全 文 ：植物科学学报 2014，32(6) :612 ～619
Plant Science Journal
DOI:10. 11913 /PSJ. 2095－0837. 2014. 60612
漾濞大泡核桃病程相关蛋白 10 基因
JsPＲ10-1的克隆与表达分析
何 华，陈朝银，韩 青，张南南，葛 锋，刘迪秋*
(昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500)
摘 要:病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PＲ)10 的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的
作用。根据漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)编码 PＲ10 的 EST (expressed sequence tag)序列设计引物，利用
快速扩增 cDNA末端技术，克隆得到 PＲ10 基因的全长 cDNA序列，并命名为 JsPＲ10-1。JsPＲ10-1全长 cDNA
为776 bp，含有483 bp 的开放阅读框、74 bp 5-非编码区以及 219 bp 3-非编码区，编码含有 160 个氨基酸的
蛋白质。全长基因序列中含有 1 个 124 bp 的内含子。JsPＲ10-1编码的蛋白质与栎树(Quercus suber)、欧洲山
毛榉(Fagus sylvatica)以及欧洲板栗(Castanea sativa)的 PＲ10 相似性较高，并且在 PＲ10 的系统进化树中与双
子叶植物聚为一支。qＲT-PCＲ分析结果表明，植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导
JsPＲ10-1表达。在接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后，JsPＲ10-1的表达量迅速上升并在接种
8 h时达到最大值，表明 JsPＲ10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗
性机制奠定了理论依据。
关键词:漾濞大泡核桃;病程相关蛋白 10;基因克隆;胶孢炭疽菌;防卫反应
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:2095-0837(2014)06-0612-08
收稿日期:2014-03-25，退修日期:2014-05-13。
基金项目:国家科技部科技支撑计划项目(2011BAD46B00)。
作者简介:何华(1989－)，女，硕士研究生，研究方向为植物分子生物学(E-mail:keke0512@163. com)。
* 通讯作者(Author for correspondence. E-mail:diqiuliu@126. com)。
Cloning and Expression Analysis of a Pathogenesis-related
Protein 10 Gene fromJuglans sigillata
HE Hua，CHEN Chao-Yin，HAN Qing，ZHANG Nan-Nan，GE Feng，LIU Di-Qiu*
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)
Abstract:The activation and accumulation of pathogenesis-related protein (PＲ)10 play
predominant roles in the defense response against pathogens． Based on a Juglans sigillata
expressed sequence tag (EST)encoding PＲ10，gene-specific primers were designed and
used to amplify the full-length cDNA of a novel PＲ10 gene by rapid amplification of cDNA ends
(ＲACE)． This gene was named as JsPＲ10-1． JsPＲ10-1 was 776 bp in length with an open
reading frame (OＲF)of 483 bp，a 5-untranslated region (UTＲ)of 74 bp，and a 3-UTＲ of
219 bp，and the OＲF encoded a protein with 160 amino acid residues． There was an intron of
124 bp in the genomic sequence of JsPＲ10-1． Homology analysis indicated that JsPＲ10-1 was
homologous with PＲ10s from Quercus suber， Fagus sylvatica and Castanea sativa;
