全 文 ：华北农学报·2016，31(3):155 -162
收稿日期:2016 － 03 － 11
基金项目:科技部支撑计划项目(2011BAD46B00)
作者简介:王国东(1993 －)，男，云南普洱人，主要从事生物工程研究。
通讯作者:刘迪秋(1979 －)，女，湖北建始人，教授，博士，主要从事植物抗病基因工程研究。
漾濞大泡核桃 JsWＲKY1 过表达增强转基因烟草
对胶孢炭疽菌的抗性
王国东，陈朝银，李金晶，普丽梅，关瑞攀，葛 锋，刘迪秋
(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)
摘要:为进一步研究 JsWＲKY1 的生物学功能，构建 JsWＲKY1 的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的
JsWＲKY1 转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。JsWＲKY1 过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基
因 MnSOD、Cu /ZnSOD、CN、NADPH oxidase和 PＲ1 的转录水平。与野生型烟草相比，JsWＲKY1 转基因烟草体内的超氧
化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验
结果显示，JsWＲKY1 转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝
生长具有不同程度的抑制作用。此外，用胶孢炭疽菌接种烟草叶片，转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性明显增强。显
然，JsWＲKY1 是漾濞大泡核桃中正调控病害防卫反应的转录因子。
关键词:漾濞大泡核桃;WＲKY转录因子;防卫相关基因;抗氧化酶类;胶孢炭疽菌
中图分类号:Q78;S436． 62 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2016)03 － 0155 － 08
doi:10． 7668 /hbnxb． 2016． 03． 023
Overexpression of a WＲKY Transcription Factor Gene from Juglans sigillata Dode
Confers Ｒesistance to Colletotrichum gloeosporioides in Transgenic Tobacco Plants
WANG Guodong，CHEN Chaoyin，LI Jinjing，PU Limei，GUAN Ｒuipan，GE Feng，LIU Diqiu
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)
Abstract:To investigate the function of JsWＲKY1，a constitutive expression vector of JsWＲKY1 was constructed
and transferred into Nicotiana tabacum L． cv Xanthi． There were no visible differences between the positive trans-
genic plants and WT． The expression levels of several defense-related genes MnSOD，Cu /ZnSOD，CN，NADPH oxi-
dase，and PＲ1 resistance gene were up-regulated in the transgenic tobacco lines，and the SOD，APX and POD
showed significantly higher activities in the transgenic lines than in wild type under normal conditions or after inocu-
lation with C． gloeosporioides． The crude protein extract of transgenic tobacco lines inhibited the hyphal growth of the
