全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 960~966　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0106960
收稿 2014-03-14　　修定 2014-06-03
资助 科技部支撑计划项目(2011BAD46B00)。
* 通讯作者(E-mail: diqiuliu@126.com; Tel: 0871-65920621)。
漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析
张南南, 陈朝银, 季博, 何华, 韩青, 葛锋, 刘迪秋*
昆明理工大学生命科学与技术学院, 昆明650500
摘要: WRKY转录因子普遍存在于植物体内, 在植物的抗病防御反应中起重要作用。本实验基于漾濞大泡核桃(Juglans
sigillata)中编码WRKY转录因子的EST序列设计引物, 采用快速扩增cDNA末端技术, 克隆得到一个新的WRKY基因的全长
cDNA序列, 命名为JsWRKY1 (KJ170895)。JsWRKY1的cDNA全长为1 012 bp, 含有564 bp的开放阅读框, 154 bp 5
-非翻译区以及294 bp的3-非翻译区, 编码具有187个氨基酸的蛋白质。JsWRKY1编码的氨基酸序列与已知植物WRKY家族
成员间的同源性和聚类分析表明JsWRKY1与来源于可可树(Theobroma cacao)和大豆(Glycine max)中的WRKY相似性较高,
属于IIc类WRKY。qRT-PCR分析结果显示, 信号分子水杨酸、茉莉酸、H2O2和乙烯处理可以不同程度地诱导漾濞大泡核
桃叶片中JsWRKY1的表达。此外, 接种胶孢炭疽菌后JsWRKY1的表达量迅速上升, 在接种后4 h时达到最高水平, 之后表达
量逐渐下降, 暗示JsWRKY1参与漾濞大泡核桃抗胶孢炭疽菌的防卫反应。
关键词: 漾濞大泡核桃; WRKY转录因子; 基因克隆; 胶孢炭疽菌; 防卫反应
Cloning and Expression Analysis of a WRKY Gene JsWRKY1 from Juglans
sigillata
ZHANG Nan-Nan, CHEN Chao-Yin, JI Bo, HE Hua, HAN Qing, GE Feng, LIU Di-Qiu*
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: The WRKY transcription factors are ubiquitous in plants and play important roles in the defense re-
sponses. A WRKY EST was isolated from Juglans sigillata, and the full-length cDNA of the EST was cloned
with the method of rapid amplifi cation of cDNA ends and named as JsWRKY1 (KJ170895). JsWRKY1 was
1 012 bp in length and contained an intact open reading frame (ORF) of 564 bp, a 154 bp 5′-untranslated region
(UTR), and a 294 bp 3′-UTR. The predicted protein of JsWRKY1 with 187 amino acid residues shared high
similarity with the WRKYs from Theobroma cacao and Glycine max. Moreover, the JsW RKY1 fell into the
group IIc of W RKYs through phyloge netic analysis. qRT-PCR analysis showed that the expression of JsWRKY1
was induced by salicylic acid, jasmonic acid, H2O2, and ethylene. Morever, JsWRKY1 was quickly induced after
inoculation with Colletorichum gl oeosporidies, and the highest transcription level was achieved at 4 h post in-
oculation, then its expression declined gradually. All the results of present study suggested that JsWRKY1 may
involve in defense response of J. sigillata against the C. gloeosporioides.