moreover，JsPＲ10-1 clustered together with the PＲ10s from dicots in the phylogenetic tree．
qＲT-PCＲ analysis showed that the expression levels of JsPＲ10-1 were induced by four
different plant signaling molecules，including salicylic acid，jasmonic acid，ethylene，and
H2O2 ． In addition， after inoculation with Colletotrichum gloeosporioides， JsPＲ10-1 was
sharply up-regulated with the highest expression level at 8 h． The JsPＲ10-1 gene was involved
in the defense response against C． gloeosporioides． This experiment lays a theoretical
foundation for revealing the mechanism of resistance in J． sigillata．
Key words:Juglans sigillata;Pathogenesis-related protein 10;Gene cloning;Colletotrichum
gloeosporioides;Defense response
植物在生长发育过程中常遭受多种生物和非生
物因子的胁迫，如干旱、寒冷、真菌侵染等，因此
进化出一系列的防御机制来抵御逆境胁迫，其中病
程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PＲ)
的激活和积累是植物参与防御反应的重要组成部
分［1］。根据其亲缘关系、生物活性和结构的不同
将 PＲ蛋白分为 17 个家族(PＲ1 ～ PＲ17)［2］。大多
数 PＲ蛋白为胞外蛋白，而 PＲ10 蛋白是典型的胞
内蛋白，广泛存在于细胞溶质中。另外，PＲ10 还
具有分子量较低(16 ～19 kD)、等电点偏酸性以及
三级结构高度保守等特性［3］。PＲ10 与主要的树木
花粉过敏原和食物过敏原十分相似，并且属于 Bet
v 1-like超家族［4］。其二级结构中存在一个高度保
守的氨基酸序列 GXGGXG (X为任意氨基酸) ，被
称为“P-loop”基序。该基序广泛存在于核酸结合
蛋白中，并且其磷酸化可能与 PＲ10 的核糖核酸酶
活性有关［5］。
PＲ10 蛋白广泛存在于高等植物中，当遭受细
菌、真菌和病毒侵染时，一些 PＲ10 基因的表达量
显著增高。Pseudomonas syringae 侵染可以诱导
葡萄(Vitis vinifera)VvPＲ10-1的表达［6］;TMV侵
染辣椒(Capsicum annuum)增加了 CaPＲ-10 的表
达量［7］。PＲ10 基因也对干旱［8］、物理损伤［9］、
UV射线［10］等非生物胁迫产生应答。机械损伤和
Cronartium ribicola 侵染均可使松树(Pinus monti-
cola)PmPＲ10 上调表达［11］。另外，植物激素和
信号分子也可以使一些 PＲ10 基因上调表达，例如
茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水杨酸(salicylic
acid，SA)、过氧化氢(H2O2)、乙烯(ethylene，
ET)、赤霉素(gibberellic acid，GA3)等
［12］。研究
表明一些植物 PＲ10 具有核糖核酸酶活性，如 Park
等［7］研究发现辣椒 CaPＲ-10 的核糖核酸酶活性在
抗病毒侵染过程中起重要作用。另外，有研究证实
羽扇豆(Lupinus luteus)LaPＲ-10 在体外具有核糖
核酸酶活性［5］。然而，植物 PＲ10 的生物学活性及
其参与防卫反应的分子机理有待深入研究。
核桃是中国主要的干果和木本油料植物，近年
来，随着核桃种植规模的扩大，病害有逐渐上升的
趋势。其中由病原真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum
gloeosporioides)引起的炭疽病是危害核桃的主要
病害之一，该病潜伏期长、发病时间短、爆发性极
强，被侵染的果皮变黑腐烂，极易引起早期落果，
核仁干瘪，严重影响产量与质量［13，14］。目前，从
核桃中分离真菌病害抗性基因的相关研究报道较
少。漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)是云南本地
主要的核桃之一，具有果大、壳薄、仁厚、味香、
含油率高等优点［15］。本实验室在前期研究中发现
漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌具有较强的抗性，因此