following four fungi，Botrosphaeria dothidea，Gibberella moniliformis，C． gloeosporioides and Fusarium oxysporum at
different degrees． The antifungal activity in vitro plates demonstrated that the activities of SOD in the transgenic to-
bacco lines were significantly higher than those in WT． Moreover，the transgenic tobacco plants showed strong resist-
ance after inoculation with C． gloeosporioides in the leaves． In conclusion，the JsWＲKY1 is a positive transcription
factor of J． sigiuata regulating the defense response to pathogens．
Key words:Juglans sigillata dode;WＲKY transcription factor;Defense-related genes;Antioxidant enzyme;
Colletotrichum gloeosporioides
WＲKY转录因子是植物特有的转录因子超家
族，主要参与植物体内的转录调控及信号转导过
程［1］。WＲKY转录因子通过调控植物体内抗病相
关基因的表达提高植物体的抗性。WＲKY 转录因
子中包含一个或更多高度保守的 WＲKY 结构域，
WＲKY结构域由大约 60 个氨基酸残基组成，其中
156 华 北 农 学 报 31 卷
在 N 末 端 有 高 度 保 守 的 7 个 氨 基 酸 残 基
WＲKYGQK。多数 WＲKY转录因子的 DNA 结合域
中还含有一个锌指结构，C2H2 型(C-X4-5-C-X22-
23-H-X1-H)或 C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)锌指
结构［2］。根据 WＲKY 结构域的数量及所含锌指结
构的特征可以将 WＲKY转录因子分为三大类，第Ⅰ
类含有 2 个 WＲKY 结构域以及 C2H2 型锌指结构，
第Ⅱ类含有 1 个 WＲKY 结构域和 C2H2 型锌指结
构，第Ⅲ类也含有 1 个 WＲKY 结构域和一个 C2HC
型锌指结构［2］。
WＲKY基因最早于 1994 年从甘薯(Impoea bata-
tas)中分离出来［3］。至今为止，已经在很多种植物
中发现了 WＲKY 基因的存在。WＲKY 转录因子是
植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防
卫反应中起重要作用。水稻(Oryza sativa)Os-
WＲKY13 的超表达无论在苗期还是成株期都增强了
转基因植株对白叶枯病(Xanthomonas campestris pv．
Oryzae)和稻瘟病(Magnaporthe oryzae)的抗性［4］。
OsWＲKY22 缺失的水稻突变体对稻瘟病的敏感性增
强，而超表达 OsWＲKY22 则可以提高转基因水稻对
稻瘟病的抗性［5］。在水稻中过表达 OsWＲKY53 也增
强了对稻瘟病的抗性［6］。在拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中过表达 AtWＲKY28 增强对甘蓝链格孢菌
(Alternaria brassicicola)的 抗 性［7］。过 表 达 Pt-
WＲKY23 的转基因杨树(Populus tremula)对 Melamp-
sora spp． 的抵抗能力显著增加［8］。PtWＲKY14 超表
达则可增强烟草(Nicotiana tabacum)对 TMV侵染的
抵抗能力［9］。研究表明，一些 WＲKY转录因子负调
控植物对生物和非生物胁迫有防卫反应。拟南芥
AtWＲKY38 和 AtWＲKY62 与组蛋白去乙酰化酶 19 共
同作用负调控拟南芥的基本防御［10］。
核桃(Juglans)是世界重要的坚果类果树和木
