全 文 ：＊通讯作者
收稿日期:2006-01-24;修回日期:2006-06-12
基金项目:国家自然科学基金项目(30471230)
作者简介:宋卫玲(1979- ),女 , 河南新乡人 ,在读硕士研究
生.
文章编号:1673-5021(2006)05-0038-04
苜蓿褐斑病接种方法研究
宋卫玲 ,袁庆华＊
(中国农业科学院畜牧研究所 ,北京 100094)
摘要:以苜蓿假盘菌为接种菌源 ,对 3 个不同抗性的苜蓿品种(即伊鲁瑰斯 、沙湾和泾阳)采用3 种活体整株接种
方法 ,即接种盘倒扣接种法 、活体病株覆盖接种法和孢子悬浮液喷雾接种法 , 进行比较 , 以筛选出稳定 、可靠 、操作简
便 、发病速度较快的接种方法。结果表明 , 病株覆盖接种和孢子悬浮液喷雾接种为较理想的接种方法 , 可以比较准
确 、快速的鉴定出品种及单株的抗病性 , 其中孢子悬浮液最佳缓冲液组成为:0.5%吐温-20+4.5%葡萄糖+9mg/ L
萘乙酸+1g/ L菌落。
关键词:苜蓿;褐斑病;接种方法
中图分类号:S435.4 文献标识码:A
苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌(Pseudopeziz a
med icaginis)引致的叶部病害 , 是我国苜蓿的重要
病害之一 , 严重影响苜蓿的产量和品质[ 1] 。该病在
苜蓿的整个生育期都可发生 ,苗期受害尤为严重 。
鉴定和评价苜蓿对褐斑病的抗病性 ,是培育和利用
抗病品种防治苜蓿褐斑病的基础。目前 ,在苜蓿褐
斑病抗性鉴定上美国研究者提出了一套接种和鉴定
方法 ,但此法实用范围窄 ,不适于大面积田间接种鉴
定和评价 。虽然国内外许多学者对苜蓿褐斑病的抗
病性 、病原菌的致病性进行了研究[ 1 ～ 6 , 8 ～ 10] ,但所使
用的接种方法 、病情评价标准均不相同[ 2 , 4] ,各有优
缺点 ,很难对品种的抗病性以及病菌的致病性进行
比较 。本研究的目的是为了寻找出一套快速 、准确 、
操作简单的苜蓿褐斑病的接种方法 ,用于苜蓿抗病
品种的筛选和鉴定 ,以加快苜蓿褐斑病抗性鉴定及
育种工作的进程 。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试苜蓿材料为美国引进的伊鲁瑰斯(Med i-
cago sat iva L.cv.Iroquois)及国内的沙湾(M.sa-
tiva L.cv.Shaw an)和泾阳(M.sat iva L.cv.
Jingyang)3个品种 ,均由中国农科院畜牧研究所提
供。供试菌种苜蓿假盘菌是从本所保定苜蓿上通过
V8琼脂培养基分离培养获得 。
1.2 幼苗培育
从 3个品种中分别挑选出籽粒饱满 、呈黄褐色
的种子约 100粒 , 种子经 0.1%升汞消毒 3min , 用
灭菌去离子水冲洗 4次 , 然后放在消毒培养皿内的
滤纸上 , 加适量的灭菌去离子水以保持种子吸水膨
胀 ,然后放入 20℃的生长箱内发芽 2d。待幼根长到
1cm 长时 ,再将幼苗移栽到装有草碳和泥土(比例为
2∶1)的育苗钵内(10cm ×10cm),每钵 10株 ,每个
品种 100盆。在温室内培育 ,温度为 15 ～ 25℃, 40d
后进行接种实验。
1.3 接种方法
1.3.1 接种盘倒扣接种法
参照袁庆华的方法[ 3] ,并做适当改动。将从田
间采集的具成熟子囊盘的苜蓿病叶在无菌水中清洗
2次 ,并按一定的间隔平铺在白瓷盘内的消毒双层
滤纸上 ,叶面朝上 ,白瓷盘大小 30cm ×40cm 。在病
叶上滴加灭菌水 ,然后用干净的塑料薄膜将平盘密
封上 ,放入 5℃的生长箱内保湿 24h ,使叶片充分吸
水 ,子囊盘膨胀。幼苗接种前进行二种处理:(1)在
苜蓿苗上喷洒 0.5%吐温-20+0.1%葡萄糖的混
合液;(2)喷洒去离子水 。然后将保湿后的接种源
(装有病叶的瓷盘)倒扣在高 60cm 的梯形架上 ,下
面放入处理后的苜蓿幼苗 ,用保鲜膜将整个梯形架
密封起来 ,以防止子囊孢子向外扩散 , 并保持湿度。
接种温度为 20 ～ 25℃,相对湿度 100%,接种期间每
隔 5 ～ 8h移动一次接种苗 ,以使接种均匀一致。接
种 48h后撤掉接种盘 ,继续保湿 24h 。然后在温室
内进行正常管理 ,接种后 14d进行病情调查 ,各品种
每个处理 3盆 。
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第 28 卷 第 5 期