Key words: Juglans sigillata; WRKY transcription factor; gene cloning; Colletorichum gloeosporioides; de-
fense response
转录因子, 又称反式作用因子, 通过与特定的
顺式作用元件结合调控靶基因的表达, 进而参与
控制植物的各种生理生化反应。WRKY是植物体
内研究最多的转录因子之一, 由超基因家族编码,
每个成员都包含1到2个由约60个氨基酸残基组成
的WRKY结构域, 在WRKY结构域的N端具有7个
高度保守的氨基酸残基 , WRKYGQK (Ryu等
2006)。与WRKYGQK核心结构域相连的是一个
C2H2 (C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)或者C2HC (C-X7-C-
X23-H-X1-C)型锌指结构。根据所含WRKY结构域
的数量和锌指结构的类型, WRKY蛋白被分为三
大类, 第I类含有2个WRKY结构域以及C2H2型锌
指结构; 第II类含有1个WRKY结构域和C2H2型锌
指结构, 大多WRKY转录因子都属于这一类; 第III
类也含有1个WRKY结构域, 但所含的锌指结构为
C2HC型, 此类WRKY转录因子的成员较少(Eul-
gem等2000)。
张南南等: 漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析 961
WRKY转录因子通过与靶基因启动子区域中
名为W-box的特定DNA序列(T)(T)TGAC(C/T)结
合, 诱导或者抑制靶基因的表达。作为一类重要
的调控因子, WRKY转录因子也参与植物对病原
菌的防御反应(Hu等2012)。AtWRKY70在水杨酸
(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)介导
的信号传导途径中具有中心控制作用, 对受SA调
控的基因具有激活作用, 而对受JA调控的基因具
有抑制作用(Pi eterse和Van Loon 2004)。稻瘟病菌
(Magnaporthe grisea)侵染、物理损伤以及外源生
长素的处理均可诱导水稻(Oryza sativa) OsWRKY31
的表达, 在水稻中过量表达OsWRKY31增加了抗病
相关基因OsSci2 (subitilisin-chymotrypsin inhibitor)
和PBZ1 (a probenazole-inducible gene)的表达量并
增强了转基因植株对稻瘟病菌的抗性(Zhang等
2008)。拟南芥被死体营养型真菌Botrytis cinerea
和Alternaria brassicicola侵染以及SA、JA处理后,
AtWRKY33的表达量增加。与野生型相比 , At-
WRKY33功能缺失突变体对于B. cinerea和A. bras-
sicicola的抗性降低, 而AtWRKY33过表达植株对这
些病原菌的抗性则明显增强(Zheng等2006)。这些
研究表明WRKY转录因子在植物抵御真菌病害过
程中具有重要的调控作用。
核桃在中国有着悠久的栽培历史, 是经济价
值和社会效益极高的林木。随着核桃种植规模的
逐年上升, 核桃病虫害的发生越发严重, 给核桃的
种植和生产带来了很大的损失。其中由病原真菌
胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeosporioides)引起的
炭疽病是核桃的一种主要病害, 该病潜伏期长、
发病时间短、爆发性极强。炭疽病发病果实的果
皮上呈现出褐色或黑褐色的病斑, 中央下陷, 并伴
有黑色小点产生, 发病严重时, 果皮上病斑扩大并
连成片, 致使果实皮全部变黑, 还会致使内果皮腐
烂, 使核仁失去食用价值(王勇等2005; 赵立娟等
2013)。漾濞大泡核桃具有果大、壳薄、仁厚、味
香、含油率高等优点, 是云南省重要的经济林树
种之一, 对云南的核桃产业发展有重要的作用(杨
恩等2006)。在本文的前期研究中发现漾濞大泡核
桃对胶孢炭疽菌具有较强的抗性, 因此对胶孢炭
疽菌接种后的漾濞大泡核桃叶片进行了转录组测
序(相关数据未公开)。在序列分析中发现几个编
码WRKY转录因子的EST在接种后的叶片中表达
量上升, 为了深入研究WRKY转录因子参与漾濞