对胶孢炭疽菌接种后的漾濞大泡核桃叶片进行了转
录组测序(数据未发表)。我们在对漾濞大泡核桃
受胶孢炭疽菌侵染过程的表达谱分析中发现有几个
PＲ10 的 EST(expressed sequence tag)表达量明
显增高，为了深入研究 PＲ10 基因参与漾濞大泡核
桃对胶孢炭疽菌的防卫反应机制，本实验选择其中
一个 PＲ10 基因进行全长 cDNA的克隆和表达特性
分析，以期为漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的抗性机
制提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)苗购自大理
漾濞果艺核桃有限公司(该植株是以铁核桃 J． sigl-
lata为砧木的嫁接苗)，栽种于昆明理工大学的温
室中培养。选取温室中生长良好、有大量新生萌发
叶的漾濞大泡核桃植株(株高 80 ～100 cm)作为实
验材料。实验所用胶孢炭疽菌菌株由本实验室分
离、鉴定并保存。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 样品处理
首先在植株大小和长势一致的漾濞大泡核桃嫩
316第 6 期 何 华等:漾濞大泡核桃病程相关蛋白 10 基因 JsPＲ10-1的克隆与表达分析
叶上进行受伤处理，即用砂纸磨去蜡质层，处理面
积约 1 cm2;再用打孔器取大小一致且生长良好的
新鲜胶孢炭疽菌菌丝附于伤口处，用保鲜膜将处理
的叶片包好保湿;对照组叶片只进行受伤处理。然
后采集接种 2、4、8、24、48、72 h 的叶片，同
时采集相应时间段的对照叶片。此外，分别
用 5 mmol /L SA、100 μmol /L JA、1 mmol /L ET
和 1 mmol /L H2O2 四种逆境胁迫相关信号分子处
理漾濞大泡核桃叶片，处理方法与胶孢炭疽菌接种
处理方法相同，然后分别收集处理 6、12、24、48
h的叶片，同时采集相应时间段的对照叶片。
所有处理均对 3 个单株进行平行处理。收集的
样品经液氮速冻后于－80℃保存，备用。
1. 2. 2 ＲNA提取及 mＲNA分离
将从 3 个单株上采集的同一处理时间段的叶片
等量混合，采用改良的异硫氰酸胍法［16］提取各处
理时间段样品的总 ＲNA。取适量胶孢炭疽菌接种
2、4、8、24、48、72 h时的漾濞大泡核桃叶片分
别提取总 ＲNA，再从各 ＲNA 样品中取等量混合，
按照 NucleoTrap mＲNA Midi Kit (Macher-
ey-Nagel，Germany)说明书分离 mＲNA，并以分
离的 mＲNA 逆转录合成 ＲACE (rapid amplifica-
tion of cDNA ends)模板(Clontech，USA)。
1. 2. 3 5-ＲACE和 3-ＲACE
根据本实验室转录组测序得到的漾濞大泡核桃
PＲ10 EST序列，设计 5-ＲACE和 3-ＲACE基因特
异引物。5-ＲACE的基因特异引物为:5-ACGTCT-
TCTTCCTTGATCTCGTGGTCG-3;3-ＲACE的基因
特异引物为:5-CAAAGGTTGTACCTCAGGCAGT-
CAAGAG-3。ＲACE-PCＲ产物经 TA 克隆连接到
pMD18-T (TaKaＲa，Japan)载体上，再将连接产
物转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，挑选阳
性克隆测序。
1. 2. 4 DNA提取及基因组序列的克隆
采集温室中生长健壮植株的漾濞大泡核桃嫩
叶，采用改良的 CTAB 法［17］提取叶片基因组
DNA。以基因组 DNA 为模板，用扩增全长开放阅
读框(OＲF)的特异性引物进行基因组序列扩增，
扩增产物经 TA克隆，转化至大肠杆菌 DH5α 感受
态细胞中，然后挑选阳性克隆测序。
1. 2. 5 全长 OＲF的克隆及生物信息学分析
使用在线分析软件 NCBI (http://www． ncbi．
nlm． nih． gov /)中的“bl2seq”对 3-ＲACE扩增序
列、5-ＲACE扩增序列与 PＲ10 EST序列进行拼
接，并利用 NCBI中的“OＲF finder”查找拼接得
到的全长 cDNA 序列中最大的开放阅读框。根
据全长 cDNA 序列设计扩增全长 OＲF的特异引
物并对全长 OＲF进行 PCＲ扩增与 TA 克隆后送
上海生工进行测序。扩增全长 OＲF 的上、下游
引物为:5-ACTCCTTTTCCTTTTACCACTTCCA-
3;5-AACAACTCGCAGGGTCGCAGA-3。使用在
线软件 NCBI的 BLAST对得到的基因和蛋白质序
列的同源性进行分析。多重序列比对和聚类分析用
MEGA3 软件完成。PＲ10 信号肽序列预测用 Sig-
nalP 4. 1(http://www． cbs． dtu． dk /services /Sig-
nalP/)完成。利用在线分析软件 ProtParam (ht-
tp://www． au． expasy． org / tools /protpatam． ht-
ml)对 PＲ10 的理化性质进行预测。借助 Predict-
