全 文 ：植物科学学报　 ２０１４ꎬ ３２(６): ６１２~６１９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１４􀆰 ６０６１２
漾濞大泡核桃病程相关蛋白 １０基因
ＪｓＰＲ１０￣１的克隆与表达分析
何 华ꎬ 陈朝银ꎬ 韩 青ꎬ 张南南ꎬ 葛 锋ꎬ 刘迪秋∗
(昆明理工大学生命科学与技术学院ꎬ 昆明 ６５０５００)
摘　 要: 病程相关蛋白(ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＰＲ) １０的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的
作用ꎮ 根据漾濞大泡核桃(Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａ)编码 ＰＲ１０的 ＥＳＴ (ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ)序列设计引物ꎬ 利用
快速扩增 ｃＤＮＡ末端技术ꎬ 克隆得到 ＰＲ１０基因的全长 ｃＤＮＡ序列ꎬ 并命名为 ＪｓＰＲ１０￣１ꎮ ＪｓＰＲ１０￣１全长 ｃＤＮＡ
为 ７７６ ｂｐꎬ 含有 ４８３ ｂｐ的开放阅读框、 ７４ ｂｐ ５′￣非编码区以及 ２１９ ｂｐ ３′￣非编码区ꎬ 编码含有 １６０个氨基酸的
蛋白质ꎮ 全长基因序列中含有 １个 １２４ ｂｐ的内含子ꎮ ＪｓＰＲ１０￣１编码的蛋白质与栎树(Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｕｂｅｒ)、 欧洲山
毛榉(Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ)以及欧洲板栗(Ｃａｓｔａｎｅａ ｓａｔｉｖａ)的 ＰＲ１０相似性较高ꎬ 并且在 ＰＲ１０的系统进化树中与双
子叶植物聚为一支ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析结果表明ꎬ 植物信号分子水杨酸、 茉莉酸、 乙烯以及过氧化氢处理均可诱导
ＪｓＰＲ１０￣１表达ꎮ 在接种胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)后ꎬ ＪｓＰＲ１０￣１的表达量迅速上升并在接种
８ ｈ时达到最大值ꎬ 表明 ＪｓＰＲ１０￣１参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应ꎮ 本研究为揭示漾濞大泡核桃抗
性机制奠定了理论依据ꎮ
关键词: 漾濞大泡核桃ꎻ 病程相关蛋白 １０ꎻ 基因克隆ꎻ 胶孢炭疽菌ꎻ 防卫反应
中图分类号: Ｑ７８　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０６￣０６１２￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０３￣２５ꎬ 退修日期: ２０１４￣０５￣１３ꎮ
　 基金项目: 国家科技部科技支撑计划项目(２０１１ＢＡＤ４６Ｂ００)ꎮ
　 作者简介: 何华(１９８９－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物分子生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｋｅｋｅ０５１２＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｉｑｉｕｌｉｕ＠１２６􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ １０ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａ
ＨＥ Ｈｕａꎬ ＣＨＥＮ Ｃｈａｏ￣Ｙｉｎꎬ ＨＡＮ Ｑｉｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｎａｎ￣Ｎａｎꎬ ＧＥ Ｆｅｎｇꎬ ＬＩＵ Ｄｉ￣Ｑｉｕ∗
(Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０５００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ( ＰＲ ) １０ ｐｌａｙ
ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ (ＥＳＴ) ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＰＲ１０ꎬ ｇｅｎｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ
ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＰＲ１０ ｇｅｎｅ ｂｙ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ
(ＲＡＣＥ) . Ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ａｓ ＪｓＰＲ１０￣１. ＪｓＰＲ１０￣１ ｗａｓ ７７６ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ) ｏｆ ４８３ ｂｐꎬ ａ ５′￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ (ＵＴＲ) ｏｆ ７４ ｂｐꎬ ａｎｄ ａ ３′￣ＵＴＲ ｏｆ
２１９ ｂｐꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ＯＲＦ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ １６０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ. Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ
１２４ ｂｐ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１. Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＪｓＰＲ１０￣１ ｗａｓ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ＰＲ１０ｓ ｆｒｏｍ Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｕｂｅｒꎬ Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ ａｎｄ Ｃａｓｔａｎｅａ ｓａｔｉｖａꎻ
ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ＪｓＰＲ１０￣１ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲ１０ｓ ｆｒｏｍ ｄｉｃｏｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ.
ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｆｏｕｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｅｔｈｙｌｅｎｅꎬ ａｎｄ
Ｈ２Ｏ２ . Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎬ ＪｓＰＲ１０￣１ ｗａｓ ｓｈａｒｐｌｙ
ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｔ ８ ｈ. Ｔｈｅ ＪｓＰＲ１０￣１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｃ. ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ. Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｌａｙｓ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｊ. ｓｉｇｉｌｌａｔａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａꎻ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １０ꎻ Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎻ Ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
　 　 植物在生长发育过程中常遭受多种生物和非生
物因子的胁迫ꎬ 如干旱、 寒冷、 真菌侵染等ꎬ 因此
进化出一系列的防御机制来抵御逆境胁迫ꎬ 其中病
程相关蛋白 (ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＰＲ)
的激活和积累是植物参与防御反应的重要组成部
分[１]ꎮ 根据其亲缘关系、 生物活性和结构的不同
将 ＰＲ蛋白分为 １７个家族(ＰＲ１~ ＰＲ１７) [２]ꎮ 大多
数 ＰＲ蛋白为胞外蛋白ꎬ 而 ＰＲ１０ 蛋白是典型的胞
内蛋白ꎬ 广泛存在于细胞溶质中ꎮ 另外ꎬ ＰＲ１０ 还
具有分子量较低(１６~１９ ｋＤ)、 等电点偏酸性以及
三级结构高度保守等特性[３]ꎮ ＰＲ１０ 与主要的树木
花粉过敏原和食物过敏原十分相似ꎬ 并且属于 Ｂｅｔ
ｖ １￣ｌｉｋｅ超家族[４]ꎮ 其二级结构中存在一个高度保
守的氨基酸序列 ＧＸＧＧＸＧ (Ｘ为任意氨基酸)ꎬ 被
称为“Ｐ￣ｌｏｏｐ”基序ꎮ 该基序广泛存在于核酸结合
蛋白中ꎬ 并且其磷酸化可能与 ＰＲ１０ 的核糖核酸酶
活性有关[５]ꎮ
ＰＲ１０蛋白广泛存在于高等植物中ꎬ 当遭受细
菌、 真菌和病毒侵染时ꎬ 一些 ＰＲ１０ 基因的表达量
显著增高ꎮ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ 侵染可以诱导
葡萄(Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ) ＶｖＰＲ１０￣１的表达[６]ꎻ ＴＭＶ 侵
染辣椒(Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ)增加了 ＣａＰＲ￣１０的表
达量[７]ꎮ ＰＲ１０ 基因也对干旱[８]、 物理损伤[９]、
ＵＶ射线[１０]等非生物胁迫产生应答ꎮ 机械损伤和
Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ｒｉｂｉｃｏｌａ 侵染均可使松树(Ｐｉｎｕｓ ｍｏｎｔｉ￣
ｃｏｌａ) ＰｍＰＲ１０ 上调表达[１１]ꎮ 另外ꎬ 植物激素和
信号分子也可以使一些 ＰＲ１０ 基因上调表达ꎬ 例如
茉莉酸 ( ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ＪＡ)、 水杨酸 ( ｓａｌｉｃｙｌｉｃ
ａｃｉｄꎬ ＳＡ)、 过氧化氢(Ｈ２Ｏ２ )、 乙烯( ｅｔｈｙｌｅｎｅꎬ
ＥＴ)、 赤霉素(ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ ａｃｉｄꎬ ＧＡ３)等[１２]ꎮ 研究
表明一些植物 ＰＲ１０具有核糖核酸酶活性ꎬ 如 Ｐａｒｋ
等[７]研究发现辣椒 ＣａＰＲ￣１０ 的核糖核酸酶活性在
抗病毒侵染过程中起重要作用ꎮ 另外ꎬ 有研究证实
羽扇豆(Ｌｕｐｉｎｕｓ ｌｕｔｅｕｓ)ＬａＰＲ￣１０ 在体外具有核糖
核酸酶活性[５]ꎮ 然而ꎬ 植物 ＰＲ１０的生物学活性及
其参与防卫反应的分子机理有待深入研究ꎮ
核桃是中国主要的干果和木本油料植物ꎬ 近年
来ꎬ 随着核桃种植规模的扩大ꎬ 病害有逐渐上升的
趋势ꎮ 其中由病原真菌胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)引起的炭疽病是危害核桃的主要
病害之一ꎬ 该病潜伏期长、 发病时间短、 爆发性极
强ꎬ 被侵染的果皮变黑腐烂ꎬ 极易引起早期落果ꎬ
核仁干瘪ꎬ 严重影响产量与质量[１３ꎬ１４]ꎮ 目前ꎬ 从
核桃中分离真菌病害抗性基因的相关研究报道较
少ꎮ 漾濞大泡核桃(Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａ)是云南本地
主要的核桃之一ꎬ 具有果大、 壳薄、 仁厚、 味香、
含油率高等优点[１５]ꎮ 本实验室在前期研究中发现
漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌具有较强的抗性ꎬ 因此
对胶孢炭疽菌接种后的漾濞大泡核桃叶片进行了转
录组测序(数据未发表)ꎮ 我们在对漾濞大泡核桃
受胶孢炭疽菌侵染过程的表达谱分析中发现有几个
ＰＲ１０的 ＥＳＴ (ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ)表达量明
显增高ꎬ 为了深入研究 ＰＲ１０基因参与漾濞大泡核
桃对胶孢炭疽菌的防卫反应机制ꎬ 本实验选择其中
一个 ＰＲ１０基因进行全长 ｃＤＮＡ的克隆和表达特性
分析ꎬ 以期为漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的抗性机
制提供理论基础ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
漾濞大泡核桃( Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｇｉｌｌａｔａ)苗购自大理
漾濞果艺核桃有限公司(该植株是以铁核桃 Ｊ. ｓｉｇｌ￣
ｌａｔａ为砧木的嫁接苗)ꎬ 栽种于昆明理工大学的温
室中培养ꎮ 选取温室中生长良好、 有大量新生萌发
叶的漾濞大泡核桃植株(株高 ８０~１００ ｃｍ)作为实
验材料ꎮ 实验所用胶孢炭疽菌菌株由本实验室分
离、 鉴定并保存ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 样品处理
首先在植株大小和长势一致的漾濞大泡核桃嫩