本油料树种，我国核桃栽培历史已有 2 000 多年，现
出口量居世界第 2 位。漾濞大泡核桃(J． sigillata
Dode)，原产云南省漾濞县，现广泛分布于云南 10
余个县，以及贵州、四川等省份的部分地区，为云南
的早期无性优良品种。漾濞大泡核桃具有果大、壳
薄、仁厚、味香、含油率高等优点，是云南省重要的经
济林树种之一，对云南的核桃产业发展起着重要的
作用［11］。然而，随着核桃产业的快速发展，病虫害
问题日益凸显，尤其是真菌病害。常见的核桃病害
主要有灰斑病、黑斑病、炭疽病等。前期研究中，从
漾濞大泡核桃中克隆获得一个Ⅱc 类 WＲKY 基因
JsWＲKY1，水杨酸、茉莉酸、H2O2 和乙烯等几种逆境
胁迫相关信号分子处理均上调 JsWＲKY1 在漾濞大
泡核桃叶片中的表达量，同时 JsWＲKY1 快速响应胶
孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的侵染，胶
孢炭疽菌接种后 4 h，转录物在叶片中大量富集［12］。
为进一步研究 JsWＲKY1 的生物学功能，构建了
JsWＲKY1 的植物超表达载体将其转入烟草中超表
达，并对转基因烟草中几个防卫相关基因的表达以
及抗氧化酶活性进行分析，还检测了 JsWＲKY1 转基
因烟草在体外对几种病原真菌的抗性，尤其是
JsWＲKY1 转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
遗传转化所用无菌烟草苗由生物资源开发与利
用实验室培养。将烟草(N． tabacum L． cv Xanthi)种
子表面消毒后播种于 1 /2 MS培养基上，萌发的幼苗
继代培养 8 周后用于转基因。所用病原真菌葡萄座
腔菌(Botrosphaeria dothidea)、串珠状赤霉菌(Gibber-
ella moniliformis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeos-
porioides)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)均由
本实验室分离鉴定并保存，使用前接种于 PDA培养
基上进行活化。
1． 2 JsWＲKY1 植物超表达载体构建
本试验采用 pCAMBIA2300S 作为植物超表达
载体，其 T-DNA 区含有 2 个花椰菜花叶病毒
(CaMV)的 35S 启动子，并具有卡那霉素抗性基因
NPTⅡ。在扩增 JsWＲKY1 OＲF 的特异引物的 5端
分别添加限制性内切酶 EcoＲ Ⅰ和 BamH Ⅰ的识别
位点，并合成特异性引物 5-GGATCCTGTAAAAC
CTATTCGGACATTCTTC-3 和 5-GAATTCACCGAG
GAGGGAGGCAGGT-3扩增 JsWＲKY1 的 OＲF。扩增
产物首先连接到 pMD-18T载体(TaKaＲa，Japan)中。
重组载体 pMD-18T-JsWＲKY1 经限制性内切酶
BamHⅠ和 EcoＲ Ⅰ双酶切后获得 JsWＲKY1 的 OＲF，
并与用同样的限制性内切酶消化后的 pCAM-
BIA2300S空载体进行连接。将连接产物 pCAM-
BIA2300S-JsWＲKY1 (图 1)转入大肠杆菌(Escherich-
ia coli)DH5α 菌株中，并通过 PCＲ 筛选获得阳性
克隆。
1． 3 烟草遗传转化
采用 冻 融 法 将 重 组 载 体 pCAMBIA2300S-
JsWＲKY1 转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)LBA4404 菌株中，通过 PCＲ 筛选阳性克隆。
用含重组载体 pCAMBIA2300S-JsWＲKY1 的农杆菌
LBA4404 菌液浸染烟草无菌苗的叶盘。在无菌条
件下将幼嫩的烟草叶片剪成约 1 cm2 的叶盘，将叶
3 期 王国东等:漾濞大泡核桃 JsWＲKY1 过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性 157
盘浸入农杆菌菌液中，浸染 15 min 后用无菌滤纸将
叶盘表面的菌液吸干，把叶盘平铺于共培养培养基
上，22 ℃暗培养 48 h。暗培养结束后，将叶盘转至烟
草筛选培养基上并放入光照培养箱中培养(25 ℃，
光照16 h /d)。分化再生的幼苗转入含有 50 mg /L