Vol.28 No.5
中 国 草 地 学 报
Chinese Journal of G ra ssland
2006 年 9 月
Sept.2006
1.3.2 病株覆盖接种法
本实验在温室内进行 ,温室温度为 20 ～ 25℃。
从田间取发病极严重的苜蓿枝条和病叶[ 7] (发病率
达 100%),均匀地覆盖在接种的苜蓿幼苗上 ,接种
源与幼苗的间距为 10cm ,并用保鲜膜将幼苗的四周
密闭 ,在接种源上不断洒水 ,以保持足够的湿度(相
对湿度 100%),并补充正常的光照 ,接种 3d后移去
接种源 ,继续保湿 24h 。然后在温室内进行正常管
理 ,接种后 14d进行病情调查 ,每个品种 3个重复 。
1.3.3 孢子悬浮液喷雾接种法
用3种不同的缓冲液将假盘菌稀释成不同浓度 ,
即0.5g/L 、1g/L 和 2g/L。3种缓冲液的配方如下:
(1)0.5%吐温-20 、4.5%葡萄糖 、9mg/L 萘乙酸;
(2)1g/ L KH2 PO 4 、1 g/ L KNO 3 、0.5g/L MgSO4 ·
7H2O 、0.2g/L葡萄糖 、0.5g/ L KCl、0.2g/L蔗糖;(3)
1.1 g/L KH2PO4 、0.4g/ L MgSO4 ·7H2O 、1.6g/L
KCl、5.9g/ L Ca(NO3)2 、0.2mg/L ZnSO4 、 0.2mg/L
MnSO4 、2.0g/ L葡萄糖。以上三种缓冲液均用去离
子水配置 。将配制好的孢子悬浮液用喉头喷雾器均
匀地喷洒在植株上 , 喷洒去离子水作为空白对照 。
接种后用保鲜膜将供试材料密封在一个梯形架内 ,
保持 100%相对湿度 ,温度 20 ～ 25℃。保湿 48h后 ,
撤掉梯形架。在温室内进行正常管理 ,接种 14d 后
进行病情评价。
1.4 病情评价
以上接种方法的病情评价均采用统一的分级标
准。病情分级标准为:0级:无病斑;1级:1 ～ 3个病
斑;2级:4 ～ 6个病斑;3 级:7 ～ 10个病斑;4 级:11
～ 15个病斑;5级:16个以上病斑。
病情指数计算公式如下:
病情指数=(各级病叶数×该级代表值)总叶片数×最高级代表值 ×100%
2 结果与分析
2.1 接种方法的比较
从表 1中可以看出 , 3 种接种方法都可引起苜
蓿褐斑病的发生。接种盘倒扣法在 3个苜蓿品种上
的病情指数 ,处理 1高于处理 2;说明接种前在苜蓿
幼苗上喷洒 0.5%吐温-20+0.1%葡萄糖的混合
液可促进病菌与幼苗的接触 ,提高接种的成功率。
接种混合液中吐温-20的浓度不宜过大 ,以免使苜
蓿叶片变黄脱落 ,应以每 10 株喷洒 5ml 混合液为
宜。
对 3种接种方法引起的病害严重度(病情指数)
进行方差分析 ,处理间(接种方法)病害严重度达到
显著水平(P <0.05),进一步采用最小显著差(LSD)
法测验 ,在 3个品种中除伊鲁瑰斯外 ,病株覆盖接种
法和孢子喷雾接种法间无显著差异 ,这两种接种方
法引起的病害严重度均高于接种盘倒扣法(表 1)。
在苜蓿抗褐斑病种质材料的筛选上可使用以上 3种
接种方法 ,其中病株覆盖接种法和孢子喷雾接种法
效果优于接种盘倒扣法 。
表 1 3 种不同接种方法的比较
Table 1 Comparisons of differ methods on disease index in alfalfa
苜蓿品种
Alfalfa variet ies
接种方法
Inocu lation meth ods
接种盘倒扣接种
Inverse plate of inoculat ion
处理 1
Disposal 1
处理 2
Disposal 2
病株覆盖接种
Sowing fungu s plan ts
孢子喷雾＊
Spore sp raying
伊鲁瑰斯
M.sat iva L.cv.Iroquois
12.50b 10.52b c 18.06a 12.36b
沙湾
M.sat iva L.cv.Shaw an
22.43b 12.98c 27.0a 30.03a
泾阳
M.sat iva L.cv.Jingyang
15.52b 11.69c 20.41a 20.25a
注:孢子喷雾法为缓冲液 1 ,浓度为 1g/ L 。
Note:The spore su spension is buf fer 1 , concent ration is 1 g/ L.
