全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2013 年
收稿日期：2012－10－25
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻 11107010－2－7）
作者简介：蒋 妮（1979－），女，广西来宾人，助理研究员，硕士，主要从事药用植物病虫害防治研究工作，（电话）18978872895（电子信箱）
jiangni292＠126．com；通讯作者，白隆华，研究员，（电子信箱）whitefh2008＠126．com。
第 52卷第 16 期
2013年 8 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 52 No.16
Aug．，2013
苦玄参（Picria felterrae Lour．）又名苦草、鱼胆
草、四环素草、蛇总管，为玄参科苦玄参属植物，以
全草入药，是《中华人民共和国药典》收载品种 ［1］，主
要分布于广西、广东及云南等地，在广西民间作药
用已有 200多年的历史［2］。
苦玄参作为广西大宗、道地药材，是广西梧州
制药（集团）股份有限公司生产的妇炎净胶囊的主
要原料药材，也是广西多家制药企业生产的炎肿化
毒片、炎见宁片、万通炎康片、维威消炎灵等多种中
成药的原料药材［3］。随着医药市场需求的逐年增加，
苦玄参在广西梧州地区广泛栽培。 调查发现，近年
来苦玄参褐斑病在梧州各栽培区普遍发生，造成叶
斑、叶片枯黄，严重者叶片全部卷缩，植株枯死。 国
内外关于苦玄参病害的研究尚未见报道，褐斑病为
首次报道的苦玄参病害。 明确苦玄参褐斑病病原菌
对于该病害的预防与控制具有重要意义。
环境因素对病害的发生流行起着重要作用，就
光照与苦玄参褐斑病的关系进行探讨，可以阐明光
苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素分析
蒋 妮 1，白隆华 1，董青松 1，林伟国 2，黄宇声 2，余 生 2
（1．广西药用植物园 ／广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023；
2．广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000）
摘要：为明确近年来引起广西梧州地区苦玄参（Picria felterrae Lour．）褐斑病的病原菌种类及致病因素，
依据柯赫氏法则进行了致病性测定和病原菌验证，通过形态学观察、rDNA－ITS 序列分析确定病原菌；通
过对不同光照条件下病情调查，分析光照对该病害发生的影响。结果表明，病原菌形态特征与［Alternaria
porri（ELL．）Ciferri］一致，其 rDNA－ITS 序列与 GenBank 中［Alternaria porri（ELL．）Ciferri］相似性达 99％；
强光利于病原菌菌丝生长、 孢子产生及萌发。 可见梧州地区苦玄参褐斑病病原菌为葱链格菌［Alternaria
porri（ELL．）Ciferri］；光照是诱发苦玄参褐斑病的主要致病因素。
关键词：苦玄参；褐斑病；病原鉴定； 致病因素
中图分类号：S482．1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2013）16－3836-03
Pathogen Identification of Picria felterrae Brown Spot and Analysis on the
Pathogenic Factor
JIANG Ni1，BAI Long－hua1，DONG Qing－song1，LIN Wei－guo2，HUANG Yu－sheng2，YU Sheng2
（1．Guangxi Botanical Garden of Medicine Plant， Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement，
Nanning 530023，China；2．Wuzhou Pharmaceutical Group Co．，Ltd，Wuzhou 543000，Guangxi，China）
Abstract： The study aimed to identify the organism that leads to the Picria felterrae brown spot in Wuzhou and to analyze
the pathogenic factor． The fungus was isolated from infected plants according to Koch’s rule． The identification of the
pathogen was carried out mainly based on the morphological characters and molecular analysis of internal transcribed spacer
（ITS） sequences； the investigation of disease was done under different illumination intensity． The morphological characters of
the pathogenic isolate were in agreement with Alternaria porri （ELL．） Ciferri． When compared with sequences in GenBank，