卡那霉素和 100 mg /L 头孢霉素的烟草生根培养基
上培养。
JsWＲKY1 受 CaMV 35S启动子调控并与
卡那霉素抗性基因 NPTⅡ相连。
The JsWＲKY1 gene was under control of the CaMV 35S promoter
and linked to the kanamycin resistance gene NPTⅡ ．
图 1 JsWＲKY1 基因表达框
Fig． 1 The expression cassette of JsWＲKY1
1． 4 阳性转基因烟草筛选
采用 CTAB 法提取再生烟草植株的基因组
DNA，取 1 μL 所提取的基因组 DNA 进行琼脂糖凝
胶电泳检测其完整性并测其浓度。并以再生烟草植
株的基因组 DNA为模板用 JsWＲKY1 的特异引物进
行 PCＲ反应。分别以 pMD-18T-JsWＲKY1 质粒和野
生型烟草(Wild type，WT)的基因组 DNA 为阳性对
照和阴性对照。PCＲ 反应结束后，取 8 μL PCＲ 产
物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并挑选阳性转基因烟
草植株。T0 阳性转基因烟草于温室中培养，获得
T1 转基因烟草。
1． 5 烟草叶片 ＲNA 提取及 qＲT-PCＲ(Quantita-
tive reverse transcription-PCＲ)
采用异硫氰酸胍一步法提取 T1 转基因烟草叶
片的总 ＲNA，并采用 GoScriptTM Ｒeverse试剂盒(Pro-
mega)将总 ＲNA逆转录成第一链 cDNA。接着采用
Ｒeal-time PCＲ分析 JsWＲKY1 在 T1 烟草叶片中的表
达水平。此外，还通过 qＲT-PCＲ分析 7 个防卫相关
基因 (MnSOD、CN、NADPH oxidase、Cu /ZnSOD、
MYC、PＲ1 和 Osmotin)在 T1 转基因烟草植株和 WT
烟草叶片中的转录水平。反应条件为:50 ℃ 2 min，
95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环，之
后进行熔解曲线分析。以烟草 Actin 基因作为内参
基因，qＲT-PCＲ 中每个反应均设置 3 次重复，并采
用 2 － ΔΔCT法计算得出相对表达水平。基因的引物序
列见表 1。
1． 6 酶活性测定
取正常生长及胶孢炭疽菌接种后 10 d 的烟草
叶片，提取粗酶液，酶液中的蛋白含量测定采用考马
斯亮蓝法。烟草叶片内超氧化物歧化酶(Superoxide
dismutase，SOD)活性测定参照 Gay 和 Tuzun［13］的方
法。试管中依次加入 50 mmol /L PBS (pH值 7． 8)
表 1 qＲT-PCＲ所用引物序列
Tab． 1 The primer sequences used in qＲT-PCＲ
基因
Target genes
引物序列
Primer sequences
JsWＲKY1 5-CAAGGTAAGATCAAGAAGATCAGGA-3
(KJ170895) 5-CTACGATGCTACGATGCCTTCATCTTTGGTTAG-3
CN 5-TGGGATTTGCTGTATGTTACTCTCG-3
(EF091690． 1) 5-TCTGGTCCTTGTTTATACAACAAACG-3
Osmotin 5-CGACTATCGAGGTCCGAAACAAC-3
(M29279． 1) 5-ACGTACCCCTACCAGCAGCATT-3
MYC 5-GGAACAATCGAGTTTACAGAGATCAA-3
(EU123519． 1) 5-CAGCAAGTTGATTAAGAAACCTAGC-3
NADPH oxidase 5-GTCTACACTCTGTTCATTGTGCATG-3
(AJ309006． 1) 5-GCTTGACCTGAATGCCCTAATCA-3
PＲ1 5-GACTATTTGGATGCCCATAACACAG-3
(X05453． 1) 5-TATAGTGTCCACACACCTGTCCTTG-3
Cu /ZnSOD 5’-CATGGTGCTCCTGAAGATGAGGT-3’
(EU123521． 1) 5-CAGCATTTCCAGTAGCTTTACTGAG-3
MnSOD 5-GTGTGGCTTGGTGTGGACAAAG-3
(X14482． 1) 5-CCTCAAAACAACATCAAATATCCCTG-3
