃变性 45s;52℃退火 45s,
72℃延伸 1.5 min, 45个循环 , 72℃完全延伸 7min, 4 ℃保存。
Taqpolymerase购自上海捷瑞生物工程有限公司。PCR
扩增产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离 ,电压为 5
V/cm,以上海生工生物工程有限公司生产的 100 bpDNA
ladder(100～ 3 000 bp)作为标记 ,溴化乙锭(EB)染色显带。
DNA片断通过 BioSensSC750型凝胶成像系统观察 、记录。
1.4　试验设计　大叶栎 ISSR扩增的初始反应体系为:总体
积 20μl, DNA模板 60ng、10×bufer2.0μl,底物 0.25mmol/L,
引物 0.5 μmol/L, TaqDNA聚合酶 1 U。对可能影响引物清
晰度和多态性的因子设计下列梯度进行单因素试验:Taq酶
0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和 1.75U;10×bufer0.5、1.0、
1.5、2.0、2.5、3.0和 3.5 μl;模板 DNA10、20、40、60、80、100和
150ng;引物浓度 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和 0.7μmol/L;
dNTP浓度 0.062 5、0.125 0、0.187 5、0.250 0、0.375 0和
0.500 0mmol/L。前一个试验结果作为下一个试验的条件
之一。
2　结果与分析
2.1　Taq酶用量对扩增的影响　在 PCR反应中 , Taq酶的
使用量是影响试验的一个重要因素。使用高浓度的 Taq酶
不仅使实验成本过高 ,而且容易产生非特异性扩增产物;Taq
酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降 。在 7种 Taq酶
浓度的 PCR反应试验中 ,当 Taq酶的用量为 1.0 U时 ,扩增
的条带比较丰富 、清晰 ,在 Taq酶用量大于或等于 1.5U时 ,无
法扩增出条带来 ,只扩增出弥散状的亮纹 ,小于或等于 0.5 U
责任编辑　罗芸　责任校对　施倩倩安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(22):10424-10425, 10428
时 ,只扩增出少量的亮带 ,无法扩增出其他弱带(图 1)。
注:1.0.25U;2.0.50U;3.0.75U;4.1.00U;5.1.25U;6.1.50U;7.1.75
U;8.Marker。
Note:1.0.25U;2.0.50U;3.0.75U;4.1.00U;5.1.25U;6.1.50U;
7.1.75U;8.Marker.
图 1　Taq酶浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.1　InfluenceofTaqconcentrationtoISSR-PCR
2.2　10×bufer浓度对扩增的影响　Mg2+浓度影响反应的
特异性和扩增片段的产率 。由于该试验中所用的 Mg2+是加
在 10×bufer中 ,所以通过对 10×bufer的优化来找到最优
的 Mg2+浓度。结果表明 ,在 10×bufer的用量小于 0.5μl或
大于 3.0μl时 ,只有少数的强带被扩增出来 ,弱带无法扩增
出来;在 20 μl体系中加入 2.0μl10×bufer时 ,条带比较丰
富 、清晰(图 2)。
注:用量(μl)1.0.5;2.1.0;3.1.5;4.2.0;5.2.5;6.3.0;7.3.5;
8.Marker。
Note:Amount1.0.5;2.1.0;3.1.5;4.2.0;5.2.5;6.3.0;7.3.5;
8.Marker.
图 2　10×buffer用量对扩增的影响
Fig.2　Influenceof10×buferconcentrationtoISSR-PCR
2.3　DNA模板用量对扩增的影响　 DNA模板的含量是制
约扩增产物得率及特异性的一个重要因子 ,模板含量过低 ,
分子碰撞的机率低 ,偶然性大 ,没有扩增产物或扩增不稳定;
模板含量过高 ,又会相应增加非特异性产物的扩增。由图 3
可见 ,在 20μl体系中加入 10 ～ 150ng的 DNA模板都能够扩
增出大致相同的带型 , DNA模板用量在 40 ng以下时条带比
较暗 ,当 DNA模板的用量在 60 ～ 100 ng时 ,亮度比较亮。
2.4　引物浓度对扩增的影响　在 PCR反应中 ,引物的浓
度可以影响 PCR产物的质和量 ,引物浓度过高会引起错配
和非特异性扩增 ,且形成引物二聚体的几率增大 ,过低则会
降低 PCR扩增的产量。 7个浓度引物用量的扩增试验表明 ,
引物用量在 0.3 ～ 0.6μmol/L时能够扩增出亮度相仿 ,带型
基本一致的条带来 ,当用量少于 0.3 μmol/L或大于 0.6
注:1.Marker;2.10ng;3.20ng;4.40ng;5.60ng;6.80ng;7.100ng;
8.150ng。
Note:1.Marker;2.10ng;3.20ng;4.40ng;5.60ng;6.80ng;7.100
ng;8.150ng.