大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应机制, 本文对
其中一个WRKY的全长cDNA进行了克隆和表达
特性分析。
材料与方法
1 材料
植物材料漾濞大泡核桃(Juglans sigillata
Dode)购买自大理漾濞果艺核桃有限公司, 以铁核
桃为砧木的漾濞大泡核桃嫁接苗, 种于温室中培
养。实验所用胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeospo-
rioides)菌株由本实验室分离、鉴定并保存。
2 方法
2.1 样品处理
选取温室中生长状态良好, 有大量新生叶的
漾濞大泡核桃植株作为待处理材料, 首先在嫩叶
上远离叶脉的位置用砂纸磨去角质层, 处理面积
约1 cm2。用打孔器取相应大小生长良好的新鲜胶
孢炭疽菌菌丝体附于伤口处, 用保鲜膜将处理的
叶片包好保湿, 对照组叶片只进行受伤处理。然
后分别采集接种后和伤害处理后2、4、8、24、
48和72 h的叶片。分别用5 mmol·L-1 SA、100
μmol·L-1 JA、1 mmol·L-1乙烯(ethylene, ETH)和1
mmol·L-1 H2O2四种逆境胁迫相关信号分子处理漾
濞大泡核桃叶片, 处理方法与胶孢炭疽菌接种处
理方法相同, 分别收集处理6、12、24和48 h后的
叶片。所收集的样品经液氮速冻后于−80 ℃保存
备用。
2.2 RNA提取及mRNA分离
采用改良的异硫氰酸胍两步法(Liu等2006)提
取各样品中的总RNA。取适量胶孢炭疽菌接种后
2、4、8、24、48和72 h的漾濞大泡核桃叶片提取
总RNA, 从各RNA样品中取等量混匀, 并按照Nu-
cleoTrap® mRNA Midi Kit (Macherey-Nagel, Ger-
many)说明书从中分离mRNA, 以分离的mRNA为
模板合成RACE模板(Clontech, USA)。
依据测序结果中的EST序列, 设计5-RACE和
3 -RACE特异性引物。5 -RACE特异性引物为
5-TTCATCTTTGGTTAGGCGTTGAACTTGC-3,
3  - R A C E特异性引物为5  - G C T G C C C T G T-
植物生理学报962
TAGTTCAAATGGATGCT-3。RACE PCR产物经
TA克隆, 连接到pMD18-T (TaKaRa, Japan)载体中,
并将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑
选阳性克隆测序。
2.3 全长ORF的克隆以及生物信息学分析
通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的
bl2seq工具对5-RACE扩增序列、3-RACE扩增序
列与EST序列进行拼接, 并利用NCBI的ORF Finder
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找拼
接序列中的最大开放阅读框(open reading frame,
ORF)。根据拼接的全长cDNA序列设计扩增全长
ORF的特异引物并进行PCR扩增, 扩增产物经TA克
隆后测序。ORF扩增特异引物序列为: 5-TGTA-
AAACCTATTCGGACATTCTTC-3和5-ACCGAG-
GAGGGAGGCAGGT-3。采用BLAST在线工具分
析基因和蛋白质序列的同源性(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST)。信号肽序列预测由SignalP
4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)完成。
利用MEGA3软件进行多重序列比对和聚类分析。
借助ProtParam (http://www.au.expasy.org/tools/prot-
patam.html)在线分析工具完成理化性质的预测。
采用PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)在
线工具进行蛋白质的二级结构分析以及亚细胞定
位预测。蛋白质的三维结构分析由WISS-MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/)在线分析工具完成。