３１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 何 华等: 漾濞大泡核桃病程相关蛋白 １０基因 ＪｓＰＲ１０￣１的克隆与表达分析
叶上进行受伤处理ꎬ 即用砂纸磨去蜡质层ꎬ 处理面
积约 １ ｃｍ２ꎻ 再用打孔器取大小一致且生长良好的
新鲜胶孢炭疽菌菌丝附于伤口处ꎬ 用保鲜膜将处理
的叶片包好保湿ꎻ 对照组叶片只进行受伤处理ꎮ 然
后采集接种 ２、 ４、 ８、 ２４、 ４８、 ７２ ｈ 的叶片ꎬ 同
时采集相应时间段的对照叶片ꎮ 此外ꎬ 分别用
５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＳＡ、 １００ μｍｏｌ / Ｌ ＪＡ、 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＴ 和
１ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈ２Ｏ２四种逆境胁迫相关信号分子处理漾
濞大泡核桃叶片ꎬ 处理方法与胶孢炭疽菌接种处理
方法相同ꎬ 然后分别收集处理 ６、 １２、 ２４、 ４８ ｈ
的叶片ꎬ 同时采集相应时间段的对照叶片ꎮ
所有处理均对 ３个单株进行平行处理ꎮ 收集的
样品经液氮速冻后于－８０℃保存ꎬ 备用ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＲＮＡ提取及 ｍＲＮＡ分离
将从 ３个单株上采集的同一处理时间段的叶片
等量混合ꎬ 采用改良的异硫氰酸胍法[１６]提取各处
理时间段样品的总 ＲＮＡꎮ 取适量胶孢炭疽菌接种
２、 ４、 ８、 ２４、 ４８、 ７２ ｈ时的漾濞大泡核桃叶片分
别提取总 ＲＮＡꎬ 再从各 ＲＮＡ 样品中取等量混合ꎬ
按照 ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ® ｍＲＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ (Ｍａｃｈｅｒｅｙ￣
Ｎａｇｅｌꎬ Ｇｅｒｍａｎｙ)说明书分离 ｍＲＮＡꎬ 并以分离
的 ｍＲＮＡ 逆转录合成 ＲＡＣＥ ( ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ)模板(Ｃｌｏｎｔｅｃｈꎬ ＵＳＡ)ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ５′￣ＲＡＣＥ和 ３′￣ＲＡＣＥ
根据本实验室转录组测序得到的漾濞大泡核桃
ＰＲ１０ ＥＳＴ序列ꎬ设计 ５′￣ＲＡＣＥ 和 ３′￣ＲＡＣＥ 基因特
异引物ꎮ ５′￣ＲＡＣＥ的基因特异引物为: ５′￣ＡＣＧＴＣＴ￣
ＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧ￣３′ꎻ ３′￣ＲＡＣＥ的基因
特异引物为: ５′￣ＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴ￣
ＣＡＡＧＡＧ￣３′ꎮ ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ 产物经 ＴＡ 克隆连接到
ｐＭＤ１８￣Ｔ (ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ)载体上ꎬ 再将连接产
物转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞中ꎬ 挑选阳
性克隆测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＤＮＡ提取及基因组序列的克隆
采集温室中生长健壮植株的漾濞大泡核桃嫩
叶ꎬ 采用改良的 ＣＴＡＢ 法[１７] 提取叶片基因组
ＤＮＡꎮ 以基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ 用扩增全长开放阅
读框(ＯＲＦ)的特异性引物进行基因组序列扩增ꎬ
扩增产物经 ＴＡ克隆ꎬ 转化至大肠杆菌 ＤＨ５α 感受
态细胞中ꎬ 然后挑选阳性克隆测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 全长 ＯＲＦ的克隆及生物信息学分析
使用在线分析软件 ＮＣＢＩ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.
ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / )中的“ｂｌ２ｓｅｑ”对 ３′￣ＲＡＣＥ 扩增序
列、 ５′￣ＲＡＣＥ 扩增序列与 ＰＲ１０ ＥＳＴ 序列进行拼
接ꎬ 并利用 ＮＣＢＩ中的“ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ”查找拼接得
到的全长 ｃＤＮＡ 序列中最大的开放阅读框ꎮ 根
据全长 ｃＤＮＡ 序列设计扩增全长 ＯＲＦ 的特异引
物并对全长 ＯＲＦ 进行 ＰＣＲ 扩增与 ＴＡ 克隆后送
上海生工进行测序ꎮ 扩增全长 ＯＲＦ 的上、下游
引物为: ５′￣ＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡ￣
３′ꎻ ５′￣ＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＧＧＴＣＧＣＡＧＡ￣３′ꎮ 使用在
线软件 ＮＣＢＩ的 ＢＬＡＳＴ 对得到的基因和蛋白质序
列的同源性进行分析ꎮ 多重序列比对和聚类分析用
ＭＥＧＡ３软件完成ꎮ ＰＲ１０ 信号肽序列预测用 Ｓｉｇ￣
ｎａｌＰ ４􀆰 １ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / Ｓｉｇ￣
ｎａｌＰ / )完成ꎮ 利用在线分析软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｗｗｗ.ａｕ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｔｐａｔａｍ. ｈｔｍｌ)
对 ＰＲ１０ 的理化性质进行预测ꎮ 借助 ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏ￣
ｔｅｉｎ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ􀆰 ｏｒｇ / )分析蛋白
质的二级结构并预测其亚细胞定位ꎮ 使用
ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｆｕｎｄｐ􀆰 ａｃ.ｂｅ / ｓｃｉｅｎｃｅｓ /
ｂｉｏｌｏｇｉｅ / ｕｒｂｍ / ｂｉｏｉｎｆｏ / ｅｓｙｐｒｅｄ / )分析蛋白质的三
维结构ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ６　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ
采用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析 ＰＲ１０ 基因在漾濞大泡核