Protein (http://www. predictprotein. org /)分析蛋
白质的二级结构并预测其亚细胞定位。使用
ESyPred3D (http://www. fundp. ac． be /sci-
ences /biologie /urbm /bioinfo /esypred /)分 析 蛋
白质的三维结构。
1. 2. 6 qＲT-PCＲ
采用 qＲT-PCＲ分析 PＲ10 基因在漾濞大泡核
桃经胶孢炭疽菌接种后以及 SA、JA、ET、H2O2
四种信号分子处理后不同时间段的表达水平。将从
3 个单株上采集的同一时间段的叶片等量混合，然
后提取总 ＲNA，经逆转录产生 cDNA 模板;以漾
濞大泡核桃组蛋白 3 基因(JsHis3，KJ196384)作
为内参基因。漾濞大泡核桃 PＲ10 基因的特异引物
序列为:5-AAGGTTGTACCTCAGGCAGTCAA-3;
5-TCATGGGATGCCACTATCTTCG-3。内参基因
JsHis3 的特异引物序列分别为:5-GATCGCA-
CAGAGGTTGGTGTC-3; 5-CGTCCGTGAAATT-
GCACAAGA-3。qＲT-PCＲ 反 应 条 件 为:95℃
2 min;以下反应 40 个循环，95℃ 15 s，60℃
1 min。每个 qＲT-PCＲ反应均设 3 次重复，以正
常生长的漾濞大泡核桃叶片中 PＲ10 的表达量为对
照，采用 2－△△CT 法计算 PＲ10 在其它样品中的相对
416 植 物 科 学 学 报 第 32 卷
表达量。正常生长的漾濞大泡核桃叶片中 PＲ10 的
表达量与各处理后的叶片中 PＲ10 表达量之间采用
t检验进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1 全长 cDNA 以及基
因组序列的克隆
根据转录组测序已得到的漾濞大泡核桃 PＲ10
的 EST序列(数据未发表) ，通过 5-ＲACE 及 3-
ＲACE扩增获得了 EST的全长 cDNA 序列。ＲACE
扩增结果显示(图 1:a) ，5-ＲACE产物约 474 bp，
3-ＲACE产物约 608 bp。经过序列拼接获得该
PＲ10 的全长 cDNA，序列长 776 bp，其中包括一
个 483 bp 的 OＲF、74 bp 的 5-非翻译区(un-
translated region，UTＲ)以及 219 bp 的 3-UTＲ，
OＲF编码一个含有 160 个氨基酸的蛋白质。根据
拼接后得到的全长 cDNA 序列设计特异引物，成
功扩增出全长 OＲF以及基因组序列(图 1:b)，其
M:DL2000 标记;1:5ＲACE扩增产物;2:3ＲACE扩增产物;
3:JsPＲ10-1基因组序列的扩增产物;4:JsPＲ10-1基因全长 OＲF
的扩增产物。
M:DL2000 marker; 1: Amplification product of 5 ＲACE;
2:Amplification product of 3ＲACE;3:Amplification product of
genomic sequence;4:Amplification product of OＲF．
图 1 JsPＲ10-1基因的 ＲACE扩增产物(a)、全长
OＲF 以及基因组序列的扩增产物(b)
Fig. 1 Amplification results of ＲACEs (a)，full-
length OＲF，and genomic sequence of JsPＲ10-1 (b)
中基因组序列中存在 1 个 124 bp 的内含子，位于
编码精氨酸的 AGG 密码子内，属于 GU-AG 型内
含子(图 2)。后续的生物信息学分析表明所克隆的
cDNA序列编码 PＲ10 蛋白，因此将此基因命名为
JsPＲ10-1，GenBank登录号为 KJ598787。
2. 2 生物信息学分析
2. 2. 1 序列同源性分析、多重序列比对及进化树
构建
BLASTn分析结果显示，漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1
图 2 JsPＲ10-1的基因结构
Fig. 2 Gene structure of JsPＲ10-1
的第 82 ～259 位核苷酸序列与桦树 PＲ-10-02 (Be-
tula nigra，EU526188.1)的第 1 ～178位核苷酸序列
具有 83% 的相似性。蛋白质同源性分析表明
JsPＲ10-1编码的蛋白质序列与栎树 Bet v 1 过敏原
(Quercus suber，AFF59689.1)、欧洲山毛榉 PＲ1
(Fagus sylvatica，CAA10235.1)以及欧洲板栗
ypr10 (Castanea sativa，CAD10374.1)高度同源，
相似性分别为 83%、79%和 77%。将 JsPＲ10-1与
上述 3 个 PＲ10 蛋白以及苹果(Malus domestica)
Mal d 1 (CAA96535. 1)进行多重序列比对，结果
发现这 5 个 PＲ10 均有一个高度保守的 GXGGXG
(X为任意氨基酸)基序，称为“P-loop”(图 3)，