2.4 qRT-PCR
为了研究WRKY在漾濞大泡核桃受胶孢炭疽
菌侵染及信号分子处理后的表达特性, 本文采用
qRT-PCR (quantitative reverse transcription-PCR)分
析WRKY在漾濞大泡核桃叶片在SA、JA、ETH、
H2O2以及胶孢炭疽菌处理后不同时间段的表达水
平。以漾濞大泡核桃组氨酸3基因(JsHis3, Gen-
bank登录号KJ196384)作为内参基因。漾濞大泡核
桃WRKY基因特异引物为5 -CAAGGTAAGAT-
CAAGAAGATCAGGA-3 和5  -CTACGATG-
CCTTCATCTTTGGTTAG-3。内参基因JsHis3的
特异引物序列分别为5′-GATCGCACAGAGGTTG-
GTGTC-3′和5′-CGTCCGTGAAATTGCACAA-
GA-3。反应条件为: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃
1 min, 40个循环; 之后是熔解曲线分析。反应体
系和条件均参考GoTaq® 2-Step RT-qPCR System
(Promega, USA)。qRT-PCR每个反应均设置3次重
复, 以正常生长发育漾濞大泡核桃叶片中WRKY的
表达量为对照, 采用2-CT法计算WRKY在其他样品
中的相对表达水平。
实验结果
1 漾濞大泡核桃JsWRKY1全长cDNA的克隆
基于转录组测序所得漾濞大泡核桃编码WRKY
的EST序列(未公开), 通过5-RACE和3-RACE扩增
获得该EST的全长cDNA序列。RACE扩增结果如
图1-A所示, 测序分析显示5-RACE产物长657 bp,
3-RACE产物长656 bp。经过序列拼接获得WRKY
的全长cDNA, 序列长1 012 bp, 其包含一个564 bp
的ORF、154 bp的5-非翻译区(untranslated region,
UTR)以及294 bp的3-UTR, ORF编码一个具有187
个氨基酸的蛋白质。根据拼接的全长cDNA序列
设计特异性引物, 成功扩增出了710 bp的全长ORF
(图1-B)。后续的生物信息学分析表明克隆得到的
cDNA序列可编码WRKY蛋白, 将该基因命名为Js-
WRKY1, GenBank登录号为KJ170895。
图1 漾濞大泡核桃WRKY基因的RACE扩增产物(A)及其
全长ORF扩增产物(B)
Fig.1 The amplifi cation results of RACEs (A) and full-length
ORF of JsWRKY1 gene (B)
M: DL2000 marker; 1: 5′-RACE扩增产物; 2: 3′-RACE扩增产
物; 3: JsWRKY1基因全长ORF 的扩增产物。
2 序列同源性分析、多重序列比对以及进化树构建
核酸同源性分析表明漾濞大泡核桃JsWRKY1
的第469~758位核苷酸序列与山葡萄(Vitis amurensis)
VaWRKY45 (JQ728450.1)的第256~545位核苷酸序
列具有86%的同源性。BLASTp分析结果显示Js-
WRKY1所编码WRKY蛋白与可可树(Theobroma
cacao) TcWRKY75 (EOY02841.1)和大豆(Glycine
张南南等: 漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析 963
max) GmWRKY53 (NP_001237357.1)的序列同源
性较高, 分别为67%和60%。此外, 与上述两个
WRKY蛋白以及拟南芥AtWRKY45 (NP_186846.1)
的多重序列比对见图2, JsWRKY1包含一个保守的
WRKY结构域, 位于第114~120位氨基酸残基, 与
其相隔13个氨基酸, 即从134位开始存在一个C2H2
型锌指结构, 可见JsWRKY1属于WRKY蛋白家族
的第二大类。
Eulgem等(2000)基于AtWRKYs WRKY结构
域构建系统进化树, 并将第II类WRKY蛋白分为5
个亚类, 分别为IIa、IIb、IIc、IId和IIe。不同亚类
的WRKY蛋白中所包含的附加结构域的种类、数
量和位置各有特点。而且分类结果可能与WRKY
蛋白的功能有关, 比如仅存在于IIa、IIb亚类的由