桃经胶孢炭疽菌接种后以及 ＳＡ、 ＪＡ、 ＥＴ、 Ｈ２Ｏ２
四种信号分子处理后不同时间段的表达水平ꎮ 将从
３个单株上采集的同一时间段的叶片等量混合ꎬ 然
后提取总 ＲＮＡꎬ 经逆转录产生 ｃＤＮＡ 模板ꎻ 以漾
濞大泡核桃组蛋白 ３ 基因(ＪｓＨｉｓ３ꎬ ＫＪ１９６３８４)作
为内参基因ꎮ 漾濞大泡核桃 ＰＲ１０ 基因的特异引物
序列为: ５′￣ＡＡＧＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＡ￣３′ꎻ
５′￣ＴＣＡＴＧＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＴＣＴＴＣＧ￣３′ꎮ 内参基因
ＪｓＨｉｓ３ 的特异引物序列分别为: ５′￣ＧＡＴＣＧＣＡ￣
ＣＡＧＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣ￣３′ꎻ ５′￣ＣＧＴＣＣＧＴＧＡＡＡＴＴ￣
ＧＣＡＣＡＡＧＡ￣３′ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 反 应 条 件 为: ９５℃
２ ｍｉｎꎻ 以下反应 ４０ 个循环ꎬ ９５℃ １５ ｓꎬ ６０℃
１ ｍｉｎꎮ 每个 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 反应均设 ３ 次重复ꎬ 以正
常生长的漾濞大泡核桃叶片中 ＰＲ１０ 的表达量为对
照ꎬ 采用 ２－△△ＣＴ法计算 ＰＲ１０ 在其它样品中的相对
４１６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
表达量ꎮ 正常生长的漾濞大泡核桃叶片中 ＰＲ１０ 的
表达量与各处理后的叶片中 ＰＲ１０ 表达量之间采用
ｔ检验进行差异显著性分析ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１ 全长 ｃＤＮＡ 以及基
因组序列的克隆
　 　 根据转录组测序已得到的漾濞大泡核桃 ＰＲ１０
的 ＥＳＴ 序列(数据未发表)ꎬ 通过 ５′￣ＲＡＣＥ 及 ３′￣
ＲＡＣＥ扩增获得了 ＥＳＴ 的全长 ｃＤＮＡ 序列ꎮ ＲＡＣＥ
扩增结果显示(图 １: ａ)ꎬ ５′￣ＲＡＣＥ产物约 ４７４ ｂｐꎬ
３′￣ＲＡＣＥ产物约 ６０８ ｂｐꎮ 经过序列拼接获得该
ＰＲ１０的全长 ｃＤＮＡꎬ 序列长 ７７６ ｂｐꎬ 其中包括一
个 ４８３ ｂｐ 的 ＯＲＦ、 ７４ ｂｐ 的 ５′￣非翻译区 ( ｕｎ￣
ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎꎬ ＵＴＲ)以及 ２１９ ｂｐ 的 ３′￣ＵＴＲꎬ
ＯＲＦ编码一个含有 １６０ 个氨基酸的蛋白质ꎮ 根据
拼接后得到的全长 ｃＤＮＡ 序列设计特异引物ꎬ 成
功扩增出全长 ＯＲＦ以及基因组序列(图 １: ｂ)ꎬ 其
M 1 2 M 3 4
bp bp
750
500
750
500
a b
Ｍ: ＤＬ２０００标记ꎻ １: ５′ＲＡＣＥ 扩增产物ꎻ ２: ３′ＲＡＣＥ 扩增产物ꎻ
３: ＪｓＰＲ１０￣１基因组序列的扩增产物ꎻ ４: ＪｓＰＲ１０￣１基因全长 ＯＲＦ
的扩增产物ꎮ
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ５′ ＲＡＣＥꎻ
２: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ３′ＲＡＣＥꎻ ３: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ ４: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＯＲＦ.
图 １　 ＪｓＰＲ１０￣１基因的 ＲＡＣＥ扩增产物(ａ)、 全长
ＯＲＦ 以及基因组序列的扩增产物(ｂ)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＡＣＥｓ (ａ)ꎬ ｆｕｌｌ￣
ｌｅｎｇｔｈ ＯＲＦꎬ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１ (ｂ)
中基因组序列中存在 １ 个 １２４ ｂｐ 的内含子ꎬ 位于
编码精氨酸的 ＡＧＧ 密码子内ꎬ 属于 ＧＵ￣ＡＧ 型内
含子(图 ２)ꎮ 后续的生物信息学分析表明所克隆的
ｃＤＮＡ序列编码 ＰＲ１０蛋白ꎬ 因此将此基因命名为
ＪｓＰＲ１０￣１ꎬ ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＫＪ５９８７８７ꎮ
２􀆰 ２　 生物信息学分析
２􀆰 ２􀆰 １　 序列同源性分析、 多重序列比对及进化树
构建
　 　 ＢＬＡＳＴｎ分析结果显示ꎬ 漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１
GU
Intron (124 bp)
AG
AGG5UTR (74 bp) 3UTR (219 bp)
74 bp AUG
ORF (483 bp)
UAA
图 ２　 ＪｓＰＲ１０￣１的基因结构
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１
的第 ８２~２５９位核苷酸序列与桦树 ＰＲ￣１０￣０２ (Ｂｅ￣
ｔｕｌａ ｎｉｇｒａꎬ ＥＵ５２６１８８􀆰１)的第 １~１７８位核苷酸序列
具有 ８３％的相似性ꎮ 蛋白质同源性分析表明
ＪｓＰＲ１０￣１编码的蛋白质序列与栎树 Ｂｅｔ ｖ １过敏原
(Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｕｂｅｒꎬ ＡＦＦ５９６８９􀆰１)、 欧洲山毛榉 ＰＲ１
(Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａꎬ ＣＡＡ１０２３５􀆰１) 以及欧洲板栗
ｙｐｒ１０ (Ｃａｓｔａｎｅａ ｓａｔｉｖａꎬ ＣＡＤ１０３７４􀆰１)高度同源ꎬ
相似性分别为 ８３％、 ７９％和 ７７％ꎮ 将 ＪｓＰＲ１０￣１ 与
上述 ３ 个 ＰＲ１０ 蛋白以及苹果(Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ)
Ｍａｌ ｄ １ (ＣＡＡ９６５３５􀆰 １)进行多重序列比对ꎬ 结果
发现这 ５ 个 ＰＲ１０ 均有一个高度保守的 ＧＸＧＧＸＧ
(Ｘ 为任意氨基酸)基序ꎬ 称为 “Ｐ￣ｌｏｏｐ” (图 ３)ꎬ
另外ꎬ 还发现 Ｅ９７、 Ｅ１４９ 和 Ｙ１５１ 这 ３ 个保守的
氨基酸残基存在于每个 ＰＲ１０中(图 ３)ꎮ
聚类分析选取了来自不同物种的 １４ 个 ＰＲ１０
与漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１构建 ＰＲ１０系统进化树ꎮ
聚类结果显示(图 ４)ꎬ １５ 个 ＰＲ１０ 聚为 ２ 大支ꎮ
进化树下端的一支由单子叶植物麝香百合(Ｌｉｌｉｕｍ
ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ)、 芦笋(Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ)、 水稻
(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)和高粱(Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ)的 ＰＲ１０
组成ꎬ 其中水稻和高粱的 ＰＲ１０ 位于进化树的底
端ꎮ 双子叶植物欧洲山毛榉、 欧洲板栗、 栎树、 苹
果、 欧洲榛 (Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ)、 桦树、 羽扇豆、
紫花苜蓿 (Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ)、 黄果茄 (Ｓｏｌａｎｕｍ
ｓｕｒａｔｔｅｎｓｅ)、 辣椒的 ＰＲ１０ 与 ＪｓＰＲ１０￣１聚为另一
大支ꎮ 其中欧洲山毛榉、 欧洲板栗、 栎树以及漾濞
大泡核桃的 ＰＲ１０位于进化树的顶端ꎬ 再次证明它
们之间存在很高的同源性ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ２　 ＪｓＰＲ１０￣１ 编码蛋白质的理化性质预测、
信号肽及潜在修饰位点分析
　 　 ＪｓＰＲ１０￣１分子量约为 １７􀆰 ５３ ｋＤꎬ 等电点约为
５􀆰 ５１ꎮ该蛋白在酵母和大肠杆菌中的半衰期分别大
５１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 何 华等: 漾濞大泡核桃病程相关蛋白 １０基因 ＪｓＰＲ１０￣１的克隆与表达分析
80
80
80
80
80
160
160
160
160
159
Fagus sylvatica
Castanea sativa
Quercus suber
Juglans sigillata
Malus domestica
Fagus sylvatica
Castanea sativa
Quercus suber
Juglans sigillata
Malus domestica
P-loop motif
“Ｐ￣ｌｏｏｐ”基序用方框标识ꎬ ３个保守氨基酸用倒三角形标识ꎮ
Ｔｈｅ ‘Ｐ￣ｌｏｏｐ’ ｍｏｔｉｆ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ. Ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ＰＲ１０ｓ ａｒｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｒｉａｎｇｌｅꎬ ｒｅｓｐｅｃ￣
ｔｉｖｅｌｙ.
图 ３　 ＪｓＰＲ１０￣１与 ４种植物 ＰＲ１０的多重序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｐｌａｎｔ ＰＲ１０ｓ
100
54
100
100
99
94
85
94
49
48
32
48
0.1
Fagus sylvatica (CAA10235.1)
Castanea sativa (CAD10374.1)
Quercus suber (AFF59689.1)
Juglans sigillata (KJ598787)
Malus domestica (CAA96535.1)
Corylus avellana (CAA96549.1)
Betula pendula (CAA54484.1)
Lupinus luteus (CAA56298.1)
Medicago sativa (CAA67375.1)
Solanum virginianum (AAU00066.1)
Capsicum annuum (AAF63519.1)
Lilium longiflorum (AAD17336.1)
Asparagus officinalis (CAA44013.1)
Oryza sativa (AAL74406.1)
Sorghum bicolor (AAC12661.1)
ＪｓＰＲ１０￣１用方框标识ꎮ 括号内分别为各物种 ＰＲ１０的登录号ꎮ
ＪｓＰＲ１０￣１ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ. ＧｅｎＢａｎｋ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ＰＲ１０ｓ ａｒｅ ｇｉｖｅｎ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
图 ４　 ＪｓＰＲ１０￣１与其它物种 ＰＲ１０的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１ ａｎｄ ＰＲ１０ｓ
ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
于 ２０ ｈ和 １０ ｈꎬ 不稳定指数为 ２４􀆰 ７２ꎬ 小于阀值
４０ꎮ 另外ꎬ ＪｓＰＲ１０￣１脂肪族系数为 ８２􀆰 ３０ꎬ 总亲
水系数为 －０􀆰 ４０８ꎮ ＳｉｇｎａｌＰ ４􀆰 １ 分析结果显示ꎬ
ＪｓＰＲ１０￣１没有信号肽ꎬ 因此推测该蛋白不是分泌
蛋白ꎮ ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ 分析表明该蛋白没有 Ｎ 端分
泌信号以及核定位信号ꎬ 可能定位在细胞溶质中ꎮ
在 ＪｓＰＲ１０￣１中共发现了 ５种可能的翻译后修饰位
点: Ｎ￣糖基化位点(Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ ２ 个)、
ｃＡＭＰ￣ ａｎｄ ｃＧＭＰ￣依赖的蛋白激酶磷酸化位点
( ｃＡＭＰ￣ ａｎｄ ｃＧＭＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ １个)、 蛋白激酶 Ｃ磷酸化位
点(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ １ 个)、
６１６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ⅱ ｐｈｏｓ￣
ｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ ３个)和 Ｎ￣豆蔻酰化位点(Ｎ￣ｍｙ￣
ｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ ２个)ꎮ
２􀆰 ２􀆰 ３　 ＪｓＰＲ１０￣１编码蛋白质的二级结构及三维
结构预测
　 　 ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ 预测结果表明ꎬ ＰＲ１０ 蛋白中
α￣螺旋(Ｈ)、 β￣折叠(Ｅ)和无规则卷曲(Ｌ)所占百
分比分别为 ２３􀆰 ８７％、 ３６􀆰 ７７％和 ３９􀆰 ３５％ꎮ 其中
二级结构共包含 ２个可能的 α螺旋和 ７个可能的 β
折叠: α１ (１５ ~２８)、 α２ (１３１ ~１５４)、 β１ (４ ~
１２)、 β２ (４０~４６)、 β３ (５３~６０)、 β４ (６７~７５)、