the ITS sequence of the pathogen was 99％ similar to that of A． porri； the disease was serious in the light； the illumination
was beneficial for mucelium growth， spore production and germination． The pathogen causing P. felterrae brown spot in
Wuzhou was identified as A． porri； illumination was the main pathogenic factor of the disease．
Key words： Picria felterrae Lour．； brown spot； pathogen identification； pathogenic factor
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.16.040
第 16 期
表 1 苦玄参褐斑病分级标准
病级
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
代表值
0
1
2
3
4
分级标准
叶片无病斑
病斑面积占整个叶面积的 5%以下
病斑面积占整个叶面积的 5%～30%
病斑面积占整个叶面积的 30%～50%
病斑面积占整个叶面积的 50%以上
照在该病害的发生中的作用，以指导生产。
1 材料和方法
1．1 病菌采样与分离、纯化
苦玄参褐斑病典型病叶采自广西梧州市岭角
镇武烈村。病原菌的分离及纯化参照文献［4］。采集
的病叶用清水洗净，剪取病叶组织（边长 4～5 mm 的
正方形）， 用 75％的乙醇消毒 2～3 s，0．1％氯化汞消
毒 2 min， 无菌水冲洗 3 遍， 置于灭菌滤纸上吸干
水，将病叶组织接种在马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培
养基上，26 ℃恒温培养 4 d，对分离物归类、编号。 纯
化培养采用单孢分离法纯化产孢真菌，采用多次挑
取菌落边缘菌丝转皿纯化不产孢真菌，纯化后的真
菌转管保存。
1．2 致病性测定［4］
将纯化菌株接种至 PDA 琼脂培养基，在 28 ℃、
相对湿度 65％霉菌培养箱内培养 5 d， 用打孔器制
备直径 9 mm 的菌饼。 用无菌接种针在健康的离体
苦玄参叶片上刺成面积约为 1 cm2的伤口， 用接种
铲将菌饼接至伤口， 保湿培养 3～4 d， 观察发病情
况。 根据柯赫氏法则，对发病叶片病菌进行再分离，
显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株
相同。 以接种 PDA培养基作为对照，在室温（20～25
℃）下保湿培养 5 d，记录发病情况。
1．3 形态学鉴定
将致病菌株移至 PDA 平板上 28 ℃下培养，玻
片培养法观察，记载病原菌的形态特征，以病原菌
菌落形态、病害症状为依据鉴定病原菌种属［4］。
1．4 核糖体 rDNA－ITS序列分析
采用 SDS法提取病原菌株的基因组 DNA［5］。 采
用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物 ITS4
（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 和 ITS5 （5′-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海捷瑞生
物工程有限公司合成）扩增该菌的 rDNA－ITS 序列。
扩增产物的纯化和测序委托北京诺赛基因组研究
中心有限公司完成，将得到的序列在 GenBank 中进
行同源性比较［6］。
1．5 光照对病害的影响
选择除光照条件不同外，土壤、栽培管理等其
他条件均一致的栽培地， 采用 LI－1400型便携式光
量子辐射计分别测定各栽培地的光照强度。 对不同
光照条件下的苦玄参进行发病情况调查，每地块随
机调查 5 个点，每个点查 20 株，每株调查 10 张叶
片，调查叶片病级情况（分级标准见表 1），统计发病
株数及病情指数［7］。
病情指数＝（各级病级代表值×该病级病叶数） ／
（调查叶片数×发病最重级代表值）×100。
2 结果和分析
2．1 病害症状
苦玄参褐斑病在广西梧州始于 5 月初，苗期可
见症状发生，但为害不严重。 6月下旬至 8月是苦玄
参的田间生长旺期，也是病害发生高峰期。 多从靠
近心叶的 2～3 片叶片开始发病，受害叶片初期病部
呈水渍状淡黄小点，病斑不断扩大，形成不规则黄
褐色斑块，大小为 0．2～0．4 cm×0．5～0．8 cm，病健交界
处为紫褐色（图 1a）。 天气或环境潮湿时，病叶呈水
渍状；天气或环境干燥时病斑穿孔。 后期病斑连片，
病叶卷缩，呈火烧状。
2．2 病原菌鉴定
2．2．1 病原菌分离、纯化 患褐斑病苦玄参组织 26
℃恒温培养 3～4 d 后长出菌落， 共分离到 5 株真菌
菌株。
2．2．2 致病性测定 将分离所得的 5 株菌株室内
接种至健康的离体苦玄参叶片上保湿培养 5 d，仅
K－1－2 菌株接种的发病（图 1a），其他未发病。 发病
叶片表现出明显的褐色水渍状斑点，对病叶进行病
菌再分离接种，获得与原分离菌株一致的菌株。 根
据柯赫氏法则，确定试验中分离的 K－1－2 菌株为苦
玄参褐斑病的病原菌。
2．2．3 病原菌的形态特征 菌株 K－1－2 在 PDA 琼