Actin 5-TCCCATTGAGCATGGAATAGTAAGC-3
(AB158612． 1) 5-TACATGGCAGGTACATTGAAAGTCT-3
0． 8 mL、26 mmol /L L-蛋氨酸(L-methionine)1． 5 mL、
0． 75 mmoL /L 四唑氮蓝(NBT)0． 3 mL、粗酶液
0． 1 mL，20 μmol /L 核黄素(Ｒiboflavin)0． 3 mL，充
分摇匀，以 25 ℃暗反应作为空白对照，在 25 ℃、光
强为 45 000 lux的培养箱内光照 15 min后迅速取出
在 560 nm波长下测定 OD值，以抑制 NBT光化还原
的 50% 为 1 个酶活单位。抗坏血酸过氧化物酶
(Ascorbateperoxidase，APX)活性的测定参照 Nakano
和 Asada［14］的方法。取 1． 5 mL 50 mmol /L (pH 值
7． 0)磷酸钠缓冲液加入 50 μL粗酶液，混匀，作为控
制参照。最后在其他比色皿中加入 1． 5 mL
50 mmol /L 反应液，并加入 100 μL 1 mmol /L H2O2
启动反应，在 290 nm处每 20 s测定一次 OD值。过
氧化物酶(Peroxidase，POD)酶活测定采用愈创木酚
法［15］，取试管加入 3 mL 反应液以及 30 μL 酶液，以
PBS为对照调零，在波长为 470 nm处每隔 40 s 测一
次 OD值。以每 1 min OD值变化 0． 01 为 1 个酶活
单位(U)。
1． 7 转基因烟草粗蛋白的体外平板抑菌试验
参照 Li 等［16］的方法提取 4 个 T1 转基因烟草
和WT植株叶片的总蛋白。几种供试病原真菌活化
培养后取适量菌丝接种于新鲜的 PDA 固体培养基
上，待真菌菌落直径生长至大约 2 ～ 3 cm时，在菌落
周围均匀放置直径约为 0． 8 mm 的无菌滤纸片，并
将所提取的烟草粗蛋白浓度分别稀释到 5 mg /mL，
分别取 20 μL蛋白溶液滴到滤纸片上，以蛋白提取
缓冲液为空白对照。置于 28 ℃培养箱培养 3 ～ 5 d，
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培养期间观察转基因及野生型烟草叶片总蛋白对几
种真菌生长的抑制情况。
1． 8 转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性分析
将胶孢炭疽菌接种在 PDA 培养基上，置于
28 ℃培养 5 ～ 7 d，用无菌水洗脱分生孢子，并制成
孢子悬液。以温室栽培的 JsWＲKY1 转基因烟草和
野生型烟草为试材，用砂纸在叶片上轻轻摩擦出同
等规格的伤口，接上 200 μL 的孢子悬液，然后用保
鲜膜包裹叶片保持湿度。10 d 后，收集接种叶片，
观察 JsWＲKY1 转基因烟草叶片和野生型烟草叶片
受胶孢炭疽菌侵染的发病情况。
2 结果与分析
2． 1 JsWＲKY1 转基因烟草产生与筛选
在前期研究中，基于转录组测序结果从漾濞大
泡核桃中分离克隆了一个 WＲKY 转录因子基因
JsWＲKY1，本试验成功构建了 JsWＲKY1 的植物表达
载体 pCAMBIA2300S-JsWＲKY1，并采用冻融法转入
根癌农杆菌 LBA4404 中。利用携带有 JsWＲKY1 表
达框的根癌农杆菌 LBA4404 分 12 次浸染 200 多个
烟草叶盘。挑选生长良好的具有卡那霉素抗性的转
基因烟草再生植株 49 株，经 PCＲ 分析检测获得具
有目的基因 JsWＲKY1 的阳性转基因烟草 35 株，即
为 JsWＲKY1 的 T0 转基因烟草，部分烟草转基因植
株的 PCＲ检测结果如图 2 所示。将 JsWＲKY1 的 T0
转基因烟草种于温室中培养并获得 T1 植株。
JsWＲKY1 超表达的阳性转基因烟草植株与 WT烟草
的生长发育及形态未发现明显的差异。随后，随机
选取 8 个转基因株系 W8、W11、W14、W15、W17、
W18、W33 和 W43 进行基因表达分析。
1． DNA Marker DL2000;2 ～ 19． JsWＲKY1 转基因烟草单株;20．野生型烟草;21．阳性对照(pCAMBIA2300S-JsWＲKY1 质粒)。
1． DNA Marker DL2000;2 － 19． JsWＲKY1 transgenic tobacco plantlets;20． WT;21． Positive control (pCAMBIA2300S-JsWＲKY1 plasmid)．