β５ (８１ ~８８)、 β６ (９７ ~１０７)、 β７ (１１２ ~１２２)ꎮ
蛋白质的三级结构很大程度上决定了蛋白质的功
能ꎬ 为了探究漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１结构与功能
之间的关系ꎬ 以樱桃(Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ) 主要过敏原
ｐｒｕ ａｖ １ (１Ｅ０９􀆰 １)为模板构建了 ＪｓＰＲ１０￣１ 的三
维模型 (两者的蛋白质序列相似性为 ５３％)ꎮ 由
ＪｓＰＲ１０￣１的三级结构可知(图 ５)ꎬ 从 Ｃ 端开始以
一个长的 α 折叠连接 ７ 个反相平行的 β 折叠ꎬ 靠
近 Ｎ端的结构域为 ２ 个短的 α 螺旋ꎬ 它们通过无
规则卷曲连接在一起ꎮ 整个结构中心构成空穴ꎬ 该
空穴可能与黄酮类、 脂肪酸、 细胞分裂素等非极性
图 ５　 ＪｓＰＲ１０￣１的三维结构模型
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｐｕｔａｔｉｖｅ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１
配体的胞内运输有关[１８]ꎮ
２􀆰 ３　 ＪｓＰＲ１０￣１的表达特性分析
采用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 对漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１ 经
胶孢炭疽菌侵染后以及 ４种信号分子处理后表达量
的变化进行了比较分析ꎮ 结果显示(图 ６)ꎬ 接种胶
孢炭疽菌后ꎬ ＪｓＰＲ１０￣１ 的表达量迅速上升ꎬ 在接
种 ８ ｈ时表达量达到最大值ꎬ 约为对照的 ２􀆰 ５ 倍ꎻ
随后下降ꎬ 在接种 ４８ ｈ 时下降到最低值且明显低
于对照ꎬ 随后略微上升ꎮ 信号分子 ＪＡ、 ＳＡ、 ＥＴ
和 Ｈ２Ｏ２处理均不同程度诱导了 ＪｓＰＲ１０￣１的表达ꎬ
且表达量均在 ６ ｈ时达到最大值ꎮ 不同的是 ＳＡ和
**
**
**
**
**
**
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Control2 4 8 24 48 72
Js
PR
10
-1
Js
PR
10
-1
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#
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R
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e
ex
pr
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&()*+,-. ( )h
Hours post inoculation with C. gloeosporioides
****
**
**
0
2
4
6
8
10
12
14
Control 6 12 24 48
Js
PR
10
-1
Js
PR
10
-1
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Hours post treatment with JA
/0-. ( )
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*
0
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3
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5
6
7
8
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Control 6 12 24 48
Js
PR
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Js
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10
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Hours post treatment with H O
2 2
2 2
/0-. ( )
**
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*
0
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0.8
1
1.2
1.4
Control 6 12 24 48
Js
PR
10
-1
Js
PR
10
-1
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Hours post treatment with SA
/0-. ( )
**
**
**
**
0
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1
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2
2.5
3
3.5
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Control 6 12 24 48
R
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pr
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PR
10
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Js
PR
10
-1
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#
$
%
ET h
Hours post treatment with ET
/0-. ( )
∗ꎬ Ｐ < ０􀆰 ０５ꎻ ∗∗ꎬ Ｐ < ０􀆰 ０１ꎮ
图 ６　 胶孢炭疽菌侵染过程中及 ＳＡ、 ＪＡ、 ＥＴ、 Ｈ２Ｏ２处理后 ＪｓＰＲ１０￣１的表达水平
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＪｓＰＲ１０￣１ ｄｕｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ＳＡꎬ ＪＡꎬ ＥＴ ａｎｄ Ｈ２Ｏ２
７１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 何 华等: 漾濞大泡核桃病程相关蛋白 １０基因 ＪｓＰＲ１０￣１的克隆与表达分析
ＪＡ处理 ６~２４ ｈ 期间表达量持续下降ꎬ 直至处理
４８ ｈ 时才有小幅上升但仍低于对照ꎻ 而 ＥＴ 和
Ｈ２Ｏ２处理 ６ ~１２ ｈ 期间表达量急剧下降ꎬ 在处理