图 3　不同模板用量对扩增的影响
Fig.3　InfluenceofdifferenttemplateamounttoISSR-PCR
μmol/L时 ,条带的亮度明显降低(图 4)。
注:引物用量(μmol/L)1.0.1;2.0.2;3.0.3;4.0.4;5.0.5;6.0.6;7.0.7。
Note:Primeramount1.0.1;2.0.2;3.0.3;4.0.4;5.0.5;6.0.6;7.0.7.
图 4　不同引物浓度对扩增的影响
Fig.4　InfluenceofdifferentprimerconcentrationstoISSR-PCR
2.5　底物 dNTP对扩增的影响　底物 dNTP浓度过高 ,会
导致聚合酶错误的掺入 ,浓度过低 ,又会影响合成效率 ,甚至
会因 dNTP过早消耗而使产物单链化 ,影响扩增效果。从该试
验 6种 dNTP浓度的 PCR反应效果看 ,当在 20 μl体系中加入
0.25mmol/L的底物 dNTP时 ,扩增出来的条带最清楚(图 5)。
注:底物浓度(mmol/L)1.0.062 5;2.0.125 0;3.0.187 5;4.0.250 0;
5.0.375 0;6.0.500 0;7.Marker。
Note:Substrateconcentration1.0.0625;2.0.125 0;3.0.187 5;4.0.250 0;
5.0.375 0;6.0.500 0;7.Marker.
图 5　底物 dNTP浓度对扩增的影响
Fig.5　InfluenceofsubstratedNTPconcentrationtoISSR-PCR
(下转第 10428页)
10425　37卷 22期　　　　　　　　　　　　　　　　梁文汇等　大叶栎ISSR扩增体系的优化
于稻瘟菌基因组 DNA的 SSR标记。
3　讨论
PCR反应的扩增效率是反应体系中各因素综合作用的
结果。TaqDNA聚合酶和 Mg2+浓度对反应的影响较大 。
TaqDNA聚合酶的用量太低时 PCR反应不能进行 ,浓度太
高又会产生非特异性扩增 ,高浓度的游离 Mg2+可以提高 Taq
DNA聚合酶的活性 ,同时也会降低扩增的忠实性 ,使非特异
性条带增多。 dNTP浓度过低影响扩增效率 ,浓度过高将与
TaqDNA聚合酶竞争 Mg2+ ,影响游离 Mg2+浓度 ,降低酶活
性 。引物的质量和特异性也直接影响 PCR扩增反应 ,引物
浓度过高会促进非特异性扩增 ,还会增加引物二聚体的形
成 。与郑丽珊等所优化其他物种的 SSR反应体系 [ 10-12]相比
较 ,该试验所获得的稻瘟病菌的 SSR体系中 , TaqDNA聚合
酶的用量稍高;Mg2+的用量浮动不大;dNTP和引物的用量较
少;相对而言 ,模板 DNA适宜范围较宽 。退火温度高低对扩
增效果也有较大影响 ,温度太低时 ,扩增量小 ,电泳检测条带
没有或不清晰;温度过高则扩增量减少 ,甚至有可能导致无
扩增产物;适宜的温度能够提高 PCR反应的特异性 。因此 ,
退火温度的梯度试验是有必要的。
PCR反应是 SSR检测过程中的一个重要环节 ,其扩增效
果是反应体系中各因素综合作用的结果 [ 13] 。单因素设计
法 [ 14]是变化其中 1个因素的用量而固定其他各因素 ,逐一变
化各因素 ,然后得到各因素的最佳浓度 ,最后组合成最佳反
应体系。然而 SSR反应体系所含组分比较多 ,各组分均可能
对扩增的敏感性 、特异性和产量产生影响 ,所以这种方法忽
略了各因素的交互作用 。完全组合设计法虽然能够考虑到
各因素的相互作用 ,但是试验量相当大 [ 15] ,人力和物力消耗
也较大;相比较而言 ,多因素联合优化的正交试验设计法效
率高 ,进展快 ,节省了人力和物力。
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(上接第 10425页)
2.6　优化的 ISSR-PCR反应体系　综合上述试验结果 ,得
到优化的反应体系:总体积 20 μl中含有 DNA模板 60 ng、
PCR缓冲液 10×bufer为 2.0 μl,底物 dNTP终浓度为 0.25
mmol/L,引物终浓度为 0.3 μmol/L, TaqDNA聚合酶 1 U。
经过优化的大叶栎扩增的体系能够扩增出清晰 、多态性高的
条带(图 6),能够满足大叶栎种群 ISSR多样性分析的要求。
图 6　引物UBC-857扩增图谱
Fig.6　PrimerUBC-857ISSR-PCRpatten
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10428 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年