另外，还发现 E97、E149 和 Y151 这 3 个保守的
氨基酸残基存在于每个 PＲ10 中(图 3)。
聚类分析选取了来自不同物种的 14 个 PＲ10
与漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1构建 PＲ10 系统进化树。
聚类结果显示(图 4)，15 个 PＲ10 聚为 2 大支。
进化树下端的一支由单子叶植物麝香百合(Lilium
longiflorum)、芦笋(Asparagus officinalis)、水稻
(Oryza sativa)和高粱(Sorghum bicolor)的 PＲ10
组成，其中水稻和高粱的 PＲ10 位于进化树的底
端。双子叶植物欧洲山毛榉、欧洲板栗、栎树、苹
果、欧洲榛(Corylus avellana)、桦树、羽扇豆、
紫花苜蓿(Medicago sativa)、黄果茄(Solanum
surattense)、辣椒的 PＲ10 与 JsPＲ10-1聚为另一
大支。其中欧洲山毛榉、欧洲板栗、栎树以及漾濞
大泡核桃的 PＲ10 位于进化树的顶端，再次证明它
们之间存在很高的同源性。
2. 2. 2 JsPＲ10-1 编码蛋白质的理化性质预测、
信号肽及潜在修饰位点分析
JsPＲ10-1分子量约为 17. 53 kD，等电点约为
5. 51。该蛋白在酵母和大肠杆菌中的半衰期分别大
516第 6 期 何 华等:漾濞大泡核桃病程相关蛋白 10 基因 JsPＲ10-1的克隆与表达分析
“P-loop”基序用方框标识，3 个保守氨基酸用倒三角形标识。
The‘P-loop’motif is indicated with frame． Three conserved amino acid residues of PＲ10s are labeled with inverted triangle，respec-
tively．
图 3 JsPＲ10-1与 4 种植物 PＲ10 的多重序列比对
Fig. 3 Multiple alignment of amino acid sequence of JsPＲ10-1 and four plant PＲ10s
JsPＲ10-1用方框标识。括号内分别为各物种 PＲ10 的登录号。
JsPＲ10-1 is indicated with frame． GenBank numbers of plant species PＲ10s are given in parentheses，respectively．
图 4 JsPＲ10-1与其它物种 PＲ10 的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of JsPＲ10-1 and PＲ10s
from other plant species
于 20 h和 10 h，不稳定指数为 24. 72，小于阀值
40。另外，JsPＲ10-1脂肪族系数为 82. 30，总亲
水系数为 －0. 408。SignalP 4. 1 分析结果显示，
JsPＲ10-1没有信号肽，因此推测该蛋白不是分泌
蛋白。PredictProtein 分析表明该蛋白没有 N 端分
泌信号以及核定位信号，可能定位在细胞溶质中。
在 JsPＲ10-1中共发现了 5 种可能的翻译后修饰位
点:N-糖基化位点(N-glycosylation site，2 个)、
cAMP-and cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点
(cAMP- and cGMP-dependent protein kinase
phosphorylation site，1个)、蛋白激酶 C磷酸化位
点(Protein kinase C phosphorylation site，1 个)、
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酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(casein kinase Ⅱ phos-
phorylation site，3 个)和 N-豆蔻酰化位点(N-
my-ristoylation site，2 个)。
2. 2. 3 JsPＲ10-1编码蛋白质的二级结构及三维
结构预测
PredictProtein 预测结果表明，PＲ10 蛋白中
α-螺旋(H)、β-折叠(E)和无规则卷曲(L)所占百
分比分别为 23. 87%、36. 77%和 39. 35%。其中
二级结构共包含 2 个可能的 α螺旋和 7 个可能的 β
折叠:α1 (15 ～ 28)、α2 (131 ～ 154)、β1 (4 ～
12)、β2 (40 ～ 46)、β3 (53 ～ 60)、β4 (67 ～
75)、β5 (81 ～ 88)、β6 (97 ～ 107)、β7 (112 ～
122)。蛋白质的三级结构很大程度上决定了蛋白
质的功能，为了探究漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1结构
与功能之间的关系，以樱桃(Prunus avium)主要
过敏原 pru av 1 (1E09. 1)为模板构建了 JsPＲ10-