2.2 孢子悬浮液接种效果的比较
利用 3种缓冲液分别配制 3种孢子浓度进行喷
雾接种时 ,缓冲液 3 配制的孢子悬浮液喷雾接种未
引起病害的发生 ,说明此缓冲液不适宜做为假盘菌
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宋卫玲 袁庆华 苜蓿褐斑病接种方法研究
的孢子悬浮液;而缓冲液 1 和缓冲液 2均引起病害
的发生(表 2),缓冲液 1接种后效果优于缓冲液 2。
在同一孢子浓度条件下 ,用缓冲液 1与缓冲液 2 喷
雾接种时 ,病情指数之间无显著差异。用不同孢子
浓度接种时 ,孢子浓度为 0.5g/L 病情发生相对较
轻;当孢子浓度为 1g/ L 和 2g/L 病情发生较严重 。
孢子浓度对不同苜蓿品种的病情影响较大 ,从表 2
中可以看出 ,沙湾和泾阳的发病情况受孢子浓度影
响较大 , 0.5 g/ L 与 1 g/ L 和 2 g/ L 浓度间差异显
著。根据以上实验结果 ,利用孢子悬浮液接种时应
选择 1号缓冲液 ,接种浓度为 1g/L 的菌种。
表 2 孢子悬浮液接种效果的比较
Table 2 Compare of spore suspension on disease index in alfalfa
苜蓿品种
Alfalfa variet ies
孢子悬浮液浓度
Concent rat ion of spore suspension
0.5 g/ L 1 g/ L 2 g/ L
缓冲
液 1
Buffer 1
缓冲
液 2
Bu ffer 2
缓冲
液 1
Buf fer 1
缓冲
液 2
Buf fer 2
缓冲
液 1
Bu ffer 1
缓冲
液 2
Bu ffer 2
伊鲁瑰斯
M.sat iva L.cv.Iroquois
10.51abc 10.87abc 12.36ab 12.95ab 13.62a 14.35a
沙湾
M.sat iva L.cv.Shaw an
12.01c 13.00c 30.03a 22.76ab 28.68a 25.92ab
泾阳
M.sa tiva L.cv.Jin gy ang
11.12bc 11.20b c 20.25a 15.33ab 23.69a 20.19a
3 小结与讨论
3.1 在本试验采用的 3种接种方法中 ,病株覆盖接
种法和孢子悬浮液喷雾法得到的结果是比较理想
的 ,而且与袁庆华[ 3] 筛选抗性材料结果相一致 。孢
子悬浮液喷雾法操作简单易行 ,发病迅速 ,可用于大
批量筛选 。操作中需注意的是:挑选成熟的菌落作
为接种源 ,洗干净后用于制备悬浮液;喷雾要均匀 ,
使用喉头喷雾器可得到理想效果。
用病株覆盖法接种受到时间的限制 ,在北方苜
蓿褐斑病大面积发生是在 9月中旬左右 ,无法在其
他时间进行接种筛选;从田间取得的病株需去除其
他病害的叶片才能用来接种 ,否则会使供试苜蓿材
料染上其他病害 ,影响病情评价和抗病性鉴定;覆盖
病株的厚度不宜太大 ,以阳光能透过上层覆盖物照
射到植株为宜。如果操作得当 ,采用该方法将取得
理想的效果。
3.2 倒扣接种盘法操作简单 ,国内外已有不少学者
采用此方法 ,但笔者在实践中发现 ,使用该方法成功
的几率很低 ,存在很大的不确定性因素。在接种盘
上摆放的带病叶片容易受细菌感染 ,使孢子失去活
性 ,无法弹射;孢子弹射到叶片上后 ,如果条件不适
宜亦不能萌发 ,采用处理 1可以促进孢子萌发 ,但效
果仍不理想。
3.3 笔者认为在苜蓿抗病性种质材料筛选中 ,可以
使用离体叶接种[ 5] 和活体整株接种结合的方法进
行。在供试材料筛选初期 ,可以采用孢子悬浮液喷
雾法进行大批量的田间接种筛选 ,然后再用孢子弹
射法进行室内反复多次的精确筛选 ,直到筛选出可
以用来育种的理想材料。同时 ,本试验所采用的病
株覆盖接种法和孢子喷雾接种法可运用于苜蓿锈
病 、白粉病和霜霉病的抗性筛选及鉴定 ,以及苜蓿抗
多种病害的种质材料筛选。
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Study on Inoculation Methods of Common Leaf Spot in Alfalfa
SONG Wei-ling , YUAN Qing-hua
(I nst itute o f Animal Science , CAAS , Bei j ing 100094 , China)
Abstract:Three methods of w ho le alive plant inoculation (inve rse plate o f inoculation , sow ing fungus
plants , spore spraying)were studied to identify alfalfa resistance to common leaf spo t.Three varie ties of
alfalfa(Med icago sativa L.cv.Iroquois , M.sat iva L.cv.Shaw an , M.sativa L .cv.Jingyang)w ith
known dif ference in resistance to P.medicaginis were inocula ted w ith Pseudopez iza med icaginis.The re-
sults showed that spore suspension spray ing is the most stability and mo re quick one of the w hole plant in-
oculation methods.The me thods can quickly , well and truly screened the variet ies of alfalfa resistance.
The best spo re suspension is composed o f 0.5%Tw een-20 +4.5%D-Glucose+9mg/L 1-aphthy lacetic
acid +1g/L spo re.
Key words:Alfalfa ;Common leaf spo t;Inoculation methods
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宋卫玲 袁庆华 苜蓿褐斑病接种方法研究