图 2 转基因烟草的 PCＲ检测
Fig． 2 PCＲ analysis of some JsWＲKY1 transgenic tobacco plantlets with resistance to Kanamycin
2． 2 JsWＲKY1 在 T1 转基因烟草中大量表达
利用 qＲT-PCＲ 检测 8 个转基因烟草株系中
JsWＲKY1 的表达水平，试验结果表明，JsWＲKY1 在 8
个阳性转基因烟草株系中均检测到 JsWＲKY1 转录
物的积累，而在 WT 中未检测出 JsWＲKY1 (图 3)。
就相对表达水平而言，JsWＲKY1 在 W43 株系中的表
达量最高，在 W15 株系中的表达量最低，在 W17 和
W18 株系中也大量表达。可见受 CaMV 35S 启动子
控制的 JsWＲKY1 基因在 T1 转基因烟草中稳定表
达。挑选 JsWＲKY1 表达水平相对较高的 4 个转基
因株系 W8、W17、W18、W43 进行后续试验。
2． 3 几个防卫相关基因在 JsWＲKY1 转基因烟草
中的表达
利用 qＲT-PCＲ 分析 7 个抗逆相关基因(Mn-
SOD、CN、Cu /ZnSOD、NADPH oxidase、MYC、PＲ1 和
Osmotin)在 JsWＲKY1 转基因烟草中表达水平的变
化，试验如图 4 所示。与野生型烟草(WT)相比，Os-
motin在 4 个 JsWＲKY1 转基因烟草株系中的表达量
明显降低。然而其他 6 个基因在 JsWＲKY1 转基因
烟草中的表达水平均表现出不同程度地上调。而
WT．野生型烟草;W8、W11、W14、W15、W17、W18、
W33、W43． JsWＲKY1 转基因 T1 烟草株系。
WT． Wild-type;W8，W11，W14，W15，W17，W18，W33，
W43． Different transgenic T1 tobacco lines．
图 3 JsWＲKY1 在转基因 T1 植株中的表达水平分析
Fig． 3 qＲT-PCＲ analysis for JsWＲKY1 expression
levels in several transgenic T1 tobacco lines
且，不同转基因烟草株系中同一个基因的表达水平
也不尽相同。MYC 和 Cu /ZnSOD 在各转基因烟草
株系中表达水平的上调幅度较为一致，分别约为
WT的 3． 5 ～ 4． 5，11． 0 ～ 13． 5 倍;另外 4 个抗逆相关
基因在几个 JsWＲKY1 转基因烟草株系中表达水平
差异较大，尤其是 PＲ1，PＲ1 在转基因烟草株系W17
中的表达水平约为 WT的 10． 3 倍，而在转基因烟草
株系 W18 中的表达水平约为 WT 的 86． 5 倍。上述
3 期 王国东等:漾濞大泡核桃 JsWＲKY1 过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性 159
结果表明，JsWＲKY1 在转基因烟草中的过量表达提
高了 MnSOD、CN、NADPH oxidasec、Cu /ZnSOD、MYC
和 PＲ1 等防卫相关基因的转录水平。
WT．野生型烟草;W8、W17、W18、W43． JsWＲKY1 转基因 T1 烟草株系。
WT． Wild-type;W8，W17，W18，W43． JsWＲKY1 transgenic T1 tobacco lines．
图 4 几个抗病相关基因在 JsWＲKY1 转基因烟草中的表达水平分析
Fig． 4 qＲT-PCＲ analysis of several disease resistance-related genes in the JsWＲKY1 transgenic tobacco lines
2． 4 JsWＲKY1 过表达增强转基因烟草中 3 种抗氧
化酶的酶活性
活性氧(Ｒeactive oxygen species，ＲOS)是细胞正
常氧代谢的副产物，并在细胞信号传递和保护机体
方面起到重要作用，但是在遭受逆境胁迫后，植物细
胞中会积累大量 ＲOS。当 ＲOS 的积累量超出活性
氧清除系统的能力时，植物体内蛋白质、膜脂以及其
他细胞组分受到氧化损伤，从而使植物产生各种不
良的生理反应，严重者甚至会造成植株死亡。细胞
表达的 POD、SOD 和 APX 等抗氧化酶类，他们协同