２４ ｈ 时才略微回升ꎬ 随后再次下降ꎮ 综上分析ꎬ
ＪｓＰＲ１０￣１的表达受胶孢炭疽菌和逆境胁迫相关信
号分子的诱导ꎬ 并且漾濞大泡核桃 ＪｓＰＲ１０￣１显然
参与了对胶孢炭疽菌的防卫反应ꎮ
３　 讨论
ＰＲ１０是广泛存在于高等植物体内的一类非常
重要的病程相关蛋白ꎬ 不仅参与植物对生物和非生
物胁迫的防卫反应ꎬ 在植物正常生长发育中也有一
定的功能ꎮ 漾濞大泡核桃是云南省重要的经济树
种ꎬ 并且对胶孢炭疽菌有较强的抗性ꎬ 为了研究漾
濞大泡核桃的抗性机理ꎬ 我们对其进行胶孢炭疽菌
侵染ꎬ 转录组测序结果显示 ＰＲ１０ ＥＳＴ的表达量明
显增加ꎮ 因此ꎬ 通过 ５′￣ＲＡＣＥ 和 ３′￣ＲＡＣＥ 克隆得
到了 ＰＲ１０ 基因 ＪｓＰＲ１０￣１ꎬ 该基因编码的氨基酸
序列与栎树、 欧洲山毛榉、 欧洲板栗的 ＰＲ１０ 高度
同源ꎮ ＪｓＰＲ１０￣１ 不存在 Ｎ 端信号肽序列ꎬ 并且
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ 分析也表明 ＪｓＰＲ１０￣１ 是定位于细
胞溶质中的非分泌蛋白ꎬ 这些特征与已知植物物种
的 ＰＲ１０高度一致ꎮ
植物 ＰＲ１０ 是低分子量的酸性蛋白ꎮ 棉花
(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ) ＧａＰＲ￣１０ 和辣椒 ＣａＰＲ￣
１０均编码含有 １５９ 个氨基酸的蛋白质ꎬ 等电点分
别为 ４􀆰 ９５ 和 ５􀆰 ２[３ꎬ７]ꎮ 本研究从漾濞大泡核桃中
分离出的 ＪｓＰＲ１０￣１基因编码含有 １６０个氨基酸的
蛋白质ꎬ 等电点约为 ５􀆰 ５１ꎬ 说明 ＪｓＰＲ１０￣１编码典
型的 ＰＲ１０ 蛋白ꎮ ＪｓＰＲ１０￣１ 与其它植物的 １４ 个
ＰＲ１０构建的进化树显示ꎬ 单子叶和双子叶植物分
别聚为 ２大支ꎬ 可见单子叶和双子叶植物的 ＰＲ１０
能部分揭示单子叶物种和双子叶物种间的差异ꎮ 另
外ꎬ ＪｓＰＲ１０￣１序列中存在保守基序“Ｐ￣ｌｏｏｐ”ꎬ 该
基序广泛存在于核酸结合蛋白中ꎬ 并且参与 ＡＴＰ
和 ＧＴＰ的结合ꎬ 可能与维持 ＰＲ１０ 的核糖核酸酶
活性有关[１９]ꎮ Ｗｕ 等[１９]研究发现定点突变甘薯
(Ｐａｃｈｙｒｒｈｉｚｕｓ ｅｒｏｓｕｓ) ＰＲ１０ 蛋白 ＳＰＥ￣１６ 序列中
的 Ｇｌｕ９５、 Ｇｌｕ１４７和 Ｔｙｒ１４９ 三个保守氨基酸ꎬ 导
致其核糖核酸酶活性丧失ꎮ 本研究 ＪｓＰＲ１０￣１序列
中存在“Ｐ￣ｌｏｏｐ”以及 Ｅ９７、 Ｅ１４９ 和 Ｙ１５１ 三个保
守的氨基酸ꎬ 暗示 ＪｓＰＲ１０￣１可能具有核糖核酸酶
活性ꎮ
在病原菌的侵染过程中ꎬ 植物参与胁迫应答的
基因会大量诱导表达ꎬ ＰＲ１０ 的表达与积累是植物
响应生物胁迫的重要途径之一ꎮ 葡萄(Ｖ. ｐｓｅｕｄｏ￣
ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ)受病原菌(Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ)
侵染后ꎬ ＶｐＰＲ１０􀆰 ２ 的表达量显著提高[２０]ꎮ 花生
(Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ) ＡｈＰＲ１０ 基因通过原核表达
的融合蛋白抑制 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ和 Ｒｈｉｚｏｃｔｏ￣
ｎｉａ ｓｏｌａｎｉ的生长[２１]ꎮ 黄果茄 ＳｓＰＲ１０ 在体外对稻
瘟病有显著的抑制作用[１２]ꎮ 本研究 ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果
显示ꎬ 胶孢炭疽菌接种到漾濞大泡核桃叶片后ꎬ
ＪｓＰＲ１０￣１表达量迅速上升ꎬ 并且在接种 ８ ｈ 时表
达水平增加至对照的 ２􀆰 ５倍ꎬ 说明 ＪｓＰＲ１０￣１参与
漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的应答反应ꎮ 此外ꎬ 信
号分子 ＳＡ、 ＪＡ、 Ｈ２ Ｏ２ 和 ＥＴ 处理可显著提高
ＪｓＰＲ１０￣１的转录水平ꎬ 暗示 ＪｓＰＲ１０￣１ 可能通过
这些信号通路介导漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌或其
它逆境胁迫的抗性ꎮ
ＰＲ１０ 作为一类病程相关蛋白ꎬ 响应生物与
非生物胁迫ꎬ 是植物防御系统的重要组成部分ꎬ
并且有些 ＰＲ１０ 蛋白已证实具有核糖核酸酶活性
与抗菌活性[３ꎬ７ꎬ１２ꎬ２１] ꎮ 本研究结果表明漾濞大泡
核桃 ＪｓＰＲ１０￣１ 参与对胶孢炭疽菌的防卫反应ꎬ
因此下一步有必要对其生物学活性及其功能进行
深入分析ꎮ 目前我们已经构建了 ＪｓＰＲ１０￣１超表达
载体ꎬ 下一步以期得到 ＪｓＰＲ１０￣１的转基因烟草及
ＪｓＰＲ１０￣１功能的初步信息ꎮ
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ｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ＰＲ￣１０￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｗｈｉｔｅ
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ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ
ｖｉｎｉｆｅｒａ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ.
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ｔｉｍｅ ｐｉｎｅ ( Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａｓｔｅｒ Ａｉｔ.) ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ [ Ｊ] . Ｊ
Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００１ꎬ ５２(３５８): １１４３－１１４４.
[ ９ ] 　 Ｗａｌｔｅｒ ＭＨꎬ Ｌｉｕ ＪＷꎬ Ｗüｎｎ Ｊꎬ Ｈｅｓｓ Ｄ. Ｂｅａｎ ｒｉｂｏ￣
ｎｕｃｌｅａｓｅ￣ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ
(Ｙｐｒ１０) ｄｉｓｐｌａｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ￣
ｔａｌꎬ ｄａｒｋ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ￣ｓｔｉｍｕｌｕｓ￣ｄｅ￣
ｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ [ Ｊ] . Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ １９９６ꎬ
２３９(２): ２８１－２９３.