脂培养基上的菌落呈圆形，有同心轮纹（图 1b），初
期菌丝白色，6～7 d 后呈灰白色， 菌丝颜色逐渐加
深，从平皿背面观察到培养基的颜色逐渐加深至黑
色。 显微镜下观察， 分生孢子梗单生或 5～10 个簇
生，淡褐色有隔膜 2～3 个，不分枝或不规则稀疏分
枝， 大小为 30～100 μm×4～9 μm， 其上着生分生孢
子。 分生孢子褐色，常单生，直或略弯，倒棍棒状，或
孢子本体椭圆形，至喙部（嘴胞）渐细，分生孢子具
纵横隔膜 5～15 个，纵隔膜 1～6 个（图 1c），大小为
6～130 μm×15～20 μm，最长的可达 300 μm，喙部直
或弯曲，具隔膜 0～7 个，大小 45～432 μm×2～4 μm。
根据病原菌上述形态特征，参照文献［8，9］，发现符
合半知菌亚门链格孢属葱链格孢 ［Alternaria porri
（ELL．）Ciferri］的菌落和孢子特征，初步鉴定病原菌
蒋 妮等：苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素分析 3837
湖 北 农 业 科 学 2013 年
（责任编辑 陈 焰）
2．3 光照强度对病害发生的影响
对不同光照条件下的苦玄参发病情况调查结
果（表 2）表明，苦玄参褐斑病随着光照强度的增加
而加重。 观察发现，全光照环境中种植的苦玄参，叶
片病斑多、皱缩，植株较细小，分蘖不旺盛，生长后
期不封行；设有一层遮阳网栽培的苦玄参，与不遮
阳相比，发病率及病情指数均明显降低；在荫蔽的
竹林边，苦玄参植株生长旺盛，茎秆粗壮，叶片厚且
浓绿，生长后期封行。 说明强光利于病原菌菌丝生
长、孢子产生及萌发，光照过强是诱发苦玄参褐斑
病发生的重要因素，光照强、温度高、湿度大极易造
成褐斑病流行。
3 小结与讨论
链格孢属（Alternaria）真菌能侵染多种植物引
起叶斑病，是植物叶部病害常见病原菌［10，11］。本研究
在传统形态学鉴定的基础上，通过对苦玄参褐斑病
病原菌的 rDNA－ITS 进行分析比对， 从分子生物学
水平上进一步明确了葱链格孢为苦玄参褐斑病的
病原真菌。 苦玄参是葱链格孢的新记录寄主。
苦玄参生长在热带、亚热带丘陵、山谷的雨林
或季节性雨林下，是一种喜温暖湿润耐阴的植物［12］。
近年来大面积扩植，很多直接种植在水田改的旱地
里，日照时数及强度均大大增加，田间苦玄参褐斑
病发生严重。 本研究结果表明，光照是该病害的重
要致病因子，建议在选择栽培地的时候重视遮阴条
件，最好选择在自然荫蔽环境下种植（如林下），不
仅满足遮阴条件而且较为阴凉、通透，不利于病害
的流行。
参考文献：
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1 CTACCTGATC GAGGTCAGAG TGTAAAAATG TACTTTTTGG ACGTCGTCGT
51 TATGAGTGCA AAGCGCGAGA TGTACTGCGC TCCGAAATCA ATACGCCGGC
101 TGCCAATTGT TTTGAGGCGA GTCTGCGCGC AGAGGCGAGA CAAACACCCA
151 ACACCAAGCA GAGCTTGAAG GTACAAATGA CGCTCGAACA GGCATGCCCC
201 ATGGAATACC AAGGGGCGCA ATGTGCGTTC AAAGATTCGA TGATTCACTG
251 AATTCTGCAA TTCACACTAC TTATCGCATT TCGCTGCGTT CTTCATCGAT
301 GCCAGAACCA AGAGATCCGT TGTTGAAAGT TGTAACTATT AAGTTTTGTC
351 AGACGCTGAT TGCAACTACA AAGGGTTTAA ATGTGTCCAA TCGGCGGGCG
401 GACCCGCCGA GGAAACGAAG GTACTCAAAA GACATGGGTA AGAGATAGCA
451 GGCGAAGCCT ACAACTCTAG GTAATGATCC TTCCGCAGGT
图 2 病原菌 rDNA-ITS 片段序列
表 2 不同光照条件下苦玄参褐斑病的发生情况
栽培条件
全光照
一层遮阳网覆盖
荫蔽竹林边
正午光照强度//μmol/（m2·s）
220
126
94
发病率//%
47.6
32.5
18.5
病情指数
36.3
20.8
9.6
为葱链格孢。
2．2．4 病原菌核糖体 DNA－ITS 序列分析 采用通
用引物 ITS1 ／ ITS4 对苦玄参褐斑病病原菌菌株的
rDNA－ITS序列进行 PCR 扩增。 扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳检测， 得到 1 个大小约为 500 bp 的片段；
经序列测定确定该片段全长 451 bp（图 2），1～51 bp
为部分 18 S rDNA，52～201 bp 为 ITS1，202～351 bp
为 5．8 S rDNA，352～401 bp 为 ITS4，402～451 bp 为
部分 5．8 S rDNA。 将上述测序结果在 GenBank 进行
同源性分析 ， 得知该病原菌株与 Alternaria porri
（ELL．）Ciferri的同源性达 99％。结合形态鉴定，确定
该病原菌为 Alternaria porri（ELL．）Ciferri。
a．病叶 b．菌落 c．分生孢子
图 1 苦玄参染褐斑病症状及病原菌形态
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