作用可以将植物体内的活性氧维持在稳定水平，从
而保证植物的正常生长代谢。为了研究转基因株系
中 JsWＲKY1 是否调控这些抗氧化酶的活性，笔者测
定了转基因株系 W8、W17、W18、W43 和 WT烟草中
的 POD、SOD 和 APX 酶活(图 5)。正常生长情况
下，与野生型烟草相比，几个 JsWＲKY1 转基因烟草
株系中 POD、SOD、APX 显著提高，尤其是 POD，在
所有供试 JsWＲKY1 转基因烟草株系中均极显著上
调。接种胶孢炭疽菌后，转基因烟草及野生型烟草
中 POD、SOD、APX 均明显增强，但所有转基因株系
中 3 种抗氧化酶的活力远高于野生型烟草。上述结
果无疑表明，POD、SOD 和 APX 活性在转基因烟草
株系中的显著增强与 JsWＲKY1 的超表达紧密相关。
2． 5 JsWＲKY1 转基因烟草叶片总蛋白在体外抑菌
活性
提取 4 个 JsWＲKY1 T1 转基因烟草叶片及 WT
烟草叶片的总蛋白进行体外平板抑菌试验，结果如
图 6 所示，蛋白提取缓冲液(空白对照)对病原真菌
葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀
菌的生长没有抑制作用。WT 烟草的叶片总蛋白对
4种病原真菌的菌丝生长具有较弱的抑制作用。尽
管各个株系对不同病原菌的抑菌作用不尽相同，但是
4个 JsWＲKY1转基因烟草叶片总蛋白对这 4 种病原
真菌菌丝的生长均表现出明显的抑制活性。
160 华 北 农 学 报 31 卷
WT．野生型烟草;W8、W17、W18、W43． JsWＲKY1 转基因烟草株系。* 、＊＊分别表示 P ＜ 0． 05 水平以及 P ＜ 0． 01 水平差异显著。
WT． Wild-type;W8，W17，W18，W43． JsWＲKY1 transgenic T1 tobacco lines． * ，＊＊ indicate the
significant differences at P ＜ 0． 05 level and P ＜ 0． 01 level，respectively．
图 5 WT及 JsWＲKY转基因烟草中 POD、SOD和 APX的酶活
Fig． 5 The antioxidant enzyme activity of WT and JsWＲKY1 transgenic tobacco lines
WT． 野生型烟草;CK． 蛋白提取缓冲液;W8、W17、W18、W43．
JsWＲKY1 转基因烟草株系;A．葡萄座腔菌;B．串珠状赤霉菌;C．胶孢
炭疽菌;D．尖孢镰刀菌。
WT． Wild-type;CK． The blank control;W8，W17，W18，W43． The
JsWＲKY1 transgenic lines;A． B． dothidea;B． G． moniliformis;C． C．
gloeosporioides;D． F． oxysporum．
图 6 JsWＲKY1转基因烟草株系叶片总蛋白的体外抑菌活性
Fig． 6 Antifungal activity of the crude protein extract of
JsWＲKY1 transgenic tobacco lines
WT．野生型烟草;W8、W17、W18、W43． JsWＲKY1 转基因烟草株系。
WT． Wild-type;W8，W17，W18，W43． The JsWＲKY1 transgenic lines．
图 7 JsWＲKY1 转基因烟草株系增强对胶孢炭疽菌的抗性
Fig． 7 Ｒesistance of JsWＲKY1 transgenic tobacco lines
against C． gloeosporioides in vivo inoculation assay
2． 6 JsWＲKY1转基因烟草增强对胶孢炭疽菌的抗性
用胶孢炭疽菌侵染 JsWＲKY1 转基因烟草叶片
和野生型烟草叶片，接种 10 d 后，野生型烟草叶片
出现了严重的褪绿黄化，接种部位腐烂，而 4 个
JsWＲKY1 转基因烟草叶片接种后褪绿黄化现象并
不明显，接种部位只表现出轻微的腐烂，可见
JsWＲKY1 转基因烟草增强了对胶孢炭疽菌的抗性
(图 7)。
3 讨论与结论
在与病原微生物的长期斗争过程中植物形成了
复杂的防卫反应网络以应对病原菌的攻击。植物防
卫反应由相互联系的 2 个分支组成，一是病原相关
分子模式 (Pathogen-associated molecular pattern，