[１０] 　 Ｐｉｎｔｏ ＭＰꎬ Ｒｉｃａｒｄｏ ＣＰ. Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ. ｐａｔｈｏｇｅ￣
ｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｓｈｏｗ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ＰＲ￣１０
ｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ １９９５ꎬ １０９(４): １３４５－
１３５１.
[１１] 　 Ｌｉｕ ＪＪꎬ Ｅｋｒａｍｏｄｄｏｕｌｌａｈ ＡＫꎬ Ｙｕ ＸＳ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＲ１０ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｗｅｓｔｅｒｎ ｗｈｉｔｅ
ｐｉｎｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｗｏｕｎｄｉｎｇꎬ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｄ
ｈａｒｄｅｎｉｎｇ[Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍꎬ ２００３ꎬ １１９(４):
５４４－５５３.
[１２] 　 Ｌｉｕ ＸＪꎬ Ｈｕａｎｇ ＢＢꎬ Ｌｉｎ Ｊꎬ Ｆｅｉ Ｊꎬ Ｃｈｅｎ ＺＨꎬ Ｐａｎｇ
ＹＺꎬ Ｓｕｎ ＸＦꎬ Ｔａｎｇ ＫＸ. Ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔ￣
ｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ( ＳｓＰＲ１０ ) ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｕｒａｔｔｅｎｓｅ
ｗｉｔｈ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ
ｓｔｒｅｓｓ￣ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ [ Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ￣
ｓｉｏｌꎬ ２００６ꎬ １６３(５): ５４６－５５６.
[１３] 　 王勇ꎬ 樊爱斌ꎬ 李鲲鹏ꎬ 郭永亮. 早实核桃炭疽病的
发生及防治试验[ Ｊ] . 山西果树ꎬ ２００５ꎬ １０５(３):
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胶孢炭疽病菌对不同核桃品种的致病性测定[Ｊ] . 中
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[１５] 　 杨恩ꎬ 陈少瑜ꎬ 张雨ꎬ 范志远ꎬ 习学良. 漾濞核桃叶
片基因组 ＤＮＡ的两种提取法方法效果比较[Ｊ] . 西
部林业科学ꎬ ２００６ꎬ ３４(４): ７２－７５.
[１６] 　 Ｌｉｕ Ｄꎬ Ｚｈａｎｇ Ｘꎬ Ｔｕ Ｌꎬ Ｚｈｕ Ｌꎬ Ｇｕｏ Ｘ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ￣ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ
ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ｆｉｂｅｒ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ [ Ｊ ] . Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
(Ｍｏｓｋ)ꎬ ２００６ꎬ ４０(５): ８２５－８３４.
[１７] 　 周阿涛ꎬ 岳亮亮ꎬ 李旻ꎬ 刘迪秋ꎬ 丁元明. 云南山茶
(Ｃａｍｅｌｌｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ) ｎｒＤＮＡ ＩＴＳ 序列多态性分析
[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１３ꎬ ３１(１): １－１０.
[１８] 　 Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ ＫＭꎬ Ｓｏｉｎｉｎｅｎ Ｐꎬ Ｖａｎäｌäｉｎｅｎ ＴＡꎬ
Ｈäｙｒｉｎｅｎ Ｊꎬ Ｌａａｔｉｋａｉｎｅｎ Ｒꎬ Ｐｅｒäｋｙｌä Ｍꎬ Ｔｅｒｖａｈａｕ￣
ｔａ ＡＩꎬ Ｋäｒｅｎｌａｍｐｉ ＳＯ. Ｂｉｒｃｈ ＰＲ￣１０ｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ
ｓｅｖｅｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｌｉｇａｎｄｓ [ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏ￣
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２００５ꎬ ６６(２１): ２５２４－２５３３.
[１９] 　 Ｗｕ Ｆꎬ Ｙａｎ Ｍꎬ Ｌｉ ＹＫꎬ Ｃｈａｎｇ ＳＪꎬ Ｓｏｎｇ ＸＭꎬ Ｚｈｏｕ
ＺＣꎬ Ｇｏｎｇ ＷＭ. ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ａｎｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ＰＲ￣１０ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰＥ￣１６ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｐａｃｈｙｒｒｈｉｚｕｓ ｅｒｏｓｕｓ [ Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏ￣
ｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎꎬ ２００３ꎬ ３１２(３): ７６１－７６６.
[２０] 　 Ｈｅ ＭＹꎬ Ｘｕ Ｙꎬ Ｃａｏ ＪＬꎬ Ｚｈｕ ＺＧꎬ Ｊｉａｏ ＹＴꎬ Ｗａｎｇ
ＹＪꎬ Ｇｕａｎ Ｘꎬ Ｙａｎｇ ＹＺꎬ Ｘｕ ＷＲꎬ Ｆｕ ＺＦ. Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ＰＲ１０ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｔｉｓ ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ [ Ｊ ] . Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａꎬ
２０１３ꎬ ２５０(１): １２９－１４０.
[２１] 　 Ｃｈａｄｈａ Ｐꎬ Ｄａｓ ＲＨ. Ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎꎬ ＡｈＰＲ１０ ｆｒｏｍ ｐｅａｎｕｔ: ａｎ ｉｎｓｉｇｈｔ ｏｆ ｉｔｓ ｍｏｄｅ
ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ ２００６ꎬ ２２５(１):
２１３－２２２.
(责任编辑: 张 平)
９１６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 何 华等: 漾濞大泡核桃病程相关蛋白 １０基因 ＪｓＰＲ１０￣１的克隆与表达分析