大量疏水氨基酸组成的七肽重复区, 可以介导蛋
白间的二聚体化。为研究JsWRKY1的系统进化地
位, 选取了25个拟南芥WRKY蛋白构建系统进化树
(图3)。JsWRKY1与3个IIc类AtWRKYs聚为一支,
显示JsWRKY1编码的蛋白质属于IIc类WRKY。
3 JsWRKY1编码蛋白质的理化性质预测、信号肽
及潜在修饰位点分析
利用ProtParam在线工具预测JsWRKY1的理
化性质, 结果显示JsWRKY1的分子量约为21.3
kDa, 等电点约为9.23。该蛋白在酵母和大肠杆菌
中的半衰期分别大于20和10 h。SignalP 4.1分析结
果表明JsWRKY1中不存在信号肽。此外, Predict-
Protein分析显示该蛋白在植物细胞中定位于细胞
核, 可见JsWRKY1编码的蛋白质应为核内蛋白。
4 JsWRKY1编码蛋白质的二级结构及三维结构预测
根据PredictProtein分析结果, JsWRKY1蛋白
中不存在α-螺旋(H), β-折叠(E)和无规则卷曲(L)所
占百分比分别为16.58%和83.42%。其二级结构中
共包含5个可能的β-折叠, β1 (95~101)、β2 (113~
116)、β3 (131~134)、β4 (143~148)以及β5 (154~
160)。蛋白质的三级结构在很大程度上决定了蛋
白质的功能, 为了研究JsWRKY1的结构和功能之间
的关系, 以拟南芥AtWRKY4 (AAL13048.1) (1wj2)为
模板构建了JsWRKY1的三维模型, JsWRKY1与
A t W R K Y 4的氨基酸序列相似性为4 9 %。 J s -
WRKY1的三维结构模型如图4所示, 从距离N端较
远的位置开始, 有5条大小不一反向平行的β-折叠,
它们通过无规则卷曲连接在一起。图4中灰色锌
离子所对应的位置是由2个半胱氨酸和2个组氨酸
配位构成的JsWRKY1锌指结构的空间位置。
5 JsWRKY1表达特性分析
本实验采用qRT-PCR对JsWRKY1在漾濞大泡
核桃被胶孢炭疽菌侵染以及不同的外源信号分子
处理后表达量的变化进行了分析(图5)。胶孢炭疽
菌接种漾濞大泡核桃叶片后(图5-A), JsWRKY1的
表达量急剧上升, 在接种后4 h时达到最高水平, 约
为正常表达水平的4倍, 随后表达量逐渐降低, 到
48~72 h表达量略低于对照。SA (图5-B)、JA (图
5-C)以及H2O2 (图5-E)处理漾濞大泡核桃叶片均会
迅速诱导叶片中JsWRKY1的表达, 在处理后6~12 h
图2 JsWRKY1与几种植物WRKYs的多重序列比对
Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequence of JsWRKY1 and several plant WRKYs
植物生理学报964
内表达量达到最高水平。但在达到最大转录水平
后, 上述3种处理对JsWRKY1表达水平的影响有所
不同: SA处理(图5-B)后24 h JsWRKY1的表达量下
降至最低值, 随后再逐渐恢复至处理前水平; 而在
JA (图5-C)和H2O2 (图5-E)处理后, JsWRKY1的转录
水平逐渐下降, 至48 h时表达量接近处理前水平。
ETH处理(图5-D)后JsWRKY1表达量的变化呈现双
峰, 分别在6 h和24 h形成2个表达水平的峰值, 并在
接种后24 h 时达到最大值(约为对照的16倍), 48 h
时表达水平趋于处理前水平。综上所述, JsWRKY1
的表达受胶孢炭疽菌和逆境胁迫相关信号分子的
诱导, JsWRKY1可能参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽
菌的防卫反应。
讨　　论
WRKY是植物中一类重要的转录因子, 在植
图4 JsWRKY1的三维结构模型
Fig.4 The putative 3D structure of JsWRKY1
图中小球为锌离子。
图3 JsWRKY1与拟南芥WRKYs的进化树分析
Fig.3 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of JsWRKY1 and AtWRKYs
张南南等: 漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析 965