PAMP)激发的免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)，
二是效应物激发的免疫(Effector-triggered immunity，
ETI)［17］。PTI 以及 ETI 激活局部抗性及系统获得
抗性(Systemic acquired resistance，SAＲ)。WＲKY转
录因子是植物防卫反应相关转录因子网络中的一个
调控蛋白基因家族，主要参与植物免疫系统应对多
种不同的生物和非生物胁迫［18 － 19］。WＲKY 蛋白与
靶基因启动子区的顺式作用元件核心结构是 TT-
GAC(C /T)的 W-box 特异结合，即所有启动子中含
W-box 的基因都可能是 WＲKY 的靶基因，包括
WＲKY本身［20］。WＲKY 结构域由 4 股 β 折叠构
成，保守的 WＲKYGQK 残基对应于 N 端的 β 折叠
(Strand β-1)，能够进入 DNA 沟并与 DNA 上的 W
盒发生作用［21］。
已经明确 WＲKY转录因子家族是 PTI以及 ETI
的关键调控因子，正向或负向调控植物的防卫反应
和信号转导途径［18，22 － 23］。OsWＲKY13 通过激活水
杨酸(SA)的生物合成以及 SA反应相关基因的表达
同时抑制茉莉酸(JA)信号途径调控水稻对细菌病
害白叶枯病以及真菌病害稻瘟病的抗性［4，24］。Os-
WＲKY30 超表达的转基因水稻提高了对稻瘟病以及
纹枯病菌的抗性，抗性的提高与 JA生物合成相关基
因、PＲs基因的表达激活以及内源 JA积累的增强相
关［25］。本试验对漾濞大泡核桃的一个 WＲKY 转录
3 期 王国东等:漾濞大泡核桃 JsWＲKY1 过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性 161
因子基因 JsWＲKY1 的功能进行分析，JsWＲKY1 超表
达的转基因烟草株系中，几个逆境胁迫相关基因
CN、NADPH oxidasec、MYC和 PＲ1的转录水平明显上
调，暗示 JsWＲKY1正调控这些防卫相关基因的表达。
植物受病原物侵染过程中，活性氧是一类很重
要的信号分子，活性氧分子可以诱导植物对病原物
的抗性。但是，氧爆发时植物体内将会产生大量的
活性氧，过多的活性氧积累将会对植物产生毒害，并
可破坏植物细胞的正常代谢。本试验中，qＲT-PCＲ
结果显示 2 个编码 SOD的基因MnSOD以及 Cu /Zn-
SOD在几个 JsWＲKY1 转基因烟草株系中的表达水
平较野生型而言明显上升。此外，转基因株系的 3
种抗氧化酶酶活，即 SOD、APX、POD 在正常生长情
况下及接种胶孢炭疽菌接种后显著增强。显然，
JsWＲKY1 在烟草中过量表达不仅调控几个 SOD 基
因的转录水平，还激活了体内的 SOD、APX、POD 酶
活性。
目前已从模式植物拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)和水稻(Oryza sativa)中分离了大量 WＲKY 转
录因子。AtWＲKY3、AtWＲKY4、AtWＲKY33 作为正调
控因子对死体营养型真菌 Alternaria brassicicola以及
Botrytis cinerea具有抗性［26 － 27］。WＲKY 转录因子基
因家族的多个成员正调控水稻对稻瘟病菌、纹枯病
菌等的抗性［4，24 － 25，28］。在非模式植物中关于 WＲKY
转录因子调控植物抗病防卫反应的研究也越来越
多，如毛白杨(Populus tomentosa)PtoWＲKY60、毛果
杨(P． trichocarpa)PtrWＲKY73、麝香葡萄(Muscadin-
ia rotundifolia)MrWＲKY30 等 WＲKY 转录因子均正
调控植物的抗病防卫反应［29 － 31］。本试验中，
JsWＲKY转基因烟草叶片粗蛋白在体外能够抑制病
原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖
孢镰刀菌的菌丝生长，并且叶片接种试验结果也显
示 JsWＲKY转基因烟草对胶孢炭疽病的抗性明显增
强。上述试验无疑表明 JsWＲKY1 是漾濞大泡核桃
中参与应对胶孢炭疽菌防卫反应的重要调控因子。
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