1的三维模型(两者的蛋白质序列相似性为 53%)。
由 JsPＲ10-1的三级结构可知(图 5)，从 C端开始
以一个长的 α 折叠连接 7 个反相平行的 β 折叠，
靠近 N端的结构域为 2 个短的 α 螺旋，它们通过
无规则卷曲连接在一起。整个结构中心构成空穴，
该空穴可能与黄酮类、脂肪酸、细胞分裂素等非极
性
图 5 JsPＲ10-1的三维结构模型
Fig. 5 Putative 3D structure of JsPＲ10-1
配体的胞内运输有关［18］。
2. 3 JsPＲ10-1的表达特性分析
采用 qＲT-PCＲ对漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1 经
胶孢炭疽菌侵染后以及 4 种信号分子处理后表达量
的变化进行了比较分析。结果显示(图 6)，接种胶
孢炭疽菌后，JsPＲ10-1 的表达量迅速上升，在接
种 8 h时表达量达到最大值，约为对照的 2. 5 倍;
随后下降，在接种 48 h 时下降到最低值且明显低
于对照，随后略微上升。信号分子 JA、SA、ET
和 H2O2 处理均不同程度诱导了 JsPＲ10-1的表达，
且表达量均在 6 h时达到最大值。不同的是 SA和
* ，P ＜ 0. 05;＊＊，P ＜ 0. 01。
图 6 胶孢炭疽菌侵染过程中及 SA、JA、ET、H2O2 处理后 JsPＲ10-1的表达水平
Fig. 6 Expression levels of JsPＲ10-1 during Colletotrichum gloeosporioides
infection as well as after treatment by SA，JA，ET and H2O2
716第 6 期 何 华等:漾濞大泡核桃病程相关蛋白 10 基因 JsPＲ10-1的克隆与表达分析
JA处理 6 ～ 24 h 期间表达量持续下降，直至处
理 48 h 时才有小幅上升但仍低于对照;而 ET
和 H2O2 处理 6 ～12 h期间表达量急剧下降，在处
理 24 h时才略微回升，随后再次下降。综上分析，
JsPＲ10-1的表达受胶孢炭疽菌和逆境胁迫相关信
号分子的诱导，并且漾濞大泡核桃 JsPＲ10-1显然
参与了对胶孢炭疽菌的防卫反应。
3 讨论
PＲ10 是广泛存在于高等植物体内的一类非常
重要的病程相关蛋白，不仅参与植物对生物和非生
物胁迫的防卫反应，在植物正常生长发育中也有一
定的功能。漾濞大泡核桃是云南省重要的经济树
种，并且对胶孢炭疽菌有较强的抗性，为了研究漾
濞大泡核桃的抗性机理，我们对其进行胶孢炭疽菌
侵染，转录组测序结果显示 PＲ10 EST的表达量明
显增加。因此，通过 5-ＲACE和 3-ＲACE克隆得
到了 PＲ10 基因 JsPＲ10-1，该基因编码的氨基酸
序列与栎树、欧洲山毛榉、欧洲板栗的 PＲ10 高度
同源。JsPＲ10-1 不存在 N 端信号肽序列，并且
PredictProtein 分析也表明 JsPＲ10-1 是定位于细
胞溶质中的非分泌蛋白，这些特征与已知植物物种
的 PＲ10 高度一致。
植物 PＲ10 是低分子量的酸性蛋白。棉花
(Gossypium arboreum)GaPＲ-10 和辣椒 CaPＲ-
10 均编码含有 159 个氨基酸的蛋白质，等电点分
别为 4. 95 和 5. 2［3，7］。本研究从漾濞大泡核桃中
分离出的 JsPＲ10-1基因编码含有 160 个氨基酸的
蛋白质，等电点约为5. 51，说明 JsPＲ10-1编码典
型的 PＲ10 蛋白。JsPＲ10-1 与其它植物的 14 个
PＲ10 构建的进化树显示，单子叶和双子叶植物分
别聚为 2 大支，可见单子叶和双子叶植物的 PＲ10
能部分揭示单子叶物种和双子叶物种间的差异。另
外，JsPＲ10-1序列中存在保守基序“P-loop”，该
基序广泛存在于核酸结合蛋白中，并且参与 ATP
和 GTP的结合，可能与维持 PＲ10 的核糖核酸酶
活性有关［19］。Wu 等［19］研究发现定点突变甘薯
(Pachyrrhizus erosus)PＲ10 蛋白 SPE-16 序列中
的 Glu95、Glu147 和 Tyr149 三个保守氨基酸，导
致其核糖核酸酶活性丧失。本研究 JsPＲ10-1序列
中存在“P-loop”以及 E97、E149 和 Y151 三个保
守的氨基酸，暗示 JsPＲ10-1可能具有核糖核酸酶
活性。
在病原菌的侵染过程中，植物参与胁迫应答的
基因会大量诱导表达，PＲ10 的表达与积累是植物
响应生物胁迫的重要途径之一。葡萄(V． pseudo-
reticulata)受病原菌(Plasmopara viticolainfection)
侵染后，VpPＲ10. 2 的表达量显著提高［20］。花生
(Arachis hypogaea)AhPＲ10 基因通过原核表达
的融合蛋白抑制 Fusarium oxysporum和 Ｒhizocto-
nia solani的生长［21］。黄果茄 SsPＲ10 在体外对稻
瘟病有显著的抑制作用［12］。本研究 qＲT-PCＲ结果
显示，胶孢炭疽菌接种到漾濞大泡核桃叶片后，
JsPＲ10-1表达量迅速上升，并且在接种 8 h 时表
达水平增加至对照的 2. 5 倍，说明 JsPＲ10-1参与
漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的应答反应。此外，信
号分子 SA、JA、H2O2 和 ET 处理可显著提高
JsPＲ10-1的转录水平，暗示 JsPＲ10-1 可能通过
这些信号通路介导漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌或其
它逆境胁迫的抗性。
PＲ10 作为一类病程相关蛋白，响应生物与
非生物胁迫，是植物防御系统的重要组成部分，
并且有些 PＲ10 蛋白已证实具有核糖核酸酶活性
与抗菌活性［3，7，12，21］。本研究结果表明漾濞大泡
核桃 JsPＲ10-1 参与对胶孢炭疽菌的防卫反应，
因此下一步有必要对其生物学活性及其功能进行
深入分析。目前我们已经构建了 JsPＲ10-1超表达
载体，下一步以期得到 JsPＲ10-1的转基因烟草及
JsPＲ10-1功能的初步信息。
参考文献:
［1］ Jwa NS，Kumar AG，Ｒakwal Ｒ，Park CH，Agra-
wal VP． Molecular cloning and characterization of
a novel jasmonate inducible pathogenesis-related
class 10 protein gene， JIOsPＲ10， from rice
(Oryza sativa L．)seedling leaves［J］． Biochem
Biophys Ｒes Commun，2001，286(5):973－983．
［2］ van Loon LC，Ｒep M，Pieterse CM． Significance
of inducible defense-related proteins in infected
plants［J］． Annu Ｒev Phytopathol，2006，44:
135－162．
［3］ Zhou XJ，Shan L，Xu YH，Wang JW，Chen XY． A
816 植 物 科 学 学 报 第 32 卷
cotton cDNA (GaPＲ-10)encoding a pathogene-
sis-related 10 protein with in vitro ribonuclease
activity［J］． Plant Sci，2002，162(4):629－636．
［4］ Ｒadauer C，Lackner P，Breiteneder H． The Bet v
1 fold:an ancient，versatile scaffold for binding
of large，hydrophobic ligands［J］． BMC Evol Bi-
ol，2008，8(1) :286．
［5］ Bantignies B，Séguin J，Muzac I，Dédaldéchamp
F，Gulick P，Ibrahim Ｒ． Direct evidence for ribo-
nucleolytic activity of a PＲ-10-like protein from
white lupin roots［J］． Plant Mol Biol，2000，42
(6) :871－881．
［6］ Ｒobert N，Ferran J，Breda C，Coutos-Thévenot
P，Boulay M，Buffard D，Esnault Ｒ． Molecular
chara-cterization of the incompatible interaction
of Vitis vinifera leaves with Pseudomonas syringae
pv． pisi:expression of genes coding for stilbene
synthase and class 10 PＲ protein［J］． Eur J Plant
Pathol，2001，107(2) :249－261．
［7］ Park CJ，Kim KJ，Shin Ｒ，Park JM，Shin YC，
Paek KH． Pathogenesis-related protein 10 isola-
ted from hot pepper functions as a ribonuclease
in an antiviral pathway［J］． Plant J，2004，37
(2) :186－198．
［8］ Dubos C，Plomion C． Drought differentially affects
expression of a PＲ-10 protein，in needles of mari-
time pine (Pinus pinaster Ait．)seedlings［J］． J
Exp Bot，2001，52(358) :1143－1144．
［9］ Walter MH，Liu JW，Wünn J，Hess D． Bean ribo-
nuclease-like pathogenesis-related protein genes
(Ypr10) display complex patterns of develop-
mental，dark-induced and exogenous-stimulus-
dependent expression ［J］． Eur J Biochem，
1996，239(2) :281－293．
［10］ Pinto MP， Ｒicardo CP． Lupinus albus L．
pathoge-nesis-related proteins that show similarity
to PＲ-10 proteins［J］． Plant Physiol，1995，109
(4) :1345－1351．
［11］ Liu JJ，Ekramoddoullah AK，Yu XS． Differential
expression of multiple PＲ10 proteins in western
white pine following wounding， fungal infection
and cold hardening ［J］． Physiol Plantarum，
2003，119(4) :544－553．
［12］ Liu XJ，Huang BB，Lin J，Fei J，Chen ZH，Pang
YZ，Sun XF，Tang KX． A novel pathogenesis-re-
lated protein (SsPＲ10)from Solanum surattense
with ribonucleolytic and antimicrobial activity is
stress- and pathogen-inducible ［J］． J Plant
Phy-siol，2006，163(5) :546－556．
［13］ 王勇，樊爱斌，李鲲鹏，郭永亮． 早实核桃炭疽病的
发生及防治试验［J］． 山西果树，2005，105(3):
11－12．
［14］ 赵立娟，张红娟，王美琴，曹挥，郝晓娟，樊新萍．
胶孢炭疽病菌对不同核桃品种的致病性测定［J］．
中国农学通报，2013，29(28):115－118．
［15］ 杨恩，陈少瑜，张雨，范志远，习学良． 漾濞核桃叶
片基因组 DNA 的两种提取法方法效果比较［J］．
西部林业科学，2006，34(4):72－75．
［16］ Liu D，Zhang X，Tu L，Zhu L，Guo X． Isolation by
suppression-subtractive hybridization of genes
preferentially expressed during early and late fi-
ber development stages in cotton［J］． Mol Biol
(Mosk) ，2006，40(5) :825－834．
［17］ 周阿涛，岳亮亮，李旻，刘迪秋，丁元明． 云南山茶
(Camellia reticulata)nrDNA ITS序列多态性分析
［J］． 植物科学学报，2013，31(1):1－10．
［18］ Koistinen KM， Soininen P， Vanlinen TA，
Hyrinen J，Laatikainen Ｒ，Perkyl M，Terva-
hauta AI，Krenlampi SO． Birch PＲ-10c interacts
with several biologically important ligands［J］．
Phytochemistry，2005，66(21) :2524－2533．
［19］ Wu F，Yan M，Li YK，Chang SJ，Song XM，Zhou
ZC，Gong WM． cDNA cloning，expression，and
mutagenesis of a PＲ-10 protein SPE-16 from the
seeds of Pachyrrhizus erosus［J］． Biochem Bio-
phys Ｒes Commun，2003，312(3) :761－766．
［20］ He MY，Xu Y，Cao JL，Zhu ZG，Jiao YT，Wang
YJ，Guan X，Yang YZ，Xu WＲ，Fu ZF． Subcellu-
lar localization and functional analyses of a PＲ10
protein gene from Vitis pseudoreticulata response
to Plasmopara viticolainfection［J］． Protoplasma，
2013，250(1) :129－140．
［21］ Chadha P，Das ＲH． A pathogenesis related pro-
tein，AhPＲ10 from peanut:an insight of its mode
of antifungal activity［J］． Planta，2006，225(1) :
213－222．
(责任编辑:张 平)
916第 6 期 何 华等:漾濞大泡核桃病程相关蛋白 10 基因 JsPＲ10-1的克隆与表达分析