图5 JsWRKY1受SA (B)、JA (C)、ETH (D)、H2O2 (E)处理后和胶孢炭疽菌侵染(A)过程中的表达水平
Fig.5 Expression levels of JsWRKY1 after SA (B), JA (C), ETH (D) and H2O2 (E) treatment as well as C. gloeosporioides infec-
tion (A)
物的生长发育以及防卫反应中都有极其重要的作
用。漾濞大泡核桃抗逆性强, 是云南省重要的经
济树种和优良的种质资源。前期研究发现, 在胶
孢炭疽菌侵染漾濞大泡核桃过程中WRKY转录因
子的表达量明显上调。本文通过5-RACE以及3-
RACE从漾濞大泡核桃中克隆得到了一个新的
WRKY基因, JsWRKY1, 其编码的蛋白质序列与来
自可可树和大豆的WRKY蛋白相似性较高。Js-
WRKY1的N末端不存在信号肽序列, 同时亚细胞
定位预测结果显示JsWRKY1定位于细胞核。
WRKY转录因子包含1到2个WRKY结构域,
该结构域的N末端含有一个高度保守的WRK-
YGQK氨基酸序列, 与其相连的是1个C2H2或者
C2CH型锌指基序(Duan等2007)。采用核磁共振技
术研究AtWRKY4的结构发现其C端WRKY结构域
由4股β折叠构成, 其中β折叠的末端含有一个由保
守的半胱氨酸/组氨酸残基形成的锌结合口袋结
构。WRKYGQK序列存在于β-1链上, 并可以通过
扭曲进入DNA凹槽中, 从而与靶基因中的W-box相
互作用(Pandey和Somssich 2009)。本文克隆的Js-
WRKY1, 其编码的氨基酸序列中包含1个WRKY结
构域, 其后紧接1个C2H2型锌指结构, 并与拟南芥
AtWRKY4的三维结构高度相似。结构特征的高
度保守性暗示漾濞大泡核桃JsWRKY1可能与拟南
芥AtWRKY4一样, 具有调控靶基因表达的功能。
植物在生长发育过程中总是受到多种病害的
威胁, 病原物的侵染会诱导植物体内大量抗性相
关基因的表达, 而WRKY作为重要的抗病相关转
录因子, 在植物的抗病防御反应中起重要作用(黄
佳玲等 2012)。水稻OsWRKY89的表达量在JA处理
后以及紫外线损伤后明显增加, OsWRKY89超表达
的水稻不但对紫外线有较强的抗性, 对稻瘟病菌
的抗性也明显增加, 而OsWRKY89的RNAi突变株
对于稻瘟病菌的抗性明显降低(Wang等2007)。水
稻OsWRKY6的表达受白叶枯病原菌(Xanthomonas
oryzae)及SA的诱导, 进一步研究发现, OsWRKY6
是病原菌及SA诱导基因OsPR1a的转录激活因子;
将OsWRKY6转入拟南芥超表达, 转基因拟南芥对
黄单胞菌的抗性增强, 同时一些抗病相关基因, 如
PR1、NPR4 (NPR1-like gene 4)和葡聚糖酶基因的
表达量有所增加(Hwang等2011)。葡萄VvWRKY1
基因的表达受SA、H2O2或ETH处理的诱导, 而且
VvWRKY1超表达可以增强转基因烟草对病原真菌
Peronospora tabacina和Erysiphe cichoracearum的
抗性增强(Marchive等2007)。本文中, qRT-PCR分
析表明在接种胶孢炭疽菌后JsWRKY1在漾濞大泡
植物生理学报966
核桃中的表达量迅速上升, 接种后4 h表达量增加
至正常水平的4倍, 暗示JsWRKY1参与漾濞大泡核
桃应对胶孢炭疽菌入侵的防卫反应。同时Js -
WRKY1的转录水平明显受到信号分子SA、JA、
H2O2以及ETH的上调诱导, 表明该基因可能通过
这些信号通路介导漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌或
其他逆境胁迫的抗性。
WRKY作为植物体内重要的抗病相关转录因
子, 通过调控植物体内的病程相关蛋白等抗病相
关基因的表达提高植物的抗病性, 在植物抵御病
原菌侵染的防卫反应中扮演着重要角色。本文研
究结果表明, JsWRKY1可能参与漾濞大泡核桃对胶
孢炭疽菌的防卫反应, 因此有必要对其功能以及
生物学活性进行深入分析。接下来, 我们将验证
JsWRKY1的反式激活能力, 并采用反向遗传学的
方法揭示JsWRKY1的生物